Single-cell RNA 염기서열분석을 위한 Zebrafish 유충의 장 분리

요약

여기에서는 단세포 RNA 염기서열 분석을 위해 수정 후 5일에 제브라피시 유충에서 장을 분리하는 방법을 설명합니다.

초록

위장관(GI)은 생명에 필수적인 다양한 기능을 수행합니다. 발달에 영향을 미치는 선천적 결함은 장 신경근 장애로 이어질 수 있으며, 이는 위장 발달 및 기능 장애의 기저에 있는 분자 메커니즘을 이해하는 것이 중요하다는 점을 강조합니다. 이 연구에서는 수정 후 5일에 제브라피시 유충에서 장을 분리하여 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq) 분석에 사용할 수 있는 살아 있는 생존 가능한 세포를 얻는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 제브라피시 장의 수동 해부 후 파파인과의 효소 해리를 기반으로 합니다. 그 후, 세포를 형광 활성화 세포 분류에 제출하고 scRNA-seq를 위해 생존 가능한 세포를 수집합니다. 이 방법을 통해 상피, 기질, 혈액, 근육 및 면역 세포와 장 신경 세포 및 신경교세포를 포함한 다양한 장 세포 유형을 성공적으로 식별할 수 있었습니다. 따라서 제브라피시를 사용하여 건강과 질병에서 위장관의 구성을 연구하는 데 귀중한 자료라고 생각합니다.

서문

위장관(GI)은 전반적인 건강과 웰빙에 중요한 역할을 하는 복잡한 시스템입니다. 그것은 영양소의 소화 및 흡수뿐만 아니라 노^{폐물 1,2}의 제거를 담당합니다. 위장관은 상피세포, 평활근세포, 면역세포, 장신경계(ENS) 등 여러 세포 유형으로 구성되어 있으며, 이들은 서로 긴밀하게 소통하여 적절한 장 기능을 조절하고 유지합니다 ^3,4,5. 위장관 발달의 결함은 영양소 흡수, 미생물군 구성, 장-뇌 축 및 ENS와 같은 다양한 측면에 광범위한 영향을 미칠 수 있으며, 히르슈스프룽 병(Hirschsprung disease) 및 만성 장 가성 폐쇄(Chronic intestinal pseudo-obstruction)와 같은 여러 장 신경근 장애를 유발할 수 있습니다 ^6,7. 이러한 장애는 Cajal의 간질 세포, 평활근 세포 및 ENS ^6,8,9

프로토콜

모든 제브라피시 사육 및 실험은 에라스무스 MC 및 동물 복지 법률의 제도적 지침에 따라 수행되었습니다. 수정 후 5일 동안 제브라피시 유충을 사용하는 것은 네덜란드 규정에 명시된 대로 공식적인 윤리적 승인이 필요하지 않은 실험 범주에 속합니다.

1. 수정 후 5일(dpf) 야생형 및 tg(phox2bb:GFP) 유충 획득

1. 야생형 제브라피시 사육을 설정하고 15cm 페트리 접시에 HEPES 완충 E3 배지(이하 E3)에 50개의 알을 수집합니다. 이 물고기를 형광 활성화 세포 분류(FAC)를 위한 음성 대조군으로 사용하십시오.
2. tg(phox2bb:GFP) 제브라피쉬를 번식시키고 15cm 페트리 접시에 E3에서 약 300개의 알을 수집합니다.
3. 수정란을 3°C의 인큐베이터에서 14시간/10시간 밝음/어두움 주기로 E28.5(접시당 최대 50개)에 보관합니다.
4. 1 dpf에서 수정되지 않은 난자를 제거하고 수정란이 5 dpf로 발달하도록 합니다.
5. 1dpf에서 tg(phox2bb:GFP) 유충을 선택합니다.

2. 야....

토론

여기에서는 FACS를 사용하여 5dpf 제브라피시 유충의 내장을 분리하고 해리하는 방법을 제시합니다. 이 방법을 통해 10x Genomics Chromium 플랫폼을 사용하여 scRNA-seq로 다양한 장 세포 유형을 성공적으로 수집 및 분석했습니다. 우리는 생존 가능한 ENS 세포도 분리할 수 있다는 징후를 원했기 때문에 tg(phox2bb:GFP) 제브라피시 계통을 선택했습니다(그림 2D). 그러나 이 방법은 신?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%)	Sigma	59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap	BD Biosciences	352054
Cell Ranger v3.0.2	10X Genomics	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat#D-9542
Dissection microscope	Olympus SZX16
FACSAria III sorter machine	BD Biosciences	N/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2	Gibco	14025050
Insect pins	Fine Science Tools	26000-25
L-Cysteine	Sigma	C7352
MS-222, Tricaine	Supelco	A5040-250G
Papain	Sigma	P4762
Seurat v3	Stuart et al. (2019)	N/A
Trypan blue	Sigma	Cat#T8154