Eine Reihe von in situ informierten simulierten Medienformaten für die Kultivierung umweltbedingt erworbener anaerober Mikroorganismen

Zusammenfassung

Der Schwerpunkt dieses Papiers liegt auf der Beschreibung von Best Practices für die Herstellung von Medien für anspruchsvolle anaerobe Mikroorganismen, die aus einer Umgebung stammen. Diese Methoden helfen bei der Verwaltung anaerober Kulturen und können angewendet werden, um das Wachstum von schwer fassbaren, unkultivierten Mikroorganismen, der "mikrobiellen dunklen Materie", zu unterstützen.

Zusammenfassung

Die kulturabhängige Erforschung anaerober Mikroorganismen beruht auf Methodenkompetenz. Diese Methoden müssen geeignete Wachstumsbedingungen (z. B. pH-Wert und Kohlenstoffquellen) für anaerobe Mikroorganismen schaffen und aufrechterhalten und gleichzeitig die Entnahme von Proben ermöglichen, ohne die künstliche Umgebung zu beeinträchtigen. Zu diesem Zweck können Methoden, die von einer In-situ-Umgebung geprägt sind und diese simulieren, eine große Hilfe bei der Kultivierung von Mikroorganismen aus dieser Umgebung sein. Hier skizzieren wir eine in situ informierte und simulierte anaerobe Methode zur Kultivierung terrestrischer Oberflächen- und Unterwassermikroorganismen, wobei der Schwerpunkt auf der anaeroben Probenentnahme mit minimaler Störung liegt. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines anpassbaren anaeroben flüssigen Mediums sowie die Aufnahme und das In-vitro-Wachstum von anaeroben Mikroorganismen in die Umwelt. Das Protokoll deckt auch kritische Komponenten eines anaeroben Bioreaktors ab, der für Umweltsimulationen von Sedimenten und anaeroben flüssigen Medien für ökologisch erworbene Kulturen verwendet wird. Wir haben vorläufige Next Generation Sequencing-Daten aus einem erhaltenen Mikrobiom über die Lebensdauer eines Bioreaktors einbezogen, bei dem sich die aktive Kultur als Reaktion auf eine experimentelle Kohlenstoffquelle dynamisch anpasste.

Einleitung

Die meisten Mikroorganismen bleiben unkultiviert; Dies wird durch die große Ungleichheit zwischen den mikroskopisch beobachteten Zellen im Gegensatz zu den wenigen Mikroorganismen unterstützt, die erfolgreich mit Agarplatten kultiviert wurden. Staley und Konopka nannten diese Diskrepanz die "Great Plate Count Anomaly"¹. Die geschätzte unberücksichtigte Diversität wird durch metagenomische und metatranskriptomische Daten gestützt, die zeigen, dass viele neue Gattungen in Rangabundanzkurven aus verschiedenen Umgebungen verteilt sind². Mikroorganismen, die beobachtet wurden (in der Regel durch zufällig....

Protokoll

1. Herstellung eines anpassbaren anaeroben flüssigen Mediums

1. Medium für Kulturflaschen (Herstellung von 500 ml)
   1. Messen und fügen Sie Verbindungen in eine 1-Liter-Flasche hinzu und passen Sie den pH-Wert mithilfe der Spalte in Tabelle 1 an, die der interessierenden Kultur des Lesers entspricht (die Mengen in Tabelle 1 sind für die Produktion von 1.000 ml aufgezeichnet, entsprechend anpassen). Mischen Sie die Mischungen durch Schwenken der Flasche, um homogen zu sein.
   2. Erhitzen Sie die Flüssigkeit zum Kochen, indem Sie die Flasche 5-6 Minuten lang in der Mikrowelle erhitzen. Öffnen Sie die Mik....

Diskussion

Der Abschnitt über die mittlere Produktion dieses Protokolls (Abschnitt 1) verdankt seine Struktur der modifizierten Hungate-Technik von Miller und Wolin¹⁷, die seit ihrer Veröffentlichung weit verbreitet ist. Die Praktikabilität dieses erweiterten Protokolls ergibt sich aus seinem beschreibenden Charakter und der Kombination mit der In-situ-Erfassung von Mikroorganismen. Kulturflaschen mit umweltbewussten und simulierten Medien wurden erfolgreich verwendet, um die folgenden in sit.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Materials
1 L borosillicate bottle	Fisher Scientific
1 mL syringe with slip tip	Fisher Scientific
10 mL glass pipette	Fisher Scientific
100 mL culture bottle	Fisher Scientifc
20 mm hand crimper	Fisher Scientifc
23 G needle	Fisher Scientifc
500 mL borosilicate bottle	Fisher Scientific
Aluminum seal	Fisher Scientifc
Cannula, 31.5 cm length	Fisher Scientific
Cannula, 6 cm length	Fisher Scientifc
Corer	Giddings Machine Company		Assembled from company parts
Gas manifold	Swagelok		Assembled from many different parts
Lighter	Lowe's
N2 gas	Airgas
Nitrile gloves	Fisher Scientific
Rubber stopper (for GL45 bottles)	Glasgeratebau OCHS
Rubber stopper (for culture bottles)	Ace Glass
Stirring hot plate	Corning
Trace minerals	ATCC
Vitamins	ATCC
Bioreactor-specific Materials
#10 rubber stopper	Ace Glass
#7 rubber stopper	Fisher Scientifc
1 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
1/4" hose barb ball valve	Amazon
10 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
3.5 L borosilicate bottle	Fisher Scientific
5/16" - 1/4" hose barb adapter fitting	Amazon
60 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
8 L borosillicate carboy	Allen Glass
Angled hose connector for GL14 open top cap	Ace Glass	7623-20
Balloon	Party City
Borosillicate bioreactor	Allen Scientific Glass		Custom made upon request
Drill	Lowe's
Female luer lock adapter coupler	Amazon
GL14 open top cap	Ace Glass	7621-04
GL18 open top cap	Ace Glass	7621-08
GL45 open top cap	Ace Glass
PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap	Ace Glass	7625-06
PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap	Ace Glass	7625-07
Ring stand	Fisher Scientific
Ring stand chain clamp	Amazon
Ring stand clamp	Fisher Scientific
Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od	Grainger	55YG13
Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od	Grainger
Straight hose connector for GL14 open top cap	Ace Glass	7623-22
Three-way stopcock	Amazon
Two-way stopcock	Amazon
Ultra low flow variable flow mini-pump	VWR
Water bath	Fisher Scientifc
White rubber septum for 13-18 mm od tubes	Ace Glass	9096-49
Wire	Lowe's
Zip tie	Lowe's