קבוצה של פורמטים מדומים מדומים באתרם לטיפוח מיקרואורגניזמים אנאירוביים שנרכשו בסביבה

Summary

המוקד של מאמר זה הוא לפרט שיטות עבודה מומלצות להכנת מדיה עבור מיקרואורגניזמים אנאירוביים מהירים שנרכשו מסביבה. שיטות אלה מסייעות בניהול תרביות אנאירוביות וניתן ליישם אותן כדי לתמוך בצמיחה של מיקרואורגניזמים חמקמקים ולא מתורבתים, "החומר האפל המיקרוביאלי".

Abstract

מחקר תלוי תרבות של מיקרואורגניזמים אנאירוביים נשען על יכולת מתודולוגית. שיטות אלה חייבות ליצור ולתחזק תנאי גידול מתאימים (למשל, pH ומקורות פחמן) עבור מיקרואורגניזמים אנאירוביים, תוך מתן אפשרות להפקת דגימות מבלי לפגוע בסביבה המלאכותית. לשם כך, שיטות המבוססות על סביבה באתרה ומדמות אותה יכולות לסייע רבות בגידול מיקרואורגניזמים מסביבה זו. כאן, אנו מתארים שיטה אנאירובית מושכלת ומדומה באתרה לגידול מיקרואורגניזמים יבשתיים ותת-קרקעיים, תוך שימת דגש על איסוף דגימות אנאירוביות עם הפרעה מינימלית. פרוטוקול זה מפרט את הייצור של תווך נוזלי אנאירובי הניתן להתאמה אישית, ואת הרכישה הסביבתית והצמיחה במבחנה של מיקרואורגניזמים אנאירוביים. הפרוטוקול מכסה גם רכיבים קריטיים של ביוריאקטור אנאירובי המשמש להדמיות סביבתיות של משקעים ומדיה נוזלית אנאירובית עבור תרבויות שנרכשו סביבתיים. כללנו נתוני ריצוף ראשוניים מהדור הבא ממיקרוביום מתוחזק לאורך תוחלת החיים של ביוריאקטור, שבו התרבית הפעילה התאימה את עצמה באופן דינמי בתגובה למקור פחמן ניסיוני.

Introduction

רוב המיקרואורגניזמים נותרים בלתי מתורבתים; זה נתמך על ידי הפער הגדול בין התאים שנצפו באמצעות מיקרוסקופיה, בניגוד למיקרואורגניזמים המעטים שגודלו בהצלחה באמצעות לוחות אגר. סטיילי וקונופקה כינו פער זה "אנומליה של ספירת הלוחות הגדולה"¹. המגוון המשוער שאינו מוסבר נתמך על ידי נתונים מטאגנומיים ומטה-טרנסקריפטומיים המראים סוגים חדשים רבים המופצים בעקומות שפע דרגות מסביבות שונות². מיקרואורגניזמים שנצפו (בדרך כלל על ידי ריצוף אקראי של רובה ציד של קהילה מיקרוביאלית) אך לא תורבתו כונו "חומר אפל מיקרוביאלי"^3,4.

בעידן האומיקס, גידול מיקרואורגניזמים נותר הכרחי כדי להעריך באופן מלא נתונים גנומיים ולאמת את הפונקציה/פנוטיפ של הגנים הנוכחיים. ריצוף מיקרואורגניזמים בתרבית הוא עדיין הדרך היחידה להשיג בביטחון גנומים שלמים עד שטכנולוגיות כגון מטגנומיקה של רובה ציד וגנומים שהורכבו מטא-גנום מהסביבה יהפכו לבלתי קבילות^{לטעות 5}. הערכות גנומיות יחד עם מיקרואורגניזמים בתרבית מספקות מסקנות חזקות להבנת "חומר אפל מיקרוביאלי". חברים רבים ב"חומר האפל המיקרוביאלי" מבצעים תפקידים חיוניים המשפיעים על מחזור חומרי מזון ואלמנטים אחרים ועל ייצור מוצרים טבעיים יקרי ערך, תומכים במערכות אקולוגיות ומבצעים שירותים אקולוגיים. מבחינה רפואית, כמחצית מכלל התרופות המשווקות כיום הן מוצרים ונגזרות של מוצרים מחיידקים, ופרופיל זנים לא מתורבתים חשוד כחושף את האנטיביוטיקות של העתיד. כדי לקבל גישה לרוב חסר תרבות זה, יש להגדיל מגוון של מתודולוגיות טיפוח⁶. בקרב חברי "החומר האפל המיקרוביאלי", מיקרואורגניזמים אוליגוטרופיים אנאירוביים אינם מדווחים במידה רבה, וסביר להניח שהם מחזיקים במסלולים ביוכימיים בעלי ערך אקולוגי ותעשייתי⁷, מה שהופך אותם למטרות חשובות של תרבית. עם זאת, מיקרואורגניזמים אוליגוטרופיים אנאירוביים קשים יותר לתרבית מאשר עמיתיהם האירוביים והקופיוטרופיים בשל זמני דגירה ארוכים יותר הנדרשים לעתים קרובות, תנאים קפדניים (למשל, טמפרטורות מבחנה לא סטנדרטיות מסוימות), ושימוש במתכוני מדיה מיוחדים.

הטכניקות המתפתחות כיום לתרבית חברי "החומר האפל המיקרוביאלי", כולל מיקרואורגניזמים אוליגוטרופיים אנאירוביים חדשניים, שיפרו מאוד את הבנתנו והגדילו את הייצוג של מיקרואורגניזמים אלה בתוך העץ הפילוגנטי. ניתן להפריד את הטכניקות הנוכחיות המשתמשות במדיה מושכלת לטיפוח מיקרואורגניזמים חדשים (כלומר, מדיה הנגזרת באמצעות ידע על המיקרואורגניזמים/ים המעניינים) לשלוש שיטות נפרדות. הראשונה מבין השיטות כרוכה בהסרה ישירה של חלק נפרד מהסביבה לצורך העברה לתא גדילה במבחנה שכבר מכיל את המיקרואורגניזמים המעניינים בתוך הממברנה. החלק הבדיד (למשל, מי ים) פועל כדי לספק למיקרואורגניזמים המעניינים את בית הגידול הגיאוכימי שבו הם משתמשים באתרם, בעוד שהממברנה עוצרת את תנועת התאים על פני (תאים בעלי עניין יישארו בפנים; תאים חיצוניים שהגיעו עם החלק הבדיד יישארו בלי). על ידי הכללת תרכובות הזמינות באופן טבעי למיקרואורגניזמים בסביבתם הטבעית, מיקרואורגניזמים כאלה יכולים להיות מתורבתים⁸. השיטה השנייה משתמשת במטא-טרנסקריפטומיקה או גנומיקה כדי להבהיר יכולות מטבוליות, ומספקת רמזים לפרמטרים צרים של תרבית לתכנון מדיום ממוקד. גישה זו מספקת פרופיל אקו-פיזיולוגי שניתן להשתמש בו כדי להתמקד בהעשרה של סוגים ספציפיים של מיקרואורגניזמים מחוץ לסביבה. הוראות המדיום מותאמות לגנים המזוהים הנוכחיים הנחזים לתמוך במיקרואורגניזמים הממוקדים כדי להפחית את מגוון ההעשרה,9,10. אזהרה אחת היא שמידע גנומי אינו מסיק ישירות את ביטוי הגנים, בעוד שמידע שעתוק כן.

השיטה השלישית כוללת מדיה מודעת סביבתית ומדומה, להבדיל מהשיטה הראשונה, שאינה מדמה את המדיה אלא משתמשת בסביבה ישירות כמקור לתקשורת. שיטה שלישית זו דורשת סיור סביבתי של הגיאוכימיה של אתר שדה המכיל מיקרואורגניזמים בעלי עניין. בעזרת ידע זה, רכיבים ראשוניים ופרמטרים פיזיים מזוהים כדי לייצר מדיום מדומה מודע לסביבה. לאחר מכן התווך מקבל עירוי ישיר של משקעים או נוזלים המכילים מיקרואורגניזמים מהסביבה לתוך המדיום. שיטה זו היא בעלת ערך מיוחד במקרים בהם למיקרוביולוג המטפח אין גישה לכמויות מספיקות של סביבת מקור (לפי הצורך בשיטה הראשונה) וגם לא לנתונים מטא-תעתוקים או גנומיים מתאימים (לפי הצורך בשיטה השנייה).

הפרוטוקול הבא הוא דוגמה לשיטה השלישית; הוא מושכל על ידי ומטרתו לדמות סביבות עניין. שלושה מתכוני מדיה נאיביים המכוונים לתרביות מיקרואורגניזמים אנאירוביות שונות שנרכשו בתחום מוצגים במקביל בתוך הפרוטוקול. שלוש התרבויות המיוצגות הן תרבויות מעורבות שמקורן באדמה (להלן: תרבית מעורבת קרקע), תרבויות מעורבות שמקורן מתוך קידוח (להלן: תרבית מעורבת בקידוח), ומתאנוגן מבודד שמקורו בתוך קידוח (להלן: מתאנוגן מבודד מקידוח). הזהויות והכמויות המורכבות במתכוני המדיה המשותפים כאן נועדו לשמש מדריך מתחיל; הם מסוגלים ומעודדים להיות מותאמים אישית לסביבה של הקורא ומיקרואורגניזמים של עניין.

Protocol

1. ייצור מדיום נוזלי אנאירובי הניתן להתאמה אישית

1. בינוני לבקבוקי תרבית (ייצור של 500 מ"ל)
   1. למדוד ולהוסיף תרכובות לבקבוק 1 ליטר ולהתאים את ה- pH באמצעות העמודה בטבלה 1 המתאימה לתרבות העניין של הקורא (הכמויות בטבלה 1 נרשמות לייצור של 1,000 מ"ל, התאם בהתאם). מערבבים תרכובות להומוגניות על ידי ערבול הבקבוק.
   2. מחממים את הנוזל לרתיחה על ידי גלישה במיקרו של הבקבוק במשך 5-6 דקות. פתחו את המיקרוגל לעתים קרובות וערבלו את הנוזל בעדינות באמצעות כפפה עמידה בחום. פתח את המיקרוגל במהירות אם הנוזל הולך עדיין לאחר מבעבע; אחרת, הנוזל עלול להתרחב במהירות ולהציף את הבקבוק.
   3. חבר פיפטת זכוכית סטרילית של 10 מ"ל למערך סעפת גז N₂ (מבוסס על העיצוב של Balch et ^al.11, אם כי לא דורש עמוד נחושת מחומם עבור גז N₂ של טוהר; ראה קובץ משלים 1 למידע נוסף על סעפת גז). פתח את הסעפת כדי לאוורר את O₂ ואפשר לגז N₂ לזרום החוצה.
   4. מניחים את קצה הפיפטה לתוך הנוזל ולהתאים את זרימת הגז כך בועות נמרצות למדי. שטפו את הנוזל עם N₂ עד שהבקבוק כבר לא חם מדי למגע.
      הערה: הדבר תלוי בתוכן המדיה אך בדרך כלל נמשך ~20 דקות.
   5. בזמן ההמתנה שהבקבוק יתקרר, הניחו 10 בקבוקי תרבית סטריליים של 100 מ"ל; או אם מכינים מדיה לאיסוף תרבית מעורבת באדמה, הניחו שני בקבוקים סטריליים של 500 מ"ל.
   6. ברגע שבקבוק המדיה קריר למגע, משכו את קצה הפיפטה כלפי מעלה לתוך חלל הראש של הבקבוק. הוסף 0.125 גרם של NaHCO₃ ו 0.300 גרם של Na₂S∙9 H₂O והמתן עד resazurin הופך חסר צבע.
      זהירות: Na₂S∙9 H₂O הוא חומר מאכל, רעיל ומגרה. יש להשתמש בציוד מגן אישי בעת הטיפול ולשטוף היטב כלי מתכת לאחר מגע.
   7. בזמן ההמתנה לרזורין שישנה את צבעו, חברו צינוריות מתכת למערך סעפת הגז והכניסו את קצות הצינוריות לבקבוקי תרבית. התאימו את זרימת N₂ לבקבוקים לקצב מתון, כך שהנוזל שנוסף בשלב הבא לא יישפך בגלל זרימת הגז.
   8. ברגע resazurin הוא חסר צבע, aliquot 50 מ"ל של נוזל לתוך כל בקבוק תרבית או 250 מ"ל של נוזל לתוך כל בקבוק 500 מ"ל.
   9. מכסים כל בקבוק בפקק גומי בגודל תואם מיד לאחר הסרת הצינוריות. הדקו את הפקק באמצעות אטם אלומיניום (לבקבוקי תרבית) או פקק בורג פתוח GL45 (לבקבוקי 500 מ"ל).
   10. הניחו את הבקבוקים בפח הניתן להרכבה ומלאו את הפח במי ברז עד שמפלס המים יהיה זהה לזה שבבקבוקים.
       הערה: פעולה זו תבטיח שהבקבוקים לא ייקרעו עקב לחץ הנגרם על ידי הפרשי טמפרטורה על הזכוכית בזמן אוטוקלאבינג.
   11. הבקבוקים בטמפרטורה של 121°C למשך 30 דקות.
2. בינוני לביוריאקטור (ייצור של 8 ליטר)
   1. הכנת קארבוי
      1. פתח את השסתום של שסתום כדורי צינור בגודל 1/4 אינץ' (6.4 מ"מ). חבר שני צינורות סיליקון בקוטר 6 ס"מ בקוטר פנימי (ID) בקוטר 1/4 אינץ' (ID) ובקוטר חיצוני (OD) בקוטר 1/2 אינץ' (12.7 מ"מ) לשני קצות שסתום כדור הצינור.
      2. חבר לקצה אחד של המכלול מתאם מוט צינור בגודל 5/16 אינץ' -1/4 אינץ' (7.9 מ"מ-6.4 מ"מ). חבר את הקצה השני של המכלול למוט הצינור של קארבוי 8 ליטר.
      3. השתמש באזיקון רוכסן כדי לאבטח את החיבור בין מוט הצינור של הקרבוי לבין הצינור, ואת החיבור בין מתאם מוט הצינור לבין הצינור.
      4. Autoclave carboy עם הרכבה ב 121 ° C במשך 30 דקות.
   2. ייצור בינוני
      1. סגור את השסתום של שסתום כדור הצינור במכלול 8 ליטר carboy.
      2. למדוד ולהוסיף תרכובות לקארבוי 8 ליטר ולהתאים את ה- pH באמצעות העמודה בטבלה 1 המתאימה לתרבות העניין של הקורא (הכמויות בטבלה 1 נרשמות לייצור של 1,000 מ"ל, התאם בהתאם). הוסיפו ערבוב והשתמשו בצלחת ערבוב כדי לערבב את התרכובות להומוגניות.
      3. מחממים את הנוזל לרתיחה בעזרת הפלטה החמה הבוחשת. מניחים לנוזל לרתיחה למשך 30 דקות.
         הערה: חימום הנוזל לרתיחה תלוי בתכולת המדיה אך יכול להימשך 2-3 שעות.
      4. חבר פיפטת זכוכית סטרילית של 10 מ"ל למערך סעפת גז N₂ (מבוסס על העיצוב של Balch et ^al.11, אם כי לא דורש עמוד נחושת מחומם עבור גז N₂ של טוהר; ראה קובץ משלים 1 למידע נוסף על סעפת גז). פתח את הסעפת כדי לאוורר את O₂ ואפשר לגז N₂ לזרום החוצה.
      5. מכבים את החום, ואז מניחים את קצה הפיפטה לתוך הנוזל, ומתאימים את זרימת הגז כך שהבועות יהיו נמרצות במידה בינונית אך לא יעלו על גדותיהן. שטפו את הנוזל עם N₂ למשך 30 דקות.
      6. משכו את קצה הפיפט כלפי מעלה אל חלל הראש של הקארבוי. הוסף 2.0 גרם של NaHCO₃ ו 4.8 גרם של Na₂S∙9 H₂O, והמתן עד resazurin הופך חסר צבע.
         זהירות: Na₂S∙9 H₂O הוא חומר מאכל, רעיל ומגרה. יש להשתמש בציוד מגן אישי בעת הטיפול ולשטוף היטב כלי מתכת לאחר מגע.
      7. ברגע resazurin הוא חסר צבע, להסיר פיפטה זכוכית מיד מכסה את carboy עם פקק #10. סובב חוט מעל הפקק וסביב שפת הפקק כדי לאבטח את הפקק.

2. רכישה באתרו של מיקרואורגניזמים אנאירוביים סביבתיים

1. רכישת דגימה אנאירובית משטח (תרבית מעורבת קרקע)
   1. הביאו את הבקבוק/ים של מצע תרבית אדמה מעורבת שנעשה כנ"ל וקורר לשטח.
      הערה: סיבית אדמה סטנדרטית של Giddings 2 5/8" משמשת את המחברים (Table of Materials). עם זאת, ניתן להשתמש בכל קורר אדמה או מגבת שניתן לדגום לעומק הרצוי.
   2. דחפו (כונן ערימה/יתד) את הקורר לתוך המשקע עד שהחלק העליון של גליל איסוף הדגימות יהיה סמוק עם פני השטח של המשקע.
   3. סובבו את הליבה ב-90° כדי לשחרר את הליבה ומשכו כלפי מעלה עד למיצוי הדגימה מהסביבה.
   4. במשקעים רופפים (כמו אלה שעלולים להיתקל בהם בעת דגימת ביצות), כסו את בסיס הליבה ביד חדשה עטופה בכפפת ניטריל בזמן השאיבה כדי למנוע מהדגימה לנשור או להתפשט למים בעת השאיבה.
   5. מקורב במהירות על ידי העין 6-7 ס"מ למעלה מבסיס הליבה. השתמשו ביד חדשה עטופה בכפפות ניטריל כדי לחתוך לתוך הליבה ולהפריד את החלק התחתון 6-7 ס"מ.
   6. מעבירים מיד את תחתית הליבה לבקבוק התרבית. אם האדמה/משקעים גדולים מדי, צרו אותם במהירות כך שיכנסו לבקבוק ביתר קלות, תוך צמצום החשיפה לאטמוספירה האירובית ככל האפשר.
   7. לאחר העברת הדגימה, מקם מיד מחדש את הפקק והחזק אותו במקומו עם מכסה בורג.
   8. שמרו על קרירות הדגימה. יש לשמור בקירור את בקבוק האיסוף בטמפרטורה של 4°C עם חזרתו למעבדה.
2. רכישת דגימה אנאירובית מתחת לפני השטח (תרבית מעורבת בקידוח)
   1. הניחו בקבוק סטרילי של 1 ליטר ליד סעפת הגז. מכסים את הבקבוק עם פקק גומי. טפטפו 100% אתנול על הפקק והציתו אותו באמצעות מצית.
   2. חבר מחט סטרילית של 23 G למערך סעפת הגז N₂ . פתח את הסעפת כדי לאוורר את O₂ ואפשר לגז N₂ (או Ar) לזרום החוצה בקצב מתון.
   3. ברגע שהפקק כבר לא בוער, הכנס את המחט לתוך הבקבוק. הכנס מחט סטרילית שנייה של 23 גרם שאינה מחוברת לסעפת הגז לתוך הבקבוק. שוטפים את הבקבוק למשך 1-2 דקות.
   4. חלצו את המחט שאינה מחוברת לסעפת הגז. יש ללחוץ על הבקבוק למשך דקה. חלצו את המחט הנותרת.
   5. הביאו את הבקבוק בלחץ ומחט 23 גרם מעוקרת לאתר הקידוח. לשאוב נוזל מהקידוח בעקבות השיטות של Merino et ^al.12.
      הערה: בהתאם לשיטה, לחיבור ולקצב הזרימה של הקידוח, הדבר משנה את האסטרטגיה של רכישת דגימת מים. אם יש זרימה רציפה של מים, איסוף מים כמתואר בשלב 2.2.6. יספיק. אם זרימת המים נאספת באצווה או זרימה נמוכה, ניתן להשתמש בשיטת כניסה/יציאה חלופית. בכל המצבים, מזערו את הזיהום, ונסו לוודא שהדגימה שנאספה מייצגת את הסביבה הרצויה לדגימה. זוהי אמירה כללית באופן רחב מכיוון שהניסיון של המחברים היה שכל אירוע איסוף דגימות מאתרים ממשלתיים או פרטיים היה צריך להיות מותאם מאוד לנגישות הזמינה.
   6. פתחו את הבקבוק במהירות, שאבו פנימה נוזלים כדי למלא את הבקבוק במלואו וסגרו את הבקבוק.
   7. הכנס את מחט 23 G שהובאה למקום לתוך פקק הגומי של הבקבוק כדי להקל על הלחץ בבקבוק. חלצו את המחט.
   8. שמרו על קרירות הדגימה. יש לשמור בקירור את בקבוק האיסוף בטמפרטורה של 4°C עם חזרתו למעבדה.

3. גידול חוץ גופי של מיקרואורגניזמים אנאירוביים שנרכשו בשטח

1. גידול לפי בקבוק תרבית
   1. הוציאו בקבוק סטרילי פקק של N₂ ואת בקבוקי התרבית ובקבוק האיסוף שהוכנו כנ"ל. טפטפו 100% אתנול על הפקקים והציתו אותם באמצעות מצית.
   2. להרכיב מחט 23 גרם על מזרק 1 מ"ל. ברגע שהפקקים כבר לא בוערים, הכנס את המחט לבקבוק N₂ וצייר ~ 1 מ"ל של N₂. חלצו את המחט.
   3. לחץ באיטיות על הבוכנה כדי לשחרר את N₂. ברגע שהמזרק ריק, הכנס את המחט לבקבוק האיסוף וצייר 0.5 מ"ל של הדגימה הסביבתית. חלצו את המחט.
   4. הכניסו את המחט לבקבוק התרבית והזריקו את הדגימה. חלצו את המחט.
   5. מערבלים את הבקבוק ומניחים אותו באינקובטור בטמפרטורה, כפי שעולה מטבלה 1 או מסביבת העניין של הקורא.
      הערה: התקדמות התרבית (בקבוק או ביוריאקטור) מנוטרת באמצעות המוציטומטר פטרוף-האוזר בעומק 0.02 מ"מ. העשרה של מיקרואורגניזמים אנאירוביים או מהירים בדרך כלל אינה מגיעה לצפיפויות תאים שבהן OD₆₀₀ שמיש, ושיטות זיהוי אחרות אינן מעשיות לניטור שגרתי וחוזר. מגבלות זיהוי, בקרת איכות וחישובים סטטיסטיים תלויים בסוג תא ספירת התאים ובצרכי המשתמש.
2. גידול על ידי ביוריאקטור
   1. הכנת בלון עם מזרק שונה
      1. הסר את הבוכנה משלושה מזרקי נעילה של 10 מ"ל (אחד לכל הרכבה סופית). חותכים את האוגן מכל מזרק וממלאים את הקצה הכרות כדי שלא ינקב את הבלונים. נקה את כל השבבים מתויקים מתוך מזרק שונה.
      2. הכינו בלון כפול על ידי הנחת בלון אחד בתוך בלון אחר.
      3. מותחים את קצה הבלון המוכפל מעל מזרק 10 מ"ל שונה.
      4. מפרידים מעט בין קצה הבלון החיצוני לבלון הפנימי. סחטו החוצה את כל האוויר הכלוא בין הבלונים.
      5. הדקו את האזיקון סביב בסיס הבלונים כדי להצמיד את הבלונים למזרק.
   2. הכנת פקק שונה
      1. הסר את הבוכנות מעשרה מזרקי נעילה של 1 מ"ל (שניים לכל פקק שיש לשנות). חותכים את האוגן מהמזרקים.
      2. הגדר שני פקקי גומי בגודל #10 (עבור 8 L carboys) ושלושה גדלים עבור בקבוקים עם גימור חוט GL45 (עבור בקבוקי תפיסה). באמצעות מקדח בגודל 1/4 אינץ' (6.4 מ"מ), קדח שני חורים דרך החלק העליון של כל פקק גומי רחב מספיק כדי שהמזרקים ששונו יתאימו וצרים מספיק כדי שההתאמה תהיה אטומה.
      3. הכנס את המזרקים שהשתנו דרך החורים של פקק הגומי.
      4. נקה ובצע autoclave את הפקק שונה ב 121 ° C למשך 30 דקות.
   3. הכנת מכלול הביוריאקטור
      1. יש לחטא עם 70% אתנול את כל הסטופקוקים, מחברי מתאם נעילת הלואר הנשי וחומרים ביוריאקטורים אחרים שאינם ניתנים להרכבה, ואוטוקלאבה בטמפרטורה של 121°C למשך 30 דקות את כל הצינוריות (לאחר חיתוך לאורך), פקקים, צמר זכוכית וחומרים ביוריאקטורים אחרים הניתנים להרכבה.
      2. הניחו ביוריאקטור סטרילי (איור 1 ואיור 2) על מעמד טבעתי ואבטחו אותו באמצעות רצועת שרשרת. כמו כן הוצבו אמבט מים, משאבה פריסטלטית, קרבוי 8 ליטר פקק המכיל מדיום (משלב פרוטוקול 1.2), בקבוק 3.5 ליטר אחד (בקבוק תפיסה ללא דגימה), ובקבוק אחד של 500 מ"ל (בקבוק תפיסת דגימה).
      3. לעצור את הקארבוי
         1. מוציאים בלון עם מזרק מותאם. חברו סטופקוק תלת-כיווני לקצה נעילת הפיתוי של המזרק.
         2. קח את מכלול הבלונים וחבר את הסטופקוק התלת-כיווני לצינורות של מיכל N₂. סובב את הסטופקוק המשולש כדי לחסום את הקצה הפתוח לאטמוספירה.
         3. פתחו את מיכל הדלק ומלאו את הבלון ב-N₂. לאחר שהתמלא, סובב את הסטופקוק המשולש כדי לחסום את הקצה לבלון. סגור את מיכל הדלק ונתק את צינור המיכל מהסטופקוק התלת-כיווני.
         4. חבר את הדברים הבאים ברצף: סטופקוק תלת-כיווני (של הבלון עם המזרק שהשתנה), סטופקוק דו-כיווני, מצמד מתאם נעילת פיתוי נשי, וקצה מנעול הפיתוי של אחד המזרקים של הפקק שהשתנה.
         5. לקצה נעילת הפיתוי של המזרק השני, חברו סטופקוק דו-כיווני. סגור את שני השסתומים של הסטופקוקים הדו-כיווניים במכלול הפקק השונה.
         6. בטל את החוט המחזיק את פקק #10 בגודל #10 של הקארבוי. החלף במהירות את הפקק שלא השתנה במכלול הפקק שהשתנה וסובב את החוט כבעבר כדי לאבטח את מכלול הפקק שהשתנה לרכב.
            הערה: אם אתה בטוח ומוכן, ניתן להשתמש במכלול הפקק שהשתנה כדי לעצור את הקארבוי בשלב הסופי של הכנה בינונית (שלב 1.2.2.7).
         7. סובב את הסטופקוק המשולש כדי לחסום את הקצה הפתוח לאטמוספירה. פתח את הסטופר הדו-כיווני ברצף. הגז של הבלון ומרחב הראש של הקארבוי 8 ליטר מחוברים כעת.
      4. עצירת בקבוקי התפיסה ללא דגימה ודגימה
         1. פקק את בקבוק התפיסה ללא דגימה בנפח 3.5 ליטר עם פקק מותאם בגודל לבקבוקים עם גימור חוט GL45, תוך מריחת 70% אתנול על בסיס הפקק כדי לסייע בהכנסתו לבקבוק. יש לסגור את הבקבוק עם פקק בורג פתוח GL45.
         2. חבר את הדברים הבאים ברצף: בלון עם קצה נעילת הלואר של המזרק שהשתנה, סטופקוק תלת-כיווני, מצמד מתאם נעילת luer נקבה וקצה נעילת luer של אחד המזרקים של הפקק שהשתנה. סובב את הסטופקוק המשולש כדי לחסום את הקצה פתוח ישירות לאטמוספירה.
         3. לקצה מנעול הפיתוי של המזרק השני, חברו מצמד מתאם נעילה נשי.
         4. חזור על שלושת השלבים לעיל עבור בקבוק הדגימה 500 מ"ל.
      5. התקנת צינורות
         1. מדוד את המרחק בין יציאות מעיל המים של הביוריאקטור לבין מוטות צינור אמבט המים. חתכו שני אורכים של 3/16 אינץ' (4.8 מ"מ) ID, 3/8 אינץ' (9.5 מ"מ) צינורות סיליקון OD כדי לחצות מרחק זה.
         2. הרכיבו שני מחברי צינורות ישרים עם מכסי ברגים פתוחים GL14. חברו כל אחד מהם לקצה אחד של שני חלקי הצינורות.
         3. סובב את מכסי הברגים אל יציאות מעיל המים של הביוריאקטור. חברו את הקצוות האחרים של הצינור לצינורות אמבט המים כך שהמים יזרמו החוצה מאמבט המים, ייכנסו לתחתית מעיל המים של הביוריאקטור, יצאו בחלק העליון של מעיל המים ויחזרו לאמבט המים. הדקו את האזיקונים סביב קצות הצינור כדי לאבטח את הצינור לצינורות צינור המים.
         4. עבור משאבות הדומות למיני-משאבת VWR Ultra Low Flow Variable Flow Mini-Pump, יש להשחיל את מכלול הצינור המחורץ OD הנלווה בגודל 3/16 אינץ' (4.8 מ"מ) דרך המשאבה.
         5. מדוד את המרחק בין מכלול צינורות הקרבוי למכלול צינורות המשאבה הפריסטלטיים. חתך אורך של 3/16" (4.8 מ"מ) ID, 3/8" (9.5 מ"מ) צינורות סיליקון OD כדי לחצות מרחק זה.
         6. חבר קצה אחד של הצינור למוט הצינור של מכלול צינורות הקרבוי ואת הקצה השני למוט הצינור של מכלול צינורות המשאבה הפריסטלטית, בכיוון כך שהתווך יזרום מהקארבוי ודרך המשאבה הפריסטלטית.
         7. מדוד את המרחק בין מכלול צינורות המשאבה הפריסטלטית לבין היציאה התחתונה של הביוריאקטור. חתך אורך של 3/16" (4.8 מ"מ) ID, 3/8" (9.5 מ"מ) צינורות סיליקון OD כדי לחצות מרחק זה.
         8. חבר קצה אחד של צינור זה לצינור של מכלול צינורות המשאבה הפריסטלטית וחבר בזהירות את השני ליציאה התחתונה של הביוריאקטור. נזהרים לא לסדוק את הזכוכית אלא גם לאבטח את החיבור, הדקו אזיקון סביב קצה הצינור כדי לאבטח את הצינור ליציאה התחתונה של הביוריאקטור.
         9. מדוד וחתוך כ-5 אינץ' (127 מ"מ) אורך של 3/16 אינץ' (4.8 מ"מ) ID, צינורות סיליקון OD 3/8 אינץ' (9.5 מ"מ).
         10. חבר מחבר מתאם נעילה נשי לסטופקוק תלת-כיווני. חבר כל קצה של הסטופקוק המשולש לצינור.
         11. הרכיבו מחבר צינור זוויתי אחד עם מכסה בורג פתוח GL14. חברו אותו לקצה השני של הצינור.
         12. סובב את מכסה הבורג ליציאה האנכית העליונה של הביוריאקטור. סובב את הסטופקוק המשולש כדי לחסום את הקצה והצביע על הביוריאקטור.
         13. מדוד את המרחק בין מכלול היציאה האנכי העליון לבין מכלול בקבוק התפיסה שאינו דגימה. חתך אורך של 3/16" (4.8 מ"מ) ID, 3/8" (9.5 מ"מ) צינורות סיליקון OD כדי לחצות מרחק זה. חותכים את האוגנים משני מזרקי נעילה של 1 מ"ל ומכניסים אותם לקצוות הצינור.
         14. חבר קצה אחד של מכלול צינורות זה לסטופקוק התלת-כיווני של מכלול היציאה האנכי העליון ביותר וחבר את הקצה השני למחבר מתאם נעילת הפיתוי הנשי במכלול בקבוק התפיסה ללא דגימה.
         15. מדוד את המרחק בין מכלול היציאה האנכי העליון לבין מכלול בקבוק הדגימה. חתך אורך של 3/16" (4.8 מ"מ) ID, 3/8" (9.5 מ"מ) צינורות סיליקון OD כדי לחצות מרחק זה. חותכים את האוגנים משני מזרקי נעילה של 1 מ"ל ומכניסים אותם לקצוות הצינור.
         16. חבר קצה אחד של מכלול צינורות זה לסטופקוק התלת-כיווני של מכלול היציאה האנכי העליון ביותר וחבר את השני למחבר מתאם נעילת הפיתוי הנשי במכלול בקבוק תפיסת הדגימה.
   4. מילוי הביוריאקטור
      1. מכסים את אחת מיציאות GL18 של הביוכור עם מחיצת גומי לבנה. יש לסגור את יציאת GL18 השנייה ואת יציאות GL14 החשופות אנכית הנותרות עם PTFE בגודל GL18/GL14 הפונה לסיליקון ספטה (PTFE מול הזכוכית) ומכסי ברגים עליונים פתוחים.
      2. בעזרת מוט באורך 50 ס"מ, יש לארוז 0.9 גרם של צמר זכוכית בבסיס הביוריאקטור.
      3. Autoclave 1.3 ליטר של חול ב 121 ° C במשך 30 דקות. מלאו את הביוריאקטור בחול באמצעות משפך.
         הערה: ניתן להחליף כאן סוגי משקעים אחרים המבוססים על סביבת הקורא ומיקרואורגניזמים בעלי עניין.
      4. הניחו את הצינור במיכל של N₂ לחלק העליון של הביוריאקטור ושטפו את ראש הביוריאקטור עם N₂ למשך 2 דקות. סגרו מיד את הביוריאקטור עם פקק בגודל #7 ומכסה בורג פתוח GL45.
      5. מבקבוק התפיסה שאינו דוגם, נתקו את הצינור וסובבו את הסטופקוק התלת-כיווני כדי לחסום את הקצה המצביע על הבלון. חבר את הצינור למיכל של N₂ למחבר מתאם נעילת הלואר הנשי ושטוף את מרווח הראש של הביוריאקטור עם N₂ למשך 2 דקות. מיד לחבר מחדש את הצינור ולהחזיר את הסטופקוק המשולש כדי לחסום את הקצה הפתוח לאטמוספירה.
      6. חזור על השלב לעיל עבור בקבוק הדגימה.
      7. סובב את הסטופקוק התלת-כיווני של היציאה האנכית העליונה של הביוריאקטור כדי לחסום את הקצה והצביע על בקבוק הדגימה. יש לשאוב נוזלים מהקארבוי לתוך הביוריאקטור. עצרו את המשאבה, אווררו את בלון בקבוק הדגימה, ומלאו את בלון הקארבוי ב-N₂ לפי הצורך.
      8. לאחר שהביוריאקטור התמלא בתווך, הגדר את קצב זרימת המשאבה ל- 0.6 מ"ל לדקה (ערך דיגיטלי של 40 במשאבת המיני).
         הערה: ניתן להחליף קצבי זרימה אחרים הרצויים לקורא כאן.
      9. הגדר את טמפרטורת אמבט המים, כפי שהיא מעודכנת בטבלה 1 או בסביבת העניין של הקורא.
         הערה: ניתן להוסיף Inoculum בשלב זה או מאוחר יותר, בהתאם לפרטי המחקר. אם אתם מחוסנים בשלב זה, המשיכו לשלב 3.2.4.10. אם החיסון מאוחר יותר, המשך לשלב 3.2.5.
      10. הניחו בקבוק איסוף או בקבוק תרבית מחוסן ובקבוק סטרילי פקק של N₂. טפטפו 100% אתנול על הפקקים והציתו אותם באמצעות מצית.
      11. להרכיב מחט 23 גרם על מזרק 60 מ"ל. ברגע שהפקקים כבר לא בוערים, הכנס את המחט לבקבוק N₂ וצייר ~ 50 מ"ל של N₂. חלצו את המחט.
      12. לחץ באיטיות על הבוכנה כדי לשחרר את N₂. ברגע שהמזרק ריק, הכנס את המחט לבקבוק האיסוף וצייר 50 מ"ל של הדגימה הסביבתית. חלצו את המחט.
      13. החליפו את מחט 23 גרם במחט מתכת סטרילית ארוכה (צינורית, אורך 31.5 ס"מ). הכנס את מחט המתכת הארוכה דרך מחיצת הגומי הלבנה ביציאת GL18 של הביוריאקטור.
      14. דוחפים את המחט לתוך המשקע ומזריקים את החיסון. חלצו את המחט.
   5. הפעלת תחזוקת ביוריאקטורים
      1. בכל יום שבו הביוריאקטור פועל, בצע את הפעולות הבאות:
         1. בדוק את מפלס אמבט המים. אם הם נמוכים, הוסיפו עוד מים (השתמשו במים מזוקקים לאריכות ימים של הציוד על ידי הפחתת קורוזיה והצטברות מינרלים).
         2. בדוק את הבלון של בקבוק התפיסה שאינו דגימה; בלון מלא יעכב את זרימת התווך. כאשר הוא מלא, סובב את הסטופר המשולש כדי לחסום את הקצה והצביע על בקבוק התפיסה. לסחוט את הבלון כדי לרוקן אותו; לאחר מכן, להחזיר את הסטופקוק המשולש כדי לחסום את הקצה הפתוח לאטמוספירה; חזור על הפעולה עד שהבלון מתרוקן.
         3. בדוק את הבלון של 8 ליטר carboy. אם הוא נמוך, סגור את הסטופקוק הדו-כיווני ברצף ונתק את הסטופקוק התלת-כיווני מהסטופקוק הדו-כיווני. מלא מחדש וחבר מחדש את מכלול הבלון לפי השלבים 3.2.3.3.2, 3.2.3.3.3 ו- 3.2.3.3.7.
         4. בדוק את רמת המדיום בקרבוי 8 ליטר. אם נמוך, להרכיב עוד 8 ליטר carboy ולהכין בינוני יותר בעקבות פרוטוקול שלבים 1.2. ו-3.2.3.3. השהה את המשאבה, סגור את שסתום כדור הצינור, נתק במהירות את הקארבוי הישן וחבר את הקארבוי החדש.
            הערה: עבור קצב זרימה של 0.6 מ"ל/דקה, יהיה צורך בתווך חדש כל 9 ימים.
         5. בדוק את רמת המדיום בבקבוק התפיסה שאינו דגימה. אם הוא מלא, יש להרכיב בקבוק נוסף ללא דגימה לפי שלב 3.2.3.4.1. שוטפים את הבקבוק החדש ב-N₂, מנתקים במהירות את הבלון עם המזרק והצינורית ששונו מהבקבוק הישן ומתחברים לבקבוק החדש.
         6. הסר את הפקק שהשתנה מבקבוק תפיסה מלא שאינו דגימה. Autoclave את הנוזל ב 121 °C במשך 30 דקות; לאחר מכן, השליכו את הנוזל בהתאם למדיניות המוסדית של הקורא. נקו ובצעו אוטוקלאבים של כל חלקי מכלול בקבוק התפיסה ללא דגימה כדי להכין אותם לשימוש הבא.
      2. בצע דגימה כל 7 ימים (או מספר רצוי של קוראים) על ידי ביצוע הפעולות הבאות:
         1. סובב את הסטופקוק התלת-כיווני של היציאה האנכית העליונה ביותר של הביוריאקטור כדי לחסום את הקצה והצביע על בקבוק התפיסה שאינו דגימה. לאסוף 250 מ"ל של נוזל.
            הערה: עבור קצב זרימה של 0.6 מ"ל/דקה, איסוף 250 מ"ל ייקח ~ 7 שעות.
         2. החזירו את הסטופקוק התלת-כיווני של היציאה האנכית העליונה של הביוריאקטור כדי לחסום את הקצה המצביע על בקבוק הדגימה. נתק את הצינור ואת בקבוק הדגימה מהסטופקוק התלת-כיווני של היציאה האנכית העליונה ביותר של הביוריאקטור.
         3. לאחר בדיקה, אחסון ו/או סילוק נכון של נוזל הדגימה, יש לנקות את כל חלקי מכלול בקבוק הדגימה למעט הבלון עם המזרק ששונה. Autoclave כל החלקים ב 121 ° C במשך 30 דקות למעט הבלון עם מזרק שונה ומחברי מתאם נעילת luer נקבה. הרכיבו מחדש ליום הדגימה הבא.
            הערה: מומלץ מאוד לבצע יתירות כפולה או משולשת של חלקים, מכסים, צינורות וספטה לצורך תיקון והחלפה מהירים במידת הצורך.

תוצאות

כאן אנו מציגים תוצאות ממחקר ביוריאקטור המשתמש בשיטת הכנה בינונית של תרבית מעורבת בקידוח ובשיטת התקנת ביוריאקטור כמתואר כאן. מדיום התרבית המעורבת בקידוח שונה כדי להכיל כמקור פחמן תרחיף של קלחי תירס שעובדו על ידי המסה הידרותרמית חמצונית (OHD)^13,14. מדיום תרבית מ...

Discussion

פרק הייצור הבינוני של פרוטוקול זה (סעיף 1) חב את מבנהו לטכניקת ההונגט השונה של מילר וולין¹⁷, שהייתה בשימוש נרחב מאז פרסומה. המעשיות של פרוטוקול מורחב זה נובעת מאופיו התיאורי ומהזיווג שלו עם רכישה באתרו של מיקרואורגניזמים. בקבוקי תרבית המכילים מדיה מדומה ומודעת לסביבה שימש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Materials
1 L borosillicate bottle	Fisher Scientific
1 mL syringe with slip tip	Fisher Scientific
10 mL glass pipette	Fisher Scientific
100 mL culture bottle	Fisher Scientifc
20 mm hand crimper	Fisher Scientifc
23 G needle	Fisher Scientifc
500 mL borosilicate bottle	Fisher Scientific
Aluminum seal	Fisher Scientifc
Cannula, 31.5 cm length	Fisher Scientific
Cannula, 6 cm length	Fisher Scientifc
Corer	Giddings Machine Company		Assembled from company parts
Gas manifold	Swagelok		Assembled from many different parts
Lighter	Lowe's
N2 gas	Airgas
Nitrile gloves	Fisher Scientific
Rubber stopper (for GL45 bottles)	Glasgeratebau OCHS
Rubber stopper (for culture bottles)	Ace Glass
Stirring hot plate	Corning
Trace minerals	ATCC
Vitamins	ATCC
Bioreactor-specific Materials
#10 rubber stopper	Ace Glass
#7 rubber stopper	Fisher Scientifc
1 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
1/4" hose barb ball valve	Amazon
10 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
3.5 L borosilicate bottle	Fisher Scientific
5/16" - 1/4" hose barb adapter fitting	Amazon
60 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
8 L borosillicate carboy	Allen Glass
Angled hose connector for GL14 open top cap	Ace Glass	7623-20
Balloon	Party City
Borosillicate bioreactor	Allen Scientific Glass		Custom made upon request
Drill	Lowe's
Female luer lock adapter coupler	Amazon
GL14 open top cap	Ace Glass	7621-04
GL18 open top cap	Ace Glass	7621-08
GL45 open top cap	Ace Glass
PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap	Ace Glass	7625-06
PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap	Ace Glass	7625-07
Ring stand	Fisher Scientific
Ring stand chain clamp	Amazon
Ring stand clamp	Fisher Scientific
Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od	Grainger	55YG13
Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od	Grainger
Straight hose connector for GL14 open top cap	Ace Glass	7623-22
Three-way stopcock	Amazon
Two-way stopcock	Amazon
Ultra low flow variable flow mini-pump	VWR
Water bath	Fisher Scientifc
White rubber septum for 13-18 mm od tubes	Ace Glass	9096-49
Wire	Lowe's
Zip tie	Lowe's