Single-cell RNA 염기서열분석을 위한 Zebrafish 유충의 장 분리

요약

여기에서는 단세포 RNA 염기서열 분석을 위해 수정 후 5일에 제브라피시 유충에서 장을 분리하는 방법을 설명합니다.

초록

위장관(GI)은 생명에 필수적인 다양한 기능을 수행합니다. 발달에 영향을 미치는 선천적 결함은 장 신경근 장애로 이어질 수 있으며, 이는 위장 발달 및 기능 장애의 기저에 있는 분자 메커니즘을 이해하는 것이 중요하다는 점을 강조합니다. 이 연구에서는 수정 후 5일에 제브라피시 유충에서 장을 분리하여 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq) 분석에 사용할 수 있는 살아 있는 생존 가능한 세포를 얻는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 제브라피시 장의 수동 해부 후 파파인과의 효소 해리를 기반으로 합니다. 그 후, 세포를 형광 활성화 세포 분류에 제출하고 scRNA-seq를 위해 생존 가능한 세포를 수집합니다. 이 방법을 통해 상피, 기질, 혈액, 근육 및 면역 세포와 장 신경 세포 및 신경교세포를 포함한 다양한 장 세포 유형을 성공적으로 식별할 수 있었습니다. 따라서 제브라피시를 사용하여 건강과 질병에서 위장관의 구성을 연구하는 데 귀중한 자료라고 생각합니다.

서문

위장관(GI)은 전반적인 건강과 웰빙에 중요한 역할을 하는 복잡한 시스템입니다. 그것은 영양소의 소화 및 흡수뿐만 아니라 노^{폐물 1,2}의 제거를 담당합니다. 위장관은 상피세포, 평활근세포, 면역세포, 장신경계(ENS) 등 여러 세포 유형으로 구성되어 있으며, 이들은 서로 긴밀하게 소통하여 적절한 장 기능을 조절하고 유지합니다 ^3,4,5. 위장관 발달의 결함은 영양소 흡수, 미생물군 구성, 장-뇌 축 및 ENS와 같은 다양한 측면에 광범위한 영향을 미칠 수 있으며, 히르슈스프룽 병(Hirschsprung disease) 및 만성 장 가성 폐쇄(Chronic intestinal pseudo-obstruction)와 같은 여러 장 신경근 장애를 유발할 수 있습니다 ^6,7. 이러한 장애는 Cajal의 간질 세포, 평활근 세포 및 ENS ^6,8,9와 같은 다양한 주요 세포의 변화로 인한 심각한 장 운동성 장애를 특징으로 합니다. 그러나 위장 발달과 기능 장애의 기저에 있는 분자 메커니즘은 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다.

제브라피쉬는 빠른 배아 발달, 배아 및 유충 단계의 투명성, 유전적 다루기 쉬움으로 인해 위장 발달 및 기능 장애를 연구하는 데 귀중한 모델 유기체입니다 10,11,12,13,14. 형광 단백질을 발현하는 수많은 형질전환 제브라피시 계통을 사용할 수 있습니다. 이러한 계통의 예로는 장 뉴런을 포함한 모든 phox2bb+ 세포가^15,16으로 표지되어 있기 때문에 ENS를 연구하는 데 일반적으로 사용되는 tg(phox2bb:GFP) 제브라피시가 있습니다. 여기에서는 tg(phox2bb:GFP) 제브라피시 계통을 사용하여 단세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq) 분석을 위한 수정 후 5일(dpf) 유충의 장 분리 방법을 제시합니다(그림 1).

프로토콜

모든 제브라피시 사육 및 실험은 에라스무스 MC 및 동물 복지 법률의 제도적 지침에 따라 수행되었습니다. 수정 후 5일 동안 제브라피시 유충을 사용하는 것은 네덜란드 규정에 명시된 대로 공식적인 윤리적 승인이 필요하지 않은 실험 범주에 속합니다.

1. 수정 후 5일(dpf) 야생형 및 tg(phox2bb:GFP) 유충 획득

1. 야생형 제브라피시 사육을 설정하고 15cm 페트리 접시에 HEPES 완충 E3 배지(이하 E3)에 50개의 알을 수집합니다. 이 물고기를 형광 활성화 세포 분류(FAC)를 위한 음성 대조군으로 사용하십시오.
2. tg(phox2bb:GFP) 제브라피쉬를 번식시키고 15cm 페트리 접시에 E3에서 약 300개의 알을 수집합니다.
3. 수정란을 3°C의 인큐베이터에서 14시간/10시간 밝음/어두움 주기로 E28.5(접시당 최대 50개)에 보관합니다.
4. 1 dpf에서 수정되지 않은 난자를 제거하고 수정란이 5 dpf로 발달하도록 합니다.
5. 1dpf에서 tg(phox2bb:GFP) 유충을 선택합니다.

2. 야생형 전체 유충 해리

1. 5 dpf 유충에 0.016 % 트리카인을 마취합니다.
2. 10x 트립신-EDTA 용액 1mL가 들어 있는 페트리 접시에 면도날을 사용하여 제브라피시 30마리를 작은 조각으로 자릅니다.
3. 잘게 썬 제브라피시를 총 부피 2mL의 10x 트립신-EDTA 용액이 담긴 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고 얼음 위에 3시간 동안 그대로 둡니다. 해리를 자극하기 위해 매시간 P1000 피펫으로 피펫을 위아래로 움직입니다.

3. 장 격리

1. 0.016% 트리카인으로 마취된 6-10 dpf 유충을 1.8% 아가로스 플레이트(E3 25mL에 아가로스 0.45g)에 연속으로 놓습니다.
2. 제브라피쉬의 머리에 곤충 핀 하나를 꽂습니다.
3. 티슈를 사용하여 남아 있는 E3를 모두 제거합니다.
4. 다른 장기를 건드리지 않고 다른 곤충 핀을 사용하여 장을 분리하십시오. 노른자가 제거되었는지 확인하십시오(보충 그림 S1A).
5. 격리 후 장을 검사하고 필요한 경우 장과 관련이 없는 모든 물질(예: 피부, 지방, 간)을 제거합니다.
6. 핀셋으로 장을 채취하여 얼음 위에 10% 태아 송아지 혈청(FCS)이 포함된 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다.
   알림: 최소 244개의 장을 격리해야 하며 총 해부 시간을 3시간으로 유지해야 합니다. 이것은 두 사람이 동시에 작업할 때 가능합니다.

4. 장 해리

1. 모든 내장을 해부한 직후 미세 원심분리기 튜브를 최대 속도(13,800× g)로 30초 동안 원심분리합니다.
2. PBS/10% FCS를 제거하되 장이 건조해지는 것을 방지하기 위해 소량(~100μL)을 남겨 둡니다. CaCl₂ 및 MgCl₂ 를 함유한 HBSS에 500μL의 2.17mg/mL 파파인을 첨가하여 세포를 해리시킵니다.
3. 2.5μL의 시스테인(1M)으로 파파인을 활성화합니다.
4. 내장을 37°C의 수조에서 10분 동안 배양합니다. 피펫을 중간(5분 후)에 위아래로 움직여 효소 조직 소화를 자극합니다.
5. 0.5mL의 PBS/10% FCS로 미리 습윤된 35μm 세포 스트레이너를 사용하여 세포를 FACS 튜브로 옮깁니다.
6. 0.5mL 단위로 총 2mL의 PBS/10% FCS를 추가하여 스트레이너를 세척합니다.
7. 700× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
8. 상층액을 제거하고 펠릿을 300μL의 PBS/10% FCS에 재현탁시킵니다.
9. 죽은 세포(1:1,000)를 라벨링하기 위해 1μg/mL의 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)을 추가하고 FACS 중에 제외할 수 있도록 5분 동안 배양합니다.

5. FACS 강화

1. wildtype 샘플을 사용하여 유세포 분석기에 3,000개의 세포 를 기록하여 분류된 세포 집단의 게이트를 설정합니다(보충 그림 S1B-E).
2. 100μm 노즐을 사용하고 순도에 대한 분류 정밀도를 설정하고 200μL의 PBS/5% FCS가 포함된 수집 튜브를 FACS 기계에 넣습니다.
3. 내장의 세포 현탁액을 로드하고 이중세포(그림 2B)와 죽은 세포(그림 2C)를 제외하여 살아있는 세포(DAPI 음성), 단일 세포를 수집 튜브(그림 2C)로 분류합니다.
   참고: tg(phox2bb) 제브라피쉬의 경우 모든 단일 살아있는 세포가 정렬되므로 GFP⁺ 세포의 비율은 참조용으로만 확인됩니다.
4. 세포 분류 후 수집 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
5. trypan blue를 사용한 생존력 검사를 포함하여 혈구계로 세포 현탁액을 계산합니다. 생존 가능성이 80% 이상이면 다음 단계를 계속합니다.
6. 이제 세포는 scRNAseq(즉, 10x Genomics Chromium 플랫폼)를 위해 처리할 준비가 되었습니다. 샘플당 약 20,000개의 세포를 사용합니다.

결과

이 프로토콜을 사용하여 5개의 dpf 유충에서 전체 장을 성공적으로 분리하고 해리했습니다. 파파인을 해리 효소로 사용하여 세포 생존율을 크게 향상시켜 244개의 분리된 장에서 단일 생존 가능한 세포(전체 세포의 6.4%)와 관련된 46,139개의 이벤트를 포착할 수 있었습니다(그림 2A). 야생형 전체 유충을 대조군으로 사용하여 분류 공정을 최적화하여 효과적인 세포 식별 및 분류?...

토론

여기에서는 FACS를 사용하여 5dpf 제브라피시 유충의 내장을 분리하고 해리하는 방법을 제시합니다. 이 방법을 통해 10x Genomics Chromium 플랫폼을 사용하여 scRNA-seq로 다양한 장 세포 유형을 성공적으로 수집 및 분석했습니다. 우리는 생존 가능한 ENS 세포도 분리할 수 있다는 징후를 원했기 때문에 tg(phox2bb:GFP) 제브라피시 계통을 선택했습니다(그림 2D). 그러나 이 방법은 신?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%)	Sigma	59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap	BD Biosciences	352054
Cell Ranger v3.0.2	10X Genomics	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat#D-9542
Dissection microscope	Olympus SZX16
FACSAria III sorter machine	BD Biosciences	N/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2	Gibco	14025050
Insect pins	Fine Science Tools	26000-25
L-Cysteine	Sigma	C7352
MS-222, Tricaine	Supelco	A5040-250G
Papain	Sigma	P4762
Seurat v3	Stuart et al. (2019)	N/A
Trypan blue	Sigma	Cat#T8154