Модель экспериментального воздействия на человека личинок клещей Ixodes scapularis

Резюме

В данной статье представлена методология контакта человека с личинками Ixodes scapularis для проведения клинических исследований. Метод относительно прост, приемлем для добровольцев-исследователей и может быть модифицирован в соответствии с экспериментальными потребностями. Такие исследования с участием человека в качестве субъекта исследования должны проводиться в соответствии с протоколами клинических исследований, утвержденными соответствующими регулирующими органами.

Аннотация

Клещевые заболевания являются серьезной проблемой общественного здравоохранения в Соединенных Штатах и во всем мире. Клещи — это облигатные членистоногие, питающиеся кровью; Иксодовый клещ должен оставаться прикрепленным к коже хозяина и завершить свой многодневный процесс питания, чтобы получить его кровяную пищу. Контакт животных с клещами является обычной практикой для изучения реакции хозяев на укусы клещей и клещевые заболевания. Мы разработали процедуру, провели первое научное исследование на людях и опубликовали результаты по воздействию на добровольцев неинфицированных личиночных клещей Ixodes scapularis . В этой статье описывается методология, использованная для создания защитной повязки, способы наложения и закрепления клещей на хозяине, способы поддержания повязки и удаления клещей с хозяина. Контакт добровольцев с укусами клещей является экспериментальной процедурой и должен выполняться в соответствии с протоколом клинических исследований, утвержденным соответствующими регулирующими органами. Этот метод позволяет проводить трансляционные исследования, чтобы лучше понять реакцию человека на укусы клещей и способствовать разработке диагностики, профилактики и лечения клещевых заболеваний.

Введение

Твердые клещи (Ixodidae: Acari) являются облигатными кровопитающими эктопаразитами, которые встречаются во всем мире и способны передавать широкий спектр патогенов, включая бактерии, вирусы и паразитов, имеющих большое медицинское и ветеринарное значение. Иксодовые клещи должны оставаться прикрепленными к хозяину в течение нескольких дней, чтобы завершить прием пищи кровью, и они обладают способностью оставаться прикрепленными к коже, избегая распознавания, предотвращая местное свертывание крови и способствуя долгосрочному питанию ^1,2,3. Исследования на животных показали, что неразрешающие хозяева приобретают устойчивость к укусам клещей при повторном воздействии клещей, что может привести к снижению способности передавать патоген, в то время как клещи могут многократно паразитировать на разрешающих хозяевах. Приобретенная резистентность к клещам зависит от характера иммунного ответа хозяина 4,5,6,7.

Клещевые заболевания представляют собой растущую угрозу в Соединенных Штатах (США), при этом число зарегистрированных случаев увеличилось более чем в два раза в период с 2004 по 2016 год^{до 8,9}. Из-за изменения климата географические ареалы различных клещей продолжают расширяться ^10,11. К ведущим клещевым заболеваниям в США относятся болезнь Лайма, анаплазмоз, эрлихиоз, пятнистый лихорадочный риккетсиоз, бабезиоз, туляремия и болезнь, вызванная вирусом Повассан⁸. Болезнь Лайма, вызванная инфекцией Borrelia burgdorferi sensu lato, является наиболее распространенным клещевым заболеванием в США и Европе¹². С учетом того, что ежегодно в США у 476 000 человек диагностируется болезнь Лайма, существует как общественное здравоохранение, так и экономическое бремя для отдельных лиц^{и общества.}

Ixodes scapularis (черноногий или оленьий клещ) является основным переносчиком болезни Лайма, а также анаплазмоза, бабезиоза, болезни Borrelia miyamotoi и болезни, вызванной вирусом Повассан, в США. К другим важным с медицинской точки зрения видам клещей в США относятся Amblyomma americanum (клещ одинокой звезды), Dermacentor variabilis (американский собачий клещ), Ixodes pacificus (западный черноногий клещ), Dermacentor andersoni (древесный клещ Скалистых гор), Ixodes cookei (клещ сурка), Dermacentor occidentalis (клещ тихоокеанского побережья), Rhipicephalus sanguineus (коричневый собачий клещ) и Amblyomma maculatum (клещ побережья Мексиканского залива)¹⁶.

Разработка метода воздействия на добровольцев-исследователей укусов клещей поддерживает исследования с использованием естественного вектора для поиска доказательств инфекции, процедуры, известной как ксенодиагностика 17,18,19,20,21, и для получения дополнительной информации об иммунитете, вызванном контактом с клещами, что может способствовать открытию противоклещевой вакцины ^5,6,7. Описанная здесь процедура была разработана и использована в первом исследовании на людях с использованием выращенной в лаборатории личинки Ixodes scapularis для ксенодиагностики инфекции B. burgdorferi после антибиотикотерапии (NCT01143558), опубликованном в 2014 году^. Система была успешно использована в исследовании фазы 2, в котором изучалось, коррелирует ли положительный ксенодиагноз с сохранением симптомов после лечения антибиотиками болезни Лайма (NCT02446626), а также в исследовании, изучающем реакцию хозяина на укусы клещей (NCT05036707).

Этот протокол процедуры описывает процесс создания защитной повязки, процедуру размещения клеща и процедуру удаления клещей, а также уход за участком, необходимый для поддержания защитной повязки. Подробности, касающиеся колонии клещей I. scapularis без патогенов и процедур воздействия на клещей, использованных в вышеупомянутых исследованиях, были описаны ранее^19,22. Эта методология предлагает гибкий исследовательский инструмент, который может быть адаптирован для изучения различных аспектов реакции человека на укусы клещей, эффективности препаратов для профилактики клещей, а также болезни Лайма и других клещевых заболеваний.

протокол

Контакт добровольцев с укусами клещей является экспериментальным методом и должен проводиться в соответствии с протоколом клинических исследований, утвержденным соответствующими регулирующими органами. Клинические исследования (NCT01143558, NCT02446626 и NCT05036707) были одобрены соответствующими институциональными наблюдательными советами, проведены в соответствии с исключениями для исследуемых устройств, предоставленными Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, и проведены в соответствии с рекомендациями надлежащей клинической практики. Кроме того, эти исследования были зарегистрированы в ClinicalTrials.gov, и было получено письменное информированное согласие от всех участников.

1. Подготовка защитной повязки

1. Чтобы создать шаблон измерения, сделайте фотокопию гидроколлоидной повязки размером 3 x 3 дюйма вдоль боковой линии измерения (Рисунок 1A и Таблица материалов).
2. Вырежьте ксерокопию шаблона по линии 1". Затем разрежьте по линии 2", создав круг 2" с центром 1" (Рисунок 1B).
3. Используя этот шаблон, вырежьте неадгезивную пенопластовую повязку, чтобы создать круг 2 дюйма с центром 1 дюйм (Рисунок 2A, B и Таблица материалов).
4. Используя тот же шаблон, вырежьте круг размером 2 дюйма в центре сверхтонкой гидроколлоидной повязки размером 4 x 4 дюйма (Рисунок 2C, D).
5. Разрежьте гидроколлоидный слой защитной повязки размером 3 x 3 дюйма на линии 11/2 дюйма.
6. Оттяните бумажный вкладыш гидроколлоидного слоя защитной повязки, чтобы обнажить клей. Поместите повязку из разрезанной пены в круг клея диаметром 2 дюйма (Рисунок 3A). Это гарантирует, что пенная повязка выйдет за пределы отверстия защитной повязки. Замените бумажный вкладыш на гидроколлоидный слой повязки (рисунок 3B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти измерения использовались для исследований с участием до 10 личинок клещей I. scapularis . Для исследований с участием до 30 личинок клещей I. scapularis шаблон для центра пенопласта был разрезан между отметками 1" и 11/2", чтобы обеспечить большую площадь для размещения. Размеры защитной оболочки могут быть адаптированы в соответствии с планом исследования.

2. Расстановка клещей

1. Хранение клещей
   1. Хранить личинок клещей I. scapularis следует в медицинском холодильнике при температуре 9-10 °C.
   2. Храните клещей во флаконе, закрытом сетчатой крышкой, чтобы обеспечить достаточный приток воздуха. Упакуйте флакон с клещами в герметичный полиэтиленовый пакет со слегка смоченной губкой для поддержания влажности и предотвращения высыхания.
2. Расстановка галочек
   1. Достаньте клещей из холодильника, чтобы дать им нагреться до комнатной температуры. Клещи могут активизироваться уже за 15 минут вне холодильника.
   2. Расположите белый лист вокруг области размещения, чтобы легко визуализировать любого случайно выпавшего клеща.
   3. Смочите марлевую салфетку размером 4 x 4 дюйма чистой водой или физиологическим раствором и используйте ее для очистки кожи в месте размещения. Участок следует высушить или дать высохнуть на воздухе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе места для размещения клещей учитывайте зоны, которые не ограничивают повседневную деятельность добровольца и где участник может легко контролировать целостность повязки. Не размещайте клещей в местах, где они могут быть раздавлены из-за прямого давления (например, на спине). Оцените волосяное покров на теле участника, и при необходимости аккуратно подстригите лишние волосы на теле с помощью ножниц в месте нанесения клея, не допуская повреждения кожи. Избегайте использования бритвы для удаления волос, так как это может увеличить риск травмирования кожи и инфекции.
   4. Как только кожа высохнет, снимите клейкую подкладку с гидроколлоидной стороны приготовленной повязки и плотно прикрепите ее к коже в месте размещения, следя за тем, чтобы слой сетки оставался открытым.
   5. Разломите деревянный тампон (см. Таблицу материалов) пополам, чтобы обнажить зазубренные концы.
   6. Осторожно откройте флакон с клещами.
   7. С помощью зазубренного конца деревянного тампона перенесите активных клещей из флакона и поместите их на кожу внутри защитной повязки (рисунок 4A). Поручите дополнительному члену команды следить за местом размещения клещей, чтобы убедиться, что клещи остаются внутри защитной повязки. Используйте клейкую ленту для улавливания клещей, которые вырываются из флакона во время этого процесса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сломать деревянный тампон и использовать зазубренный конец эффективно для манипуляций с клещами и их переноса, не причиняя вреда клещам. Небольшая кисточка с мягкой щетиной светлого цвета также подходит для переноса клещей из контейнера на участок кожи.
   8. После того, как указанное количество клещей для исследования будет размещено, снимите клеевой вкладыш с сетчатого слоя защитной повязки и закройте его над отверстием.
   9. Убедившись, что клей надежно прикреплен, нанесите приготовленную сверхтонкую гидроколлоидную повязку размером 4 x 4 дюйма поверх защитной повязки для дополнительной безопасности (Рисунок 4B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительную информацию о колонии клещей I. scapularis без патогенов и продолжительности процедур воздействия на клещей, использованных в цитируемых исследованиях, можно найти в разделах «Методы» опубликованных исследований^19,22.

3. Уход за участком

1. Предоставить участнику исследования водный барьер и гипоаллергенную ленту диаметром 2 дюйма (см. Таблицу материалов).
2. Предоставьте инструкции по уходу за местом содержания клещей.
   1. Периодически проверяйте повязку и следите за краями на предмет надежного сцепления с кожей. При необходимости наклейте дополнительную ленту для укрепления краев повязки.
   2. Не царапайте место наложения повязки, а также воздержитесь от вскрытия или снятия повязки в период исследования.
   3. Избегайте купания или замачивания в воде. Также избегайте горячего душа и ограничьте продолжительность принятия душа. Перед принятием душа защитите защитную повязку прилагаемой водонепроницаемой крышкой и снимите ее после принятия душа. Аккуратно промокните повязку насухо и осмотрите ее, чтобы убедиться, что она остается надежной.
   4. Избегайте занятий, которые могут привести к сильному потоотделению и нарушить целостность повязки (например, аэробные упражнения, длительные походы).

4. Удаление клещей

1. Приготовление коллекционных флаконов
   1. Пометьте флаконы для сбора клещей нужными идентификаторами (например, кодом исследования, датой).
   2. Если необходимо сохранение живых клещей, проколите отверстия в крышке флаконов иглой 20 G. Используйте слой нейлоновой или полиэфирной сетки вместе с крышкой, чтобы запечатать флакон. Поместите небольшой кусочек влажной губки в герметичный пакет вместе с флаконом с клещами для поддержания влажности.
2. Удаление клещей
   1. Положите белые листы вокруг места наложения повязки и убедитесь, что бассейн для сбора находится в пределах досягаемости.
   2. С помощью спиртовых салфеток аккуратно снимите повязку с кожи.
   3. После полного снятия поместите повязку в таз для сбора и осмотрите ее на наличие отделившихся клещей.
   4. Оцените место размещения прикрепленных клещей. Клещи, которые накормились до полного отторжения, отсоединятся (рисунок 5A). Для удаления остальных прикрепленных клещей используйте щипцы с тонким наконечником (рисунок 5B).
   5. Очистите кожу спиртовыми салфетками или водой с мылом.

Результаты

Исследование показало, что процедура безопасна и хорошо переносится, при этом основным побочным явлением является легкий зуд в месте укуса, который наблюдается в 58% процедур. Серьезных нежелательных явлений, связанных с процедурой, при использовании чистых выращенных в лаборатории ли?...

Обсуждение

В то время как исследования на животных, включающие воздействие клещей 4,5,6,7,21, были неоценимы для улучшения нашего понимания реакции хозяина на клещевые болезни и укусы клещей, эти модели имеют ограничения в том, насколько хорошо они предсказывают реакцию человека хо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 G needle	Any brand		For puncturing the vial cap.
3" x 3" containment dressing	Monarch Labs Names	LeFlap	https://www.monarchlabs.com/ordering
4" x 4" extra-thin hydrocolloid dressing	ConvaTec	DuoDerm	https://www.convatec.com/products/advanced-wound-care/brand-names/pc-wound-duoderm-granluflex/duoderm-extra-thin-dressing/
4" x 4" gauze	Monarch Labs Names		For cleaning skin
Clean water or saline			For cleaning skin
Moisture barrier (e.g. 7" x 7")	AquaGuard	TIDI	For showering, ttps://www.tidiproducts.com/product-listing/aquaguard-shower-cover-sheets
Non-adhesive foam dressing	Coloplast	Biatain	https://www.coloplast.us/biatain-non-adhesive-en-us.aspx
Roll of 2" hypoallergenic tape	Monarch Labs Names	Durapore	For reinforcing containment dressing.
Roll of adhesive tape			For trapping ticks
Vials for collection (e.g. cryovials)	Ependorf	ECC200