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この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
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  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

この論文の焦点は、環境から獲得した気難しい嫌気性微生物の培地を作るためのベストプラクティスを詳述することです。これらの方法は、嫌気性培養の管理に役立ち、とらえどころのない未培養微生物である「微生物暗黒物質」の増殖をサポートするために適用できます。

要約

嫌気性微生物の培養依存研究は、方法論的能力にかかっています。これらの分析法は、嫌気性微生物に適した増殖条件(pHや炭素源など)を作成および維持すると同時に、人工環境を損なうことなくサンプルを抽出できるようにする必要があります。この目的のために、 その場 環境から情報を得てシミュレートする方法は、その環境から微生物を培養するのに非常に役立ちます。ここでは、摂動を最小限に抑えた嫌気性サンプルの収集に重点を置いた、陸表および地下微生物を培養するための in situ 情報に基づいたシミュレーション嫌気性法の概要を説明します。このプロトコルはカスタマイズ可能な嫌気性液体媒体の生産、および嫌気性微生物の環境の獲得そして 生体外で の成長を詳述する。このプロトコルは、堆積物の環境シミュレーションに使用される嫌気性バイオリアクターの重要なコンポーネントと、環境的に取得された培養物の嫌気性液体媒体もカバーしています。バイオリアクターの寿命にわたって維持されたマイクロバイオームから得られた予備的な次世代シーケンシングデータを含め、実験的な炭素源に応じて活性培養物が動的に調整されました。

概要

ほとんどの微生物は培養されていないままです。これは、顕微鏡で観察された細胞間の大きな格差と、寒天プレートを使用して培養に成功した少数の微生物と対照的なことによって裏付けられています。ステイリーとコノプカは、この格差を「グレート・プレート・カウント・アノマリー」1と名付けました。推定された未解明の多様性は、いくつかの異なる環境からのランク存在量曲線に分布する多くの新しい属を示すメタゲノムおよびメタトランスクリプトームデータによって裏付けられています2。観察された(一般的には微生物群集のランダムショットガンシーケンシングによって)が培養されていない微生物は、「微生物暗黒物質」と呼ばれています3,4。

オミクスの時代において、微生物の培養は、ゲノムデータを十分に評価し、存在する遺伝子の機能/表現型を検証することが不可欠であり続けています。培養微生物のシーケンシングは、ショットガンメタゲノミクスや環境からのメタゲノムアセンブルゲノムなどの技術が許容できるほど間違いのないものになるまで、完全なゲノムを自信を持って取得する唯一の方法です5。培養微生物と組み合わせたゲノム評価は、「微生物暗....

プロトコル

1.カスタマイズ可能な嫌気性液体培地の製造

  1. 培養ボトル用培地(500mL製造)
    1. 化合物を測定して 1 L ボトルに添加し、リーダーの目的の培養物に対応する 表 1 のカラムを使用して pH を調整します( 表 1 の含有量は 1,000 mL の製造に記録されており、それに応じて調整します)。ボトルを渦巻かせてコンパウンドを均一に混合します。
    2. ボトルを5〜6分間電子レンジで加熱して、液体を沸騰させます。電子レンジを頻繁に開き、耐熱手袋を使用して液体を静かに渦巻きます。泡立った後、液体が静止している場合は、電子レンジをすばやく開きます。そうしないと、液体が急速に膨張してボトルからオーバーフローする可能性があります。
    3. 滅菌済みの 10 mL ガラスピペットを N2 ガスマニホールドセットアップに取り付けます(Balch et al.11 の設計に基づくが、純度の N2 ガス用に加熱された銅カラムは必要ない;ガスマニホールドの詳細については補足 ファイル 1 を参照)。マニホールドを開いてO2 をベントし、N2 ガスを流出させます。
    4. ピペットチップを液体に入れ、気泡が適度....

結果

本稿では、本明細書に記載のボアホール混合培地調製方法およびバイオリアクターセットアップ方法を用いたバイオリアクター試験の結果を示す。ボアホール混合培地は、酸化水熱溶解(OHD)で処理したトウモロコシの穂軸のスラリーを炭素源として含有するように改質した13,14。改変したボアホール混合培地を、0.4 mL/分の速度で 44 日間バイオリア?.......

ディスカッション

このプロトコルの中生産セクション(セクション1)は、その構造をMillerとWolin17の修正されたHungate技術に負っており、その発行以来広く使用されています。この拡張されたプロトコルの実用性は、その記述的な性質と、微生物のその場での獲得との組み合わせから来ています。嫌気性細菌Thermoanaerosceptrum fracticalcis株DRI1318、Caldiatribacterium inferama.......

開示事項

著者らは、利益相反がないことを宣言しています。

謝辞

著者は、長年にわたってこれらの手法に影響を与え、進化させてきた情報とメンターシップの系譜を認めたいと思います。元大学院生、ポスドク、そして現在の教授であるハミルトン・ブレーム博士は、無酸素技術を教えるために時間を割いてくださったマイク・アダムス博士、ゲルティ・シュット博士、ジム・エルキンス博士、ミルチャ・ポダール博士、デュアン・モーザー博士、ブライアン・ヘドランド博士に感謝の意を表しています。ネイチャー・コンサーバンシーとアメリカン・リバーズは、それぞれ助成金G21-026-CON-PとAR-CE21GOS373を通じてこの作業を支援しました。この論文で表明された意見、調査結果、結論、または推奨事項は著者のものであり、必ずしもネイチャーコンサーバンシーまたはアメリカンリバーズの見解を反映しているわけではありません。この研究は、SIU Advanced Energy Instituteからの助成金によって支援されており、SIU Advanced Energy Instituteは、Advanced Energy Resource Boardを通じて授与された資金に感謝しています。NGSはLC Sciencesによって実施されました。

....

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
General Materials
1 L borosillicate bottleFisher Scientific
1 mL syringe with slip tipFisher Scientific
10 mL glass pipetteFisher Scientific
100 mL culture bottleFisher Scientifc
20 mm hand crimperFisher Scientifc
23 G needleFisher Scientifc
500 mL borosilicate bottleFisher Scientific
Aluminum sealFisher Scientifc
Cannula, 31.5 cm lengthFisher Scientific
Cannula, 6 cm lengthFisher Scientifc
CorerGiddings Machine Company Assembled from company parts
Gas manifoldSwagelokAssembled from many different parts
LighterLowe's
N2 gasAirgas
Nitrile glovesFisher Scientific
Rubber stopper (for GL45 bottles)Glasgeratebau OCHS
Rubber stopper (for culture bottles)Ace Glass
Stirring hot plateCorning
Trace mineralsATCC
VitaminsATCC
Bioreactor-specific Materials
#10 rubber stopperAce Glass
#7 rubber stopperFisher Scientifc
1 mL syringe with luer lock tipFisher Scientifc
1/4" hose barb ball valveAmazon
10 mL syringe with luer lock tipFisher Scientifc
3.5 L borosilicate bottleFisher Scientific
5/16" - 1/4" hose barb adapter fittingAmazon
60 mL syringe with luer lock tipFisher Scientifc
8 L borosillicate carboyAllen Glass
Angled hose connector for GL14 open top capAce Glass7623-20
BalloonParty City
Borosillicate bioreactorAllen Scientific GlassCustom made upon request
DrillLowe's
Female luer lock adapter couplerAmazon
GL14 open top capAce Glass7621-04
GL18 open top capAce Glass7621-08
GL45 open top capAce Glass
PTFE faced silicone septum for GL14 open top capAce Glass7625-06
PTFE faced silicone septum for GL18 open top capAce Glass7625-07
Ring standFisher Scientific
Ring stand chain clampAmazon
Ring stand clampFisher Scientific
Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" odGrainger55YG13
Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" odGrainger
Straight hose connector for GL14 open top capAce Glass7623-22
Three-way stopcockAmazon
Two-way stopcockAmazon
Ultra low flow variable flow mini-pumpVWR
Water bathFisher Scientifc
White rubber septum for 13-18 mm od tubesAce Glass9096-49
WireLowe's
Zip tieLowe's

参考文献

  1. Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
  2. Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L.

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