環境的に獲得した嫌気性微生物を培養するための In Situ 情報に基づく模擬培地フォーマットのセット

要約

この論文の焦点は、環境から獲得した気難しい嫌気性微生物の培地を作るためのベストプラクティスを詳述することです。これらの方法は、嫌気性培養の管理に役立ち、とらえどころのない未培養微生物である「微生物暗黒物質」の増殖をサポートするために適用できます。

要約

嫌気性微生物の培養依存研究は、方法論的能力にかかっています。これらの分析法は、嫌気性微生物に適した増殖条件(pHや炭素源など)を作成および維持すると同時に、人工環境を損なうことなくサンプルを抽出できるようにする必要があります。この目的のために、 その場 環境から情報を得てシミュレートする方法は、その環境から微生物を培養するのに非常に役立ちます。ここでは、摂動を最小限に抑えた嫌気性サンプルの収集に重点を置いた、陸表および地下微生物を培養するための in situ 情報に基づいたシミュレーション嫌気性法の概要を説明します。このプロトコルはカスタマイズ可能な嫌気性液体媒体の生産、および嫌気性微生物の環境の獲得そして 生体外で の成長を詳述する。このプロトコルは、堆積物の環境シミュレーションに使用される嫌気性バイオリアクターの重要なコンポーネントと、環境的に取得された培養物の嫌気性液体媒体もカバーしています。バイオリアクターの寿命にわたって維持されたマイクロバイオームから得られた予備的な次世代シーケンシングデータを含め、実験的な炭素源に応じて活性培養物が動的に調整されました。

概要

ほとんどの微生物は培養されていないままです。これは、顕微鏡で観察された細胞間の大きな格差と、寒天プレートを使用して培養に成功した少数の微生物と対照的なことによって裏付けられています。ステイリーとコノプカは、この格差を「グレート・プレート・カウント・アノマリー」¹と名付けました。推定された未解明の多様性は、いくつかの^{異なる環境からの}ランク存在量曲線に分布する多くの新しい属を示すメタゲノムおよびメタトランスクリプトームデータによって裏付けられています2。観察された(一般的には微生物群集のランダムショットガンシーケンシングによって)が培養されていない微生物は、「微生物暗黒^{物質」と呼ばれ}ています^3,4。

オミクスの時代において、微生物の培養は、ゲノムデータを十分に評価し、存在する遺伝子の機能/表現型を検証することが不可欠であり続けています。培養微生物のシーケンシングは、ショットガンメタゲノミクスや環境からのメタゲノムアセンブルゲノムなどの技術が許容できるほど間違いのないものになるまで、完全なゲノムを自信を持って取得する唯一の方法です⁵。培養微生物と組み合わせたゲノム評価は、「微生物暗....

プロトコル

1.カスタマイズ可能な嫌気性液体培地の製造

1. 培養ボトル用培地(500mL製造)
   1. 化合物を測定して 1 L ボトルに添加し、リーダーの目的の培養物に対応する 表 1 のカラムを使用して pH を調整します( 表 1 の含有量は 1,000 mL の製造に記録されており、それに応じて調整します)。ボトルを渦巻かせてコンパウンドを均一に混合します。
   2. ボトルを5〜6分間電子レンジで加熱して、液体を沸騰させます。電子レンジを頻繁に開き、耐熱手袋を使用して液体を静かに渦巻きます。泡立った後、液体が静止している場合は、電子レンジをすばやく開きます。そうしないと、液体が急速に膨張してボトルからオーバーフローする可能性があります。
   3. 滅菌済みの 10 mL ガラスピペットを N₂ ガスマニホールドセットアップに取り付けます(Balch et ^al.11 の設計に基づくが、純度の N₂ ガス用に加熱された銅カラムは必要ない;ガスマニホールドの詳細については補足 ファイル 1 を参照)。マニホールドを開いて_O2 をベントし、_N2 ガスを流出させます。
   4. ピペットチップを液体に入れ、気泡が適度....

ディスカッション

このプロトコルの中生産セクション(セクション1)は、その構造をMillerとWolin¹⁷の修正されたHungate技術に負っており、その発行以来広く使用されています。この拡張されたプロトコルの実用性は、その記述的な性質と、微生物のその場での獲得との組み合わせから来ています。嫌気性細菌Thermoanaerosceptrum fracticalcis株DRI13¹⁸、Caldiatribacterium inferama.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Materials
1 L borosillicate bottle	Fisher Scientific
1 mL syringe with slip tip	Fisher Scientific
10 mL glass pipette	Fisher Scientific
100 mL culture bottle	Fisher Scientifc
20 mm hand crimper	Fisher Scientifc
23 G needle	Fisher Scientifc
500 mL borosilicate bottle	Fisher Scientific
Aluminum seal	Fisher Scientifc
Cannula, 31.5 cm length	Fisher Scientific
Cannula, 6 cm length	Fisher Scientifc
Corer	Giddings Machine Company		Assembled from company parts
Gas manifold	Swagelok		Assembled from many different parts
Lighter	Lowe's
N2 gas	Airgas
Nitrile gloves	Fisher Scientific
Rubber stopper (for GL45 bottles)	Glasgeratebau OCHS
Rubber stopper (for culture bottles)	Ace Glass
Stirring hot plate	Corning
Trace minerals	ATCC
Vitamins	ATCC
Bioreactor-specific Materials
#10 rubber stopper	Ace Glass
#7 rubber stopper	Fisher Scientifc
1 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
1/4" hose barb ball valve	Amazon
10 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
3.5 L borosilicate bottle	Fisher Scientific
5/16" - 1/4" hose barb adapter fitting	Amazon
60 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
8 L borosillicate carboy	Allen Glass
Angled hose connector for GL14 open top cap	Ace Glass	7623-20
Balloon	Party City
Borosillicate bioreactor	Allen Scientific Glass		Custom made upon request
Drill	Lowe's
Female luer lock adapter coupler	Amazon
GL14 open top cap	Ace Glass	7621-04
GL18 open top cap	Ace Glass	7621-08
GL45 open top cap	Ace Glass
PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap	Ace Glass	7625-06
PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap	Ace Glass	7625-07
Ring stand	Fisher Scientific
Ring stand chain clamp	Amazon
Ring stand clamp	Fisher Scientific
Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od	Grainger	55YG13
Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od	Grainger
Straight hose connector for GL14 open top cap	Ace Glass	7623-22
Three-way stopcock	Amazon
Two-way stopcock	Amazon
Ultra low flow variable flow mini-pump	VWR
Water bath	Fisher Scientifc
White rubber septum for 13-18 mm od tubes	Ace Glass	9096-49
Wire	Lowe's
Zip tie	Lowe's