Набор смоделированных сред in situ для культивирования анаэробных микроорганизмов, приобретенных в окружающей среде

Резюме

Основное внимание в этой статье уделяется подробному описанию передового опыта создания сред для привередливых анаэробных микроорганизмов, полученных из окружающей среды. Эти методы помогают управлять анаэробными культурами и могут применяться для поддержки роста неуловимых некультивируемых микроорганизмов, «микробной темной материи».

Аннотация

Культурально-зависимое исследование анаэробных микроорганизмов опирается на методологическую компетентность. Эти методы должны создавать и поддерживать подходящие условия роста (например, pH и источники углерода) для анаэробных микроорганизмов, а также позволять извлекать образцы без ущерба для искусственной среды. С этой целью методы, основанные на информации и моделирующие среду in situ, могут оказать большую помощь в культивировании микроорганизмов из этой среды. В этой статье мы описываем анаэробный метод культивирования наземных и подповерхностных микроорганизмов in situ , основанный на анаэробном отборе проб с минимальными возмущениями. В этом протоколе подробно описывается производство настраиваемой анаэробной жидкой среды, а также получение и выращивание анаэробных микроорганизмов в окружающей среде in vitro . Протокол также охватывает важнейшие компоненты анаэробного биореактора, используемого для моделирования условий окружающей среды осадка и анаэробных жидких сред для культур, полученных в окружающей среде. Мы включили предварительные данные секвенирования следующего поколения из поддерживаемого микробиома в течение всего срока службы биореактора, где активная культура динамически корректировалась в ответ на экспериментальный источник углерода.

Введение

Большинство микроорганизмов остаются некультивированными; Это подтверждается большим несоответствием между клетками, наблюдаемыми с помощью микроскопии, в отличие от нескольких микроорганизмов, успешно культивируемых с использованием агаровых пластин. Стейли и Конопка назвали это несоответствие «Аномалией большого количества плит»¹. Оценка неучтенного разнообразия подтверждается метагеномными и метатранскриптомными данными, показывающими множество новых родов, распределенных по ранговым кривым численности из нескольких различных сред². Микроорганизмы, которые были обнаружены (как правило, путем случайного секвенирования микробного сообщества), но не культивировались, были названы «микробной темной материей»^3,4.

В эпоху омиксов культивирование микроорганизмов остается обязательным условием для полной оценки геномных данных и проверки функции/фенотипа присутствующих генов. Секвенирование культивируемых микроорганизмов по-прежнему остается единственным способом уверенного получения полных геномов до тех пор, пока такие технологии, как метагеномика дробовика и метагеном, собранные из окружающей среды, не станут допустимо непогрешимыми^. Геномные оценки в сочетании с культивируемыми микроорганизмами дают убедительные выводы для понимания «микробной темной материи». Многие представители «микробной темной материи» выполняют важнейшие функции, влияющие на круговорот питательных и других элементов и производство ценных природных продуктов, поддерживают экологические системы и оказывают экологические услуги. С медицинской точки зрения, около половины всех продаваемых в настоящее время фармацевтических препаратов являются продуктами и производными продуктов из бактерий, и предполагается, что профилирование некультивируемых видов позволит выявить антибиотики будущего. Чтобы получить доступ к этому некультурному большинству, необходимо расширить разнообразие методологий культивирования^. Среди представителей «микробной темной материи» анаэробные олиготрофные микроорганизмы в значительной степени недоописаны и,^{вероятно, обладают} экологически и промышленно ценными биохимическими путями, что делает их важными мишенями для культивирования. Однако анаэробные олиготрофные микроорганизмы труднее культивировать, чем их аэробные и копиотрофные аналоги, из-за часто требуемого более длительного времени инкубации, привередливых условий (например, особых нестандартных температур in vitro ) и использования специализированных рецептур сред.

Современные методы культивирования членов «микробной темной материи», включая новые анаэробные олиготрофные микроорганизмы, значительно улучшили наше понимание и увеличили представленность этих микроорганизмов в филогенетическом древе. Существующие методы, использующие информированные среды для культивирования новых микроорганизмов (т.е. среды, полученные с использованием знаний об интересующем микроорганизме (микроорганизмах), можно разделить на три различных метода. Первый из методов заключается в прямом удалении дискретного участка среды для переноса в камеру для роста in vitro, которая уже содержит интересующие микроорганизмы внутри мембраны. Дискретная секция (например, морская вода) обеспечивает интересующие микроорганизмы геохимической средой обитания, которую они используют in situ, в то время как мембрана останавливает движение клеток поперек (интересующие клетки останутся внутри; посторонние клетки, прибывшие с дискретным участком, останутся снаружи). Путем включения соединений, естественным образом доступных для целевых микроорганизмов в их естественной среде обитания, такие микроорганизмы могут культивироваться⁸. Второй метод использует метатранскриптомику или геномику для выяснения метаболических возможностей, предоставляя ключи к узким параметрам культивирования для целевого дизайна среды. Этот подход обеспечивает эколого-физиологический профиль, который может быть использован для целенаправленного обогащения определенных типов микроорганизмов из окружающей среды. Средства среды предназначены для выявления присутствующих генов, которые, как предполагается, поддерживают целевой микроорганизм (микроорганизмы) для уменьшения разнообразия ^{обогащения,9,10}. Одно из предостережений заключается в том, что геномная информация не дает прямого вывода об экспрессии генов, в то время как транскриптомная информация делает это.

Третий метод включает в себя экологически информированные и смоделированные среды, в отличие от первого метода, который не моделирует среду, а использует окружающую среду непосредственно в качестве источника среды. Этот третий метод требует экологической разведки геохимии полевого участка, содержащего интересующие микроорганизмы. Обладая этими знаниями, основные компоненты и физические параметры определяются для создания экологически обоснованной моделируемой среды. Затем среда получает прямую инфузию осадка или жидкости, содержащей микроорганизмы, из окружающей среды в среду. Этот метод особенно ценен в тех случаях, когда микробиолог, занимающийся культивированием, не имеет доступа к достаточному количеству исходной среды (как это необходимо для первого метода) или к соответствующим метатранскриптомным или геномным данным (как это необходимо для второго метода).

Следующий протокол является примером третьего метода; Он основан на информации и направлен на моделирование интересующих сред. В протоколе параллельно представлены три наивных рецепта среды, нацеленных на различные анаэробные культуры микроорганизмов, полученные в полевых условиях. Представлены три культуры: смешанные культуры, происходящие из почвы (далее — смешанная почвенная культура), смешанные культуры, происходящие из скважины (далее — скважинная смешанная культура) и изолированный метаноген, происходящий из скважины (далее — скважинный изолированный метаноген). Составные тождества и количества в рецептах СМИ, представленных здесь, предназначены для начального руководства; Они могут и поощряются к адаптации к окружающей среде читателя и интересующим его микроорганизмам.

протокол

1. Производство настраиваемой анаэробной жидкой среды

1. Среда для флаконов для культур (производство 500 мл)
   1. Отмерьте и добавьте соединения в бутылку объемом 1 л и отрегулируйте pH, используя столбец в таблице 1 , соответствующий интересующей читателя культуре (количества в таблице 1 записаны для производства 1000 мл, отрегулируйте соответствующим образом). Смешайте компаунды до однородности, вкручивая бутылку.
   2. Нагрейте жидкость до кипения, разогрев бутылку в микроволновой печи в течение 5-6 минут. Часто открывайте микроволновую печь и осторожно взбалтывайте жидкость с помощью термостойкой перчатки. Быстро откройте микроволновую печь, если жидкость после бурления остается неподвижной; В противном случае жидкость может быстро расшириться и переполнить бутылку.
   3. Присоедините стерильную стеклянную пипетку объемом 10 мл к газовому коллектору N₂ (на основе конструкции Balch et ^al.11, хотя для получения газа чистоты N₂ не требуется нагретая медная колонка; дополнительную информацию о газовом коллекторе см. в Дополнительном файле 1 ). Откройте коллектор, чтобы выпустить O₂ и дать газу N₂ вытекать наружу.
   4. Поместите наконечник пипетки в жидкость и отрегулируйте поток газа так, чтобы пузырьки были умеренно энергичными. Промойте жидкость с помощью N₂ до тех пор, пока бутылка не станет слишком горячей, чтобы к ней можно было прикоснуться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это зависит от содержимого носителя, но обычно занимает ~20 минут.
   5. Ожидая, пока флакон остынет, выложите 10 стерильных флаконов с культурой по 100 мл; или, если готовится среда для сбора смешанной почвы, установите две стерильные бутылки по 500 мл.
   6. Когда флакон с фильтрующим материалом остынет на ощупь, потяните наконечник пипетки вверх в свободное пространство флакона. Добавьте 0,125 г NaHCO₃ и 0,300 г_Na2S∙9_H2Oи подождите, пока резазурин не станет бесцветным.
      ВНИМАНИЕ: Na₂S∙9 H₂O вызывает коррозию, токсичен и раздражает. Используйте средства индивидуальной защиты при работе и тщательно промойте металлические инструменты после контакта.
   7. Ожидая, пока резазурин изменит цвет, прикрепите металлические канюли к установке газового коллектора и поместите наконечники канюль в бутылки для культивирования. Отрегулируйте поток_N2 в бутылки до умеренной скорости, чтобы жидкость, добавленная на следующем этапе, не плескалась из-за потока газа.
   8. После того, как резазурин станет бесцветным, добавьте 50 мл жидкости в каждый флакон для культуры или 250 мл жидкости в каждый флакон объемом 500 мл.
   9. Закрывайте каждую бутылку резиновой пробкой подходящего размера сразу после извлечения канюль. Закрепите пробку алюминиевым уплотнением (для бутылочек с культурой) или завинчивающейся крышкой GL45 с открытым верхом (для бутылок объемом 500 мл).
   10. Поместите бутылки в автоклавируемый контейнер и наполните контейнер водопроводной водой, пока уровень воды не сравняется с уровнем воды в бутылках.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Это гарантирует, что бутылки не разорвутся из-за напряжения, вызванного перепадами температур на стекле во время автоклавирования.
   11. Автоклавируйте бутылки при температуре 121 °C в течение 30 мин.
2. Среда для биореактора (производительность 8 л)
   1. Подготовка карбоя
      1. Откройте клапан шарового крана с зазубринами для шланга 1/4 дюйма (6,4 мм). Прикрепите две силиконовые трубки длиной 6 см с внутренним диаметром (ID) 1/4 дюйма (6,4 мм) и внешним диаметром (OD) 1/2 дюйма (12,7 мм) на оба конца шарового крана с зазубринами для шланга.
      2. Прикрепите к одному концу узла фитинг адаптера для шланга 5/16–1/4 дюйма (7,9–6,4 мм). Прикрепите другой конец узла к штуцеру шланга 8-литрового карбоя.
      3. Используйте стяжку-молнию, чтобы закрепить соединение между штуцером шланга и трубкой, а также соединение между переходным фитингом штуцера для шланга и трубкой.
      4. Автоклавировать карбой со сборкой при 121 °C в течение 30 мин.
   2. Средняя производительность
      1. Закройте клапан шарового крана штуцера шланга на 8 л в сборе.
      2. Отмерьте и добавьте соединения в 8-литровый контейнер и отрегулируйте pH, используя столбец в таблице 1 , соответствующий интересующей читателя культуре (количества в таблице 1 записаны для производства 1000 мл, отрегулируйте соответствующим образом). Добавьте перемешиватель и используйте горячую плиту для перемешивания, чтобы смешать смеси до однородности.
      3. Нагрейте жидкость до кипения с помощью помешивающей плиты. Дайте жидкости закипеть в течение 30 минут.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Нагрев жидкости до кипения зависит от содержимого среды, но может занять 2-3 часа.
      4. Присоедините стерильную стеклянную пипетку объемом 10 мл к газовому коллектору N₂ (на основе конструкции Balch et ^al.11, хотя для получения газа чистоты N₂ не требуется нагретая медная колонка; дополнительную информацию о газовом коллекторе см. в Дополнительном файле 1 ). Откройте коллектор, чтобы выпустить O₂ и дать газу N₂ вытекать наружу.
      5. Выключите огонь, затем поместите наконечник пипетки в жидкость и отрегулируйте поток газа так, чтобы пузырьки были умеренно энергичными, но не переполнялись. Промывайте жидкость_N2 в течение 30 мин.
      6. Потяните наконечник пипетки вверх в свободное пространство коробки. Добавьте 2,0 г NaHCO₃ и 4,8 г_Na2S∙9 H₂O и подождите, пока резазурин не станет бесцветным.
         ВНИМАНИЕ: Na₂S∙9 H₂O вызывает коррозию, токсичен и раздражает. Используйте средства индивидуальной защиты при работе и тщательно промойте металлические инструменты после контакта.
      7. Как только резазурин станет бесцветным, извлеките стеклянную пипетку и сразу же закройте коробку пробкой #10. Скрутите проволоку над пробкой и вокруг кромки карбоя, чтобы закрепить пробку.

2. Получение in situ анаэробных микроорганизмов окружающей среды

1. Забор поверхностных анаэробных проб (почвенная смешанная культура)
   1. Принесите в поле бутылку (бутылки) со смешанной питательной средой для почвенных культур, приготовленную, как указано выше, и керноотборник.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Авторами используется стандартная коническая коронка Giddings 2 5/8" (Таблица материалов). Тем не менее, можно использовать любой керн или мастерок, который может взять пробы на желаемую глубину.
   2. Вдавливайте (забивайте сваи/колышки) керн в осадок до тех пор, пока верхняя часть цилиндра для сбора проб не окажется на одном уровне с поверхностью осадка.
   3. Поверните керн на 90°, чтобы освободить керн, и потяните вверх, пока образец не будет извлечен из окружающей среды.
   4. В рыхлых отложениях (например, с которыми можно столкнуться при отборе проб водно-болотных угодий) накройте основание керна новой рукой в нитриловой перчатке во время извлечения, чтобы предотвратить выпадение или распространение образца в воду при извлечении.
   5. Быстро приблизите на глаз на 6-7 см вверх от основания сердцевины. Новой рукой в нитриловой перчатке надрежьте сердцевину и отделите нижнюю часть на 6-7 см.
   6. Сразу же перенесите дно сердцевины в бутылку с культурой. Если почва/осадок слишком большой, быстро сформируйте его, чтобы он легче поместился в бутылку, максимально минимизировав воздействие аэробной атмосферы.
   7. После переноса образца немедленно переместите пробку и удерживайте ее на месте с помощью завинчивающейся крышки.
   8. Держите образец в прохладном месте. По возвращении в лабораторию охладите флакон для сбора при температуре 4 °C.
2. Подповерхностный анаэробный отбор проб (скважинная смешанная культура)
   1. Поставьте стерильную бутылку объемом 1 л у газового коллектора. Укупорьте бутылку резиновой пробкой. Капните 100% этанол на пробку и подожгите ее с помощью зажигалки.
   2. Прикрепите стерильную иглу 23 G к газовому коллектору N₂ . Откройте коллектор, чтобы выпустить O₂ и позволить газу N₂ (или Ar) вытекать с умеренной скоростью.
   3. Как только пробка перестанет гореть, вставьте иглу в бутылку. Вставьте в баллон вторую стерильную иглу 23 G, не прикрепленную к газовому коллектору. Промывайте флакон в течение 1-2 минут.
   4. Извлеките иглу, не прикрепленную к газовому коллектору. Нагнетайте давление в баллоне в течение 1 минуты. Извлеките оставшуюся иглу.
   5. Поднесите баллон под давлением и стерилизованную иглу 23 G к месту бурения скважины. Забор жидкости из скважины осуществляется в соответствии с методами Merino et ^al.12.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от метода, подключения и расхода скважины это меняет стратегию отбора пробы воды. При непрерывном потоке воды набирают воду, как описано в шаге 2.2.6. будет достаточно. Если поток воды периодический или с низким расходом, то можно использовать альтернативный метод входа/выхода. Во всех ситуациях сведите к минимуму загрязнение и постарайтесь убедиться, что собранная проба соответствует окружающей среде, в которой необходимо взять пробы. Это широко обобщенное утверждение, поскольку, по опыту авторов, каждое мероприятие по сбору образцов на правительственных или частных объектах должно быть в значительной степени адаптировано к имеющейся доступности.
   6. Быстро откройте бутылку, закачайте жидкость, чтобы полностью заполнить бутылку, и закройте бутылку.
   7. Вставьте иглу 23 G, которую принесли с собой на место, в резиновую пробку бутылки, чтобы уменьшить давление в бутылке. Извлеките иглу.
   8. Держите образец в прохладном месте. По возвращении в лабораторию охладите флакон для сбора при температуре 4 °C.

3. Выращивание in vitro анаэробных микроорганизмов, полученных в полевых условиях

1. Выращивание по бутылке с культурой
   1. Выложите стерильную бутылку N₂ с пробкой, а также флаконы для культивирования и бутылку для сбора, приготовленные, как указано выше. Капните 100% этанол на пробки и подожгите их с помощью зажигалки.
   2. Соберите иглу 23 G на шприц объемом 1 мл. Как только пробки перестанут гореть, вставьте иглу во флакон_N2 и наберите ~1 мл_N2. Извлеките иглу.
   3. Медленно нажмите на поршень, чтобы освободить N₂. Как только шприц опустеет, вставьте иглу во флакон для сбора и наберите 0,5 мл пробы окружающей среды. Извлеките иглу.
   4. Вставьте иглу во флакон для культивирования и введите образец. Извлеките иглу.
   5. Взболтайте бутылку и поместите ее в инкубатор при температуре, указанной в таблице 1 или в интересующей читателя обстановке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прогресс культивирования (в бутылке или биореакторе) контролируется с помощью гемоцитометра Петрова-Хаузера глубиной 0,02 мм. Обогащение анаэробных или привередливых микроорганизмов, как правило, не достигает плотности клеток, при которой можно использовать OD₆₀₀ , а другие методы обнаружения непрактичны для рутинного и повторяющегося мониторинга. Пределы обнаружения, контроль качества и статистические расчеты зависят от типа камеры для подсчета клеток и потребностей пользователя.
2. Рост по биореакторам
   1. Подготовка баллона модифицированным шприцем
      1. Снимите поршень с трех шприцев с замком Люэра объемом 10 мл (по одному на каждую окончательную сборку). Отрежьте фланец от каждого шприца и подпилите отрубленный конец, чтобы он не проткнул баллоны. Очистите модифицированный шприц от всех подпиленных стружок.
      2. Подготовьте двойной воздушный шар, поместив один воздушный шар внутрь другого.
      3. Протяните конец удвоенного баллона над модифицированным шприцем объемом 10 мл.
      4. Слегка отделите конец внешнего баллона от внутреннего. Выдавите весь воздух, попавший между баллонами.
      5. Затяните стяжку вокруг основания баллонов, чтобы закрепить баллоны на шприце.
   2. Приготовление модифицированной пробки
      1. Снимите поршни с десяти шприцев с замком Люэра объемом 1 мл (по два на каждую модифицируемую пробку). Отрежьте фланец от шприцев.
      2. Установите две резиновые пробки размера #10 (для 8-литровых бутылок) и три размера для бутылок с резьбой GL45 (для бутылок с уловом). С помощью сверла 1/4 дюйма (6,4 мм) просверлите два отверстия в верхней части каждой резиновой пробки, достаточно широкие, чтобы модифицированные шприцы могли поместиться, и достаточно узкие, чтобы посадка была герметичной.
      3. Вставьте модифицированные шприцы через отверстия резиновой пробки.
      4. Очистите и автоклавируйте модифицированную пробку при температуре 121 °C в течение 30 минут.
   3. Подготовка сборки биореактора
      1. Продезинфицируйте 70% этанолом все запорные краны, переходные соединители замка Люэра с внутренней резьбой и другие неавтоклавируемые материалы биореактора и автоклавируйте при 121 °C в течение 30 минут все трубки (после нарезки по длине), пробки, стекловату и другие автоклавируемые материалы биореактора.
      2. Установите стерильный биореактор (Рисунок 1 и Рисунок 2) на кольцевую подставку и закрепите его ремнем-цепочкой. Кроме того, установите водяную баню, перистальтический насос, закупоренную 8-литровую бутылку, содержащую среду (из шага протокола 1.2), одну бутылку объемом 3,5 л (бутылку для отбора проб) и одну бутылку объемом 500 мл (бутылку для отбора проб).
      3. Укупорка автомобиля
         1. Выложите баллон модифицированным шприцем. Подсоедините трехходовой запорный кран к наконечнику замка Люэра шприца.
         2. Возьмите баллон в сборе и подсоедините трехходовой запорный кран к трубке резервуара N₂. Поверните трехходовой запорный кран, чтобы перекрыть конец, открытый для атмосферы.
         3. Откройте бензобак и наполните баллон N₂. После заполнения поверните трехходовой запорный кран, чтобы заблокировать конец воздушного шара. Закройте бензобак и отсоедините трубку бака от трехходового запорного крана.
         4. Подсоедините последовательно: трехходовой запорный кран (баллона с модифицированным шприцем), двуходовой запорный кран, переходную муфту с внутренней резьбой и наконечник замка Люэра одного из модифицированных шприцев пробки.
         5. К наконечнику замка Люэра другого шприца подсоедините двусторонний запорный кран. Закройте оба клапана двуходовых запорных кранов на модифицированном стопорном узле.
         6. Размотайте проволоку, удерживающую пробку немодифицированного размера #10 автомобиля. Быстро замените немодифицированную пробку на модифицированную пробку в сборе и скрутите проволоку, как раньше, чтобы закрепить модифицированный стопор в сборе с автомобилем.
            ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы уверены и подготовлены, модифицированный узел стопора может быть использован для закупорки автомобиля на заключительном этапе подготовки среды (шаг 1.2.2.7).
         7. Поверните трехходовой запорный кран, чтобы перекрыть конец, открытый для атмосферы. Последовательно откройте двусторонний запорный кран. Газ баллона и свободное пространство 8-литрового карбоя теперь соединены.
      4. Укупорка бутылок для отбора проб и пробоотборных бутылок
         1. Укупорите 3,5-литровую бутылку без отбора проб с помощью модифицированной пробки для бутылок с резьбовой отделкой GL45, нанеся 70% этанола на основание пробки, чтобы помочь поместить ее в бутылку. Закройте бутылку завинчивающейся крышкой GL45 с открытым верхом.
         2. Подсоедините последовательно: баллон с наконечником замка Люэра модифицированного шприца, трехходовым запорным краном, переходной муфтой с замком Люэра с внутренней резьбой и наконечником замка Люэра одного из модифицированных шприцев с пробкой. Поверните трехходовой запорный кран, чтобы перекрыть открытый конец прямо в атмосферу.
         3. К наконечнику замка Люэра другого шприца подсоедините переходную муфту с внутренней резьбой и замком Люэра.
         4. Повторите описанные выше три шага для бутылки для отбора проб объемом 500 мл.
      5. Настройка насосно-компрессорных труб
         1. Измерьте расстояние между отверстиями водяной рубашки биореактора и зазубринами шланга водяной бани. Отрежьте две длины силиконовых трубок с внутренним диаметром 3/16 дюйма (4,8 мм) и наружным диаметром 3/8 дюйма (9,5 мм), чтобы охватить это расстояние.
         2. Соберите два прямых соединителя шлангов с завинчивающимися крышками GL14 с открытым верхом. Прикрепите каждый к одному концу двух частей трубки.
         3. Закрутите завинчивающиеся крышки на отверстиях водяной рубашки биореактора. Прикрепите другие концы трубки к зазубрителям шланга водяной бани так, чтобы вода вытекала из водяной бани, входила в нижнюю часть водяной рубашки биореактора, выходила в верхней части водяной рубашки и возвращалась на водяную баню. Затяните застежки-молнии вокруг концов трубки, чтобы закрепить трубку на зазубринах шланга водяной бани.
         4. Для насосов, аналогичных мини-насосу VWR со сверхнизким расходом и переменным расходом, проденьте через насос прилагаемый узел трубки с прорезью 3/16 дюйма (4,8 мм).
         5. Измерьте расстояние между узлом трубки карбоя и узлом трубки перистальтического насоса. Отрежьте длину силиконовой трубки с внутренним диаметром 3/16 дюйма (4,8 мм) и наружным диаметром 3/8 дюйма (9,5 мм), чтобы преодолеть это расстояние.
         6. Прикрепите один конец трубки к штуцеру шланга узла трубки карбоя, а другой - к штуцеру шланга узла трубки перистальтического насоса, ориентируя их таким образом, чтобы среда вытекала из кассеты и проходила через перистальтический насос.
         7. Измерьте расстояние между трубкой перистальтического насоса в сборе и нижним отверстием биореактора. Отрежьте длину силиконовой трубки с внутренним диаметром 3/16 дюйма (4,8 мм) и наружным диаметром 3/8 дюйма (9,5 мм), чтобы преодолеть это расстояние.
         8. Прикрепите один конец этой трубки к штуцеру шланга трубки перистальтического насоса в сборе, а другой осторожно прикрепите к нижнему отверстию биореактора. Стараясь не разбить стекло, а также закрепить соединение, затяните стяжку вокруг конца трубки, чтобы прикрепить трубку к нижнему отверстию биореактора.
         9. Измерьте и отрежьте примерно 5 дюймов (127 мм) длины силиконовой трубки с внутренним диаметром 3/16 дюйма (4,8 мм) и наружным диаметром 3/8 дюйма (9,5 мм).
         10. Прикрепите гнездовой разъем адаптера замка Люэра к трехходовому запорному крану. Прикрепите любой конец трехходового запорного крана к трубке.
         11. Соберите один угловой соединитель шланга с завинчивающейся крышкой GL14 с открытым верхом. Прикрепите его к другому концу трубки.
         12. Закрутите завинчивающуюся крышку на самое верхнее вертикальное отверстие биореактора. Поверните трехходовой запорный кран, чтобы перекрыть конец, направленный на биореактор.
         13. Измерьте расстояние между самым верхним вертикальным узлом порта в сборе и узлом бутылки для сбора проб без отбора проб. Отрежьте длину силиконовой трубки с внутренним диаметром 3/16 дюйма (4,8 мм) и наружным диаметром 3/8 дюйма (9,5 мм), чтобы преодолеть это расстояние. Отрежьте фланцы от двух шприцев с замком Люэра объемом 1 мл и вставьте их в концы трубки.
         14. Прикрепите один конец этой трубки в сборе к трехходовому запорному крану самого верхнего вертикального узла порта, а другой конец прикрепите к гнездовому разъему адаптера замка Люэра на узле бутылки для отбора проб без отбора проб.
         15. Измерьте расстояние между самым верхним вертикальным узлом порта и узлом бутылки для отбора проб. Отрежьте длину силиконовой трубки с внутренним диаметром 3/16 дюйма (4,8 мм) и наружным диаметром 3/8 дюйма (9,5 мм), чтобы преодолеть это расстояние. Отрежьте фланцы от двух шприцев с замком Люэра объемом 1 мл и вставьте их в концы трубки.
         16. Прикрепите один конец этой трубки в сборе к трехходовому запорному крану самого верхнего вертикального узла порта, а другой — к гнездовому разъему адаптера замка Люэра на узле бутылки для отбора проб.
   4. Заполнение биореактора
      1. Закройте один из портов GL18 биореактора белой резиновой перегородкой. Закройте другой порт GL18 и остальные вертикальные открытые порты GL14 силиконовыми перегородками с покрытием из ПТФЭ размера GL18/GL14 (ПТФЭ обращен к стеклу) и открытыми верхними завинчивающимися крышками.
      2. Стержнем длиной 50 см уложите 0,9 г стекловаты в основание биореактора.
      3. Автоклав 1,3 л песка при 121 °C в течение 30 мин. Наполните биореактор песком с помощью воронки.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь могут быть заменены другие типы отложений, основанные на окружающей среде читателя и интересующих его микроорганизмах.
      4. Поместите трубку в резервуар с_N2 в верхнюю часть биореактора и промойте свободное пространство биореактора_N2 в течение 2 минут. Немедленно закройте биореактор пробкой размера #7 и завинчивающейся крышкой GL45 с открытым верхом.
      5. От бутылки для отбора проб отсоедините трубку и поверните трехходовой запорный кран, чтобы заблокировать конец, направленный на баллон. Подсоедините трубку к резервуару N₂ к разъему адаптера замка Люэра с внутренней резьбой и промойте свободное пространство биореактора_N2 в течение 2 минут. Немедленно подсоедините трубку и верните трехходовой запорный кран, чтобы заблокировать открытый конец для атмосферы.
      6. Повторите описанный выше шаг для бутылки для отбора проб.
      7. Поверните трехходовой запорный кран самого верхнего вертикального отверстия биореактора, чтобы заблокировать конец, указывающий на бутылку для отбора проб. Перекачайте жидкость из машины в биореактор. Приостановите насос, выпустите воздух из баллона с бутылкой для отбора проб и наполните баллон карбоя_N2 по мере необходимости.
      8. После того, как биореактор будет заполнен средой, установите скорость потока насоса на 0,6 мл/мин (цифровое значение 40 на мини-насосе).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь можно заменить другие желаемые считывателем скорости потока.
      9. Установите температуру водяной бани в соответствии с таблицей 1 или окружающей средой, интересующей читателя.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Посевной материал может быть добавлен на этом этапе или позже, в зависимости от специфики исследования. Если вы делаете прививку на этом этапе, перейдите к шагу 3.2.4.10. Если прививка выполняется позже, перейдите к шагу 3.2.5.
      10. Выложите флакон для сбора или флакон для посева и стерильный флакон с пробкой из_N2. Капните 100% этанол на пробки и подожгите их с помощью зажигалки.
      11. Соберите иглу 23 G на шприц объемом 60 мл. Как только пробки перестанут гореть, вставьте иглу во флакон_N2 и наберите ~50 мл_N2. Извлеките иглу.
      12. Медленно нажмите на поршень, чтобы освободить N₂. Как только шприц опустеет, вставьте иглу во флакон для сбора и наберите 50 мл образца окружающей среды. Извлеките иглу.
      13. Замените иглу 23 G на стерильную длинную металлическую иглу (канюлю, длина 31,5 см). Вставьте длинную металлическую иглу через белую резиновую перегородку на порте GL18 биореактора.
      14. Протолкните иглу в осадок и введите посевной материал. Извлеките иглу.
   5. Техническое обслуживание биореактора
      1. Каждый день, когда работает биореактор, выполняйте следующие действия:
         1. Проверьте уровень водяной бани. Если низкий, добавьте больше воды (используйте дистиллированную воду для увеличения срока службы оборудования за счет уменьшения коррозии и накопления минералов).
         2. Проверьте баллон бутылки для отбора проб; Полный баллон будет препятствовать потоку среды. Когда он заполнится, поверните трехходовой запорный кран, чтобы заблокировать конец, указывающий на бутылку-уловитель. Сожмите баллон, чтобы опорожнить его; Затем верните трехходовой запорный кран, чтобы заблокировать конец, открытый для атмосферы; Повторяйте до тех пор, пока шарик не опустеет.
         3. Проверьте баллон 8-литрового карбоя. Если низкий уровень, закройте последовательный двуходовой запорный кран и отсоедините трехходовой запорный кран от двуходового запорного крана. Заправьте и снова прикрепите узел номера позиции, выполнив шаги 3.2.3.3.2, 3.2.3.3.3 и 3.2.3.3.7.
         4. Проверьте уровень среды в 8-литровом контейнере. Если низкий, соберите еще одну 8-литровую коробку и приготовьте больше среды, следуя шагам протокола 1.2. и 3.2.3.3. Приостановите насос, закройте шаровой кран штуцера шланга, быстро отсоедините старую машину и подсоедините новую машину.
            ПРИМЕЧАНИЕ: Для расхода 0,6 мл/мин каждые 9 дней потребуется новая среда.
         5. Проверьте уровень среды в бутылке для отбора проб. Если он заполнен, соберите еще одну бутылку для отбора проб в соответствии с шагом 3.2.3.4.1. Промойте новый флакон_N2, быстро отсоедините баллон с модифицированным шприцем и трубкой от старой бутылки и подсоедините к новой бутылке.
         6. Извлеките модифицированную пробку из полной бутылки для отбора проб без отбора проб. Автоклавировать жидкость при 121 °C в течение 30 мин; Затем утилизируйте жидкость в соответствии с институциональной политикой читателя. Очистите и автоклавируйте все части сборки бутылки для отбора проб, чтобы подготовить их к следующему использованию.
      2. Выполняйте выборку каждые 7 дней (или желаемое по желанию читателя) количество дней, выполнив следующие действия:
         1. Поверните трехходовой запорный кран самого верхнего вертикального отверстия биореактора, чтобы заблокировать конец, указывающий на бутылку для отбора проб. Соберите 250 мл жидкости.
            ПРИМЕЧАНИЕ: Для скорости потока 0,6 мл/мин сбор 250 мл займет ~7 часов.
         2. Верните трехходовой запорный кран самого верхнего вертикального отверстия биореактора, чтобы заблокировать конец, указывающий на бутылку для отбора проб. Отсоедините трубку и бутылку для отбора проб от трехходового запорного крана самого верхнего вертикального отверстия биореактора.
         3. После тестирования, хранения и/или надлежащей утилизации жидкости для отбора проб очистите все части узла бутылки для отбора проб, кроме баллона с модифицированным шприцем. Автоклавировать все детали при 121 °C в течение 30 мин, за исключением баллона с модифицированным шприцем и адаптерными разъемами с внутренней резьбой и замком Люэра. Соберите для следующего дня отбора проб.
            ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется иметь дубликат или тройное резервирование деталей, крышек, трубок и перегородок для быстрого ремонта и замены в случае необходимости.

Результаты

Здесь мы показываем результаты исследования биореактора с использованием метода приготовления скважинной смешанной питательной среды и метода настройки биореактора, как описано в настоящем документе. Скважинная смешанная питательная среда была модифицирована таким образом, чтобы ?...

Обсуждение

Раздел этого протокола (раздел 1) обязан своей структурой модифицированной методике Хангейта Миллера и Волина¹⁷, которая широко использовалась с момента ее публикации. Практичность этого расширенного протокола обусловлена его описательным характером и сочетанием с получ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Materials
1 L borosillicate bottle	Fisher Scientific
1 mL syringe with slip tip	Fisher Scientific
10 mL glass pipette	Fisher Scientific
100 mL culture bottle	Fisher Scientifc
20 mm hand crimper	Fisher Scientifc
23 G needle	Fisher Scientifc
500 mL borosilicate bottle	Fisher Scientific
Aluminum seal	Fisher Scientifc
Cannula, 31.5 cm length	Fisher Scientific
Cannula, 6 cm length	Fisher Scientifc
Corer	Giddings Machine Company		Assembled from company parts
Gas manifold	Swagelok		Assembled from many different parts
Lighter	Lowe's
N2 gas	Airgas
Nitrile gloves	Fisher Scientific
Rubber stopper (for GL45 bottles)	Glasgeratebau OCHS
Rubber stopper (for culture bottles)	Ace Glass
Stirring hot plate	Corning
Trace minerals	ATCC
Vitamins	ATCC
Bioreactor-specific Materials
#10 rubber stopper	Ace Glass
#7 rubber stopper	Fisher Scientifc
1 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
1/4" hose barb ball valve	Amazon
10 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
3.5 L borosilicate bottle	Fisher Scientific
5/16" - 1/4" hose barb adapter fitting	Amazon
60 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
8 L borosillicate carboy	Allen Glass
Angled hose connector for GL14 open top cap	Ace Glass	7623-20
Balloon	Party City
Borosillicate bioreactor	Allen Scientific Glass		Custom made upon request
Drill	Lowe's
Female luer lock adapter coupler	Amazon
GL14 open top cap	Ace Glass	7621-04
GL18 open top cap	Ace Glass	7621-08
GL45 open top cap	Ace Glass
PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap	Ace Glass	7625-06
PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap	Ace Glass	7625-07
Ring stand	Fisher Scientific
Ring stand chain clamp	Amazon
Ring stand clamp	Fisher Scientific
Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od	Grainger	55YG13
Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od	Grainger
Straight hose connector for GL14 open top cap	Ace Glass	7623-22
Three-way stopcock	Amazon
Two-way stopcock	Amazon
Ultra low flow variable flow mini-pump	VWR
Water bath	Fisher Scientifc
White rubber septum for 13-18 mm od tubes	Ace Glass	9096-49
Wire	Lowe's
Zip tie	Lowe's