מודל לחשיפה ניסיונית של בני אדם לקרציות זחל Ixodes scapularis

Summary

מאמר זה מציג את המתודולוגיה לחשיפת בני אדם לזחל Ixodes scapularis לצורך מחקר קליני. הטכניקה פשוטה יחסית, נסבלת על ידי מתנדבי המחקר, וניתנת לשינוי בהתאם לצרכי הניסוי. מחקר כזה בבני אדם חייב להתבצע תחת פרוטוקולי מחקר קליני שאושרו על ידי הרשויות הרגולטוריות המתאימות.

Abstract

מחלות המועברות על ידי קרציות הן בעיה משמעותית בבריאות הציבור בארצות הברית ובעולם. קרציות מחייבות פרוקי רגליים הניזונים מדם; קרצית איקסודיד חייבת להישאר צמודה לעור הפונדקאי ולהשלים את תהליך ההזנה הרב-יומי שלה כדי לרכוש את ארוחת הדם שלה. חשיפת בעלי חיים לקרציות היא פרקטיקה נפוצה לחקר תגובות פונדקאים לעקיצות קרציות ולמחלות המועברות על ידי קרציות. פיתחנו את הנוהל, ערכנו את המחקר הראשון בבני אדם, ופרסמנו את הממצאים על חשיפת מתנדבים אנושיים לקרציות Ixodes scapularis של זחלים לא נגועים. מאמר זה מתאר את המתודולוגיה המשמשת לבניית הלבשת הבלימה, כיצד למרוח ולהצמיד את הקרציות לפונדקאי, כיצד לשמור על החבישה וכיצד להסיר את הקרציות מהפונדקאי. חשיפת מתנדבים לעקיצות קרציות היא הליך ניסיוני וחייבת להתבצע תחת פרוטוקול מחקר קליני המאושר על ידי הרשויות הרגולטוריות המתאימות. שיטה זו מאפשרת מחקר תרגומי כדי להבין טוב יותר את התגובה האנושית לעקיצות קרציות ולטפח פיתוח אבחון, מניעה וטיפולים למחלות המועברות על ידי קרציות.

Introduction

קרציות קשות (Ixodidae: Acari) הן אקטופרזיטים הניזונים מדם ברחבי העולם ומסוגלות להעביר מגוון רחב של פתוגנים, כולל חיידקים, וירוסים וטפילים, בעלי חשיבות רפואית וטרינרית רבה. קרציות Ixodid חייבות להישאר מחוברות לפונדקאי במשך ימים כדי להשלים ארוחת דם, ויש להן את היכולת להישאר מחוברות לעור תוך הימנעות מזיהוי, מניעת קרישת דם מקומית והקלה על הזנה לטווח ארוך ^1,2,3. מחקרים בבעלי חיים הוכיחו כי פונדקאים שאינם מתירנים רוכשים עמידות לעקיצות קרציות עם חשיפות חוזרות ונשנות לקרציות, מה שעלול להוביל לירידה ביכולת להעביר פתוגן, בעוד שקרציות יכולות שוב ושוב לטפיל פונדקאים מתירניים. עמידות נרכשת לקרציות תלויה באופי התגובה החיסונית של הפונדקאי 4,5,6,7.

מחלות המועברות על ידי קרציות הן איום הולך וגובר בארצות הברית (ארה"ב), כאשר מספר המקרים המדווחים יותר מהוכפל בין 2004 ל -2016 ^8,9. בשל שינויי האקלים, הטווחים הגיאוגרפיים של הקרציות השונות ממשיכים להתרחב^10,11. המחלות המובילות המועברות על ידי קרציות בארה"ב כוללות מחלת ליים, אנאפלזמוזיס, ארליכיוזיס, קדחת מנומרת, ריקטסיוזיס, בבסיוזיס, טולרמיה ומחלת וירוס פווסאן⁸. מחלת ליים, הנגרמת על ידי זיהום עם Borrelia burgdorferi sensu lato, היא המחלה הנפוצה ביותר המועברת על ידי קרציות בארה"ב ובאירופה¹². עם כ 476,000 אנשים מאובחנים עם מחלת ליים מדי שנה בארה"ב, יש הן נטל בריאותי וכלכלי על הפרט ועל החברה 13,14,15.

Ixodes scapularis (קרצית שחורת הרגל או קרצית הצבי) היא הווקטור העיקרי למחלת ליים, כמו גם אנאפלזמוזיס, בבסיוזיס, מחלת Borrelia miyamotoi ומחלת וירוס Powassan בארצות הברית. מיני קרציות אחרים בעלי חשיבות רפואית בארה"ב כוללים קרצית כוכב בודדת ( Amblyomma americanum ), קרצית כלב אמריקאית ( Dermacentor variabilis ), קרצית שחורת רגל מערבית ( Ixodes pacificus ), קרצית עץ הרי הרוקי ( Dermacentor andersoni ), קרצית חזיר קרקע ( Ixodes cookei ), קרצית חוף האוקיינוס השקט ( Dermacentor occidentalis ), קרצית כלב חומה ( Rhipicephalus sanguineus ) וקרצית חוף המפרץ ( Amblyomma maculatum )¹⁶.

פיתוח שיטה לחשיפת מתנדבי מחקר לעקיצות קרציות תומך במחקרים המשתמשים בווקטור הטבעי כדי לחפש ראיות לזיהום, הליך המכונה xenodiagnosis 17,18,19,20,21, וללמוד עוד על חסינות הנגרמת על ידי חשיפה לקרציות, אשר יכולה לתרום לגילוי חיסון נגד קרציות ^5,6,7. ההליך המתואר כאן פותח ושימש במחקר האנושי הראשון באמצעות זחל Ixodes scapularis שגודל במעבדה עבור xenodiagnosis של זיהום B. burgdorferi לאחר טיפול אנטיביוטי (NCT01143558), שפורסם בשנת 2014¹⁹. המערכת שימשה בהצלחה במחקר שלב 2 שבדק אם קסנודיאגנוזה חיובית קשורה להתמדה של תסמינים לאחר טיפול אנטיביוטי במחלת ליים (NCT02446626) ובמחקר שבדק את תגובת המארח לעקיצות קרציות (NCT05036707).

פרוטוקול הליך זה מתאר את תהליך יצירת חבישת ההכלה, הליך מיקום הקרציות והליך הסרת הקרציות, כמו גם את הטיפול באתר הדרוש לשמירה על חבישת ההכלה. הפרטים לגבי מושבת הקרציות I. scapularis נטולת הפתוגנים ונהלי החשיפה לקרציות המשמשים למחקרים שצוטטו לעיל תוארו בעבר^19,22. מתודולוגיה זו מציעה כלי מחקר גמיש שניתן להתאים לחקר היבטים שונים של תגובת הפונדקאי האנושי לעקיצות קרציות, יעילותן של תרופות למניעת קרציות, כמו גם מחלת ליים ומחלות אחרות המועברות על ידי קרציות.

Protocol

חשיפת מתנדבים לעקיצות קרציות היא שיטה ניסיונית וחייבת להתבצע תחת פרוטוקול מחקר קליני המאושר על ידי הרשויות הרגולטוריות הרלוונטיות. המחקרים הקליניים (NCT01143558, NCT02446626 ו-NCT05036707) אושרו על ידי ועדות הבדיקה המוסדיות המתאימות, נערכו תחת פטור ממכשירים ניסיוניים שניתן על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי, ובוצעו בהתאם להנחיות Good Clinical Practice. בנוסף, מחקרים אלה נרשמו ב-ClinicalTrials.gov, והתקבלה הסכמה מדעת בכתב מכל המשתתפים.

1. הכנת תחבושת הכלה

1. כדי ליצור תבנית מדידה, צלמו את הלבישה המכילה הידרוקולואידים בגודל 3 אינץ' x 3 אינץ' לאורך הצד של קווי המדידה (איור 1A וטבלת חומרים).
2. גזור את התבנית המצולמת לאורך קו 1 אינץ'. לאחר מכן, חתכו לאורך קו ה-2 אינץ', וצרו עיגול בגודל 2 אינץ' עם מרכז בגודל 1 אינץ' (איור 1B).
3. בעזרת תבנית זו, חתכו את רוטב הקצף הלא דביק ליצירת עיגול בגודל 2 אינץ' עם מרכז בגודל 1 אינץ' (איור 2A,B וטבלת חומרים).
4. באמצעות אותה תבנית, גזרו עיגול בגודל 2 אינץ' במרכז הלבישה ההידרוקולואידית הדקה במיוחד בגודל 4 אינץ' x 4 אינץ' (איור 2C,D).
5. חותכים את שכבת ההידרוקולואיד של הלבישה המכילה בגודל 3 אינץ' x 3 אינץ' בקו 1/2 אינץ'.
6. משכו לאחור את ציפוי הנייר של שכבת ההידרוקולואיד של הלבישה כדי לחשוף את הדבק. הניחו את רוטב הקצף החתוך בתוך עיגול "2 של הדבק (איור 3A). זה יבטיח כי רוטב הקצף משתרע מעבר לפתח של רוטב הכלה. החליפו את תוחם הנייר על שכבת ההידרוקולואיד של החבישה (איור 3B).
   הערה: מדידות אלה שימשו למחקרים שכללו עד 10 קרציות I. scapularis . במחקרים שכללו עד 30 קרציות I. scapularis , התבנית של מרכז הקצף נחתכה בין הסימונים בגודל 1 אינץ' ל-11/2 אינץ' כדי לאפשר שטח גדול יותר למיקום. ניתן להתאים את מידות הלבישה בהתאם לעיצוב המחקר.

2. מיקום קרציות

1. אחסון קרציות
   1. לאחסן את הזחל I. scapularis קרציות במקרר ברמה רפואית עם הטמפרטורה להגדיר 9-10 ° C.
   2. אחסנו את הקרציות בבקבוקון מכוסה במכסה רשת כדי לאפשר זרימת אוויר נאותה. ארזו את בקבוקון הקרציות בשקית ניילון הניתנת לאטימה עם ספוג לח קלות כדי לשמור על לחות ולמנוע התייבשות.
2. הנחת הקרציות
   1. מוציאים את הקרציות מהמקרר כדי לאפשר להן להתחמם לטמפרטורת החדר. הקרציות יכולות להיות פעילות תוך 15 דקות בלבד מחוץ למקרר.
   2. מקם גיליון לבן מסביב לאזור המיקום כדי לדמיין בקלות כל סימן שנפל בשוגג.
   3. הרטיבו פד גזה בגודל 4X4 אינץ' במים נקיים או מלוחים והשתמשו בו כדי לנקות את העור של אתר המיקום. יש לייבש את האזור בטפיחות קלות או לאפשר לו להתייבש באוויר.
      הערה: בעת בחירת אתר הגוף למיקום הקרציות, יש לקחת בחשבון אזורים שאינם מגבילים את הפעילות היומיומית של המתנדב ושבהם ניתן לפקח בקלות על שלמות החבישה על ידי המשתתף. אין להניח קרציות באזורים שבהם הן עלולות להימעך עקב לחץ ישיר (למשל, הגב). להעריך את שיער הגוף של המשתתף, ואם יש צורך, בזהירות לקצץ שיער גוף עודף באמצעות מספריים באתר של דבק, הימנעות נזק לעור. הימנעו משימוש בסכין גילוח להסרת שיער, שכן הוא עלול להגביר את הסיכון לפגיעה בעור ולזיהום.
   4. ברגע שהעור יבש, הסירו את תוחם הדבק מהצד ההידרוקולואידי של ההלבשה המוכנה והדביקו אותו היטב לעור באתר המיקום, כדי להבטיח ששכבת הרשת תישאר פתוחה.
   5. שברו את מקלון העץ (ראו טבלת חומרים) לשניים כדי לחשוף קצוות משוננים.
   6. בזהירות לפתוח את בקבוקון הקרציות.
   7. בעזרת הקצה המשונן של מקלון העץ, העבירו קרציות פעילות מהבקבוקון והניחו אותן על העור בתוך חבישת ההכלה (איור 4A). בקש מחבר צוות נוסף לפקח על אתר מיקום הקרציות כדי לוודא שהקרציות נשארות בתוך הלבישה המבלימה. השתמשו בסרט הדבקה כדי ללכוד קרציות שבורחות מהבקבוקון בתהליך זה.
      הערה: שבירת מקלון עץ ושימוש בקצה המשונן יעילים למניפולציה והעברה של קרציות מבלי לגרום נזק לקרציות. מברשת קטנה עם זיפים רכים בצבע בהיר פועלת גם להעברת קרציות מהמיכל לאתר העור.
   8. לאחר הנחת מספר הקרציות שצוין למחקר, הסירו את תוחם הדבק משכבת הרשת של הלבישה וסגרו אותו מעל הפתח.
   9. לאחר שווידאתם שהדבק מחובר היטב, מרחו את ההלבשה ההידרוקולואידית הדקה במיוחד בגודל 4 אינץ' על 4 אינץ' מעל הלבישה המכילה לאבטחה נוספת (איור 4B).
      הערה: מידע נוסף לגבי מושבת הקרציות I. scapularis נטולת הפתוגנים ומשך הליכי החשיפה לקרציות ששימשו במחקרים המצוטטים ניתן למצוא בפרקי השיטות של המחקרים שפורסמו^19,22.

3. טיפול באתר

1. ספק כיסוי מחסום מים וסרט היפואלרגני בגודל 2 אינץ' (ראה טבלת חומרים) למשתתף המחקר.
2. ספקו הוראות לטיפול באתר ההכלה של הקרציות.
   1. בדוק מעת לעת את החבישה ועקוב אחר הקצוות להידבקות בטוחה לעור. יש למרוח סרט נוסף לחיזוק קצוות ההלבשה לפי הצורך.
   2. אין לגרד את מקום החבישה ולהימנע מפתיחה או הסרה של החבישה במהלך תקופת הלימוד.
   3. הימנעו מרחצה או טבילה במים. כמו כן, הימנעו ממקלחות חמות והגבילו את משך המקלחת. לפני המקלחת, יש להגן על הלבישה עם כיסוי מחסום המים המסופק ולהסיר אותה לאחר סיום המקלחת. יבשו בעדינות את ההלבשה בטפיחות קלות ובדקו אותה כדי לוודא שהיא נשארת בטוחה.
   4. הימנעו מפעילויות שעלולות להוביל להזעה רבה ולפגוע בשלמות החבישה (למשל, פעילות אירובית, טיולים ממושכים).

4. הרחקת קרציות

1. הכנת בקבוקוני איסוף
   1. תייגו את בקבוקוני איסוף הקרציות עם המזהים הרצויים (למשל, קוד מחקר, תאריך).
   2. אם יש צורך בשימור קרציות חיות, נקב חורים במכסה הבקבוקונים עם מחט 20 גרם. השתמשו בשכבה של רשת ניילון או פוליאסטר יחד עם המכסה כדי לאטום את הבקבוקון. הניחו חתיכה קטנה של ספוג לח בשקית הניתנת לאטימה עם בקבוקון הקרציות כדי לשמור על לחות.
2. הסרת הקרציות
   1. הניחו סדינים לבנים סביב אתר התחבושת וודאו שאגן האיסוף נמצא בהישג יד.
   2. באמצעות מגבוני אלכוהול, בזהירות להסיר את התחבושת מן העור.
   3. לאחר ההסרה המלאה, הניחו את התחבושת באגן האיסוף ובדקו אותה לנוכחות קרציות מנותקות.
   4. הערך את אתר המיקום של קרציות מצורפות. קרציות שניזונו למילוי יתנתקו (איור 5A). עבור שאר הקרציות המצורפות, השתמשו במלקחיים עדינים להסרה (איור 5B).
   5. נקו את העור עם מגבוני אלכוהול או מים וסבון.

תוצאות

המחקר הראה כי ההליך בטוח ונסבל היטב, כאשר תופעת הלוואי העיקרית היא גירוד קל במקום העקיצות, שנצפה ב -58% מההליכים. לא היו תופעות לוואי חמורות הקשורות להליך בעת שימוש בזחל נקי במעבדה I. scapularis קרציות¹⁹. ב-43 ההליכים שנערכו, אחוז ההחלמה הממוצע של קרציות מחוברות בהשוואה לקרציות שהו?...

Discussion

בעוד שמחקרים בבעלי חיים שכללו חשיפה לקרציות 4,5,6,7,21 היו בעלי ערך רב בהגברת ההבנה שלנו של תגובת הפונדקאי למחלות המועברות על ידי קרציות ועקיצות קרציות, למודלים אלה יש מגבלות במידת התחזית שלהם לתגובת המארח האנושי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 G needle	Any brand		For puncturing the vial cap.
3" x 3" containment dressing	Monarch Labs Names	LeFlap	https://www.monarchlabs.com/ordering
4" x 4" extra-thin hydrocolloid dressing	ConvaTec	DuoDerm	https://www.convatec.com/products/advanced-wound-care/brand-names/pc-wound-duoderm-granluflex/duoderm-extra-thin-dressing/
4" x 4" gauze	Monarch Labs Names		For cleaning skin
Clean water or saline			For cleaning skin
Moisture barrier (e.g. 7" x 7")	AquaGuard	TIDI	For showering, ttps://www.tidiproducts.com/product-listing/aquaguard-shower-cover-sheets
Non-adhesive foam dressing	Coloplast	Biatain	https://www.coloplast.us/biatain-non-adhesive-en-us.aspx
Roll of 2" hypoallergenic tape	Monarch Labs Names	Durapore	For reinforcing containment dressing.
Roll of adhesive tape			For trapping ticks
Vials for collection (e.g. cryovials)	Ependorf	ECC200