Çevresel Olarak Edinilmiş Anaerobik Mikroorganizmaların Kültürlenmesi için Bir Dizi Yerinde Bilgilendirilmiş Simüle Edilmiş Ortam Formatı

Özet

Bu makalenin odak noktası, bir ortamdan elde edilen titiz anaerobik mikroorganizmalar için ortam yapmak için en iyi uygulamaları detaylandırmaktır. Bu yöntemler anaerobik kültürlerin yönetilmesine yardımcı olur ve "mikrobiyal karanlık madde" olarak adlandırılan, kültürlenmemiş mikroorganizmaların büyümesini desteklemek için uygulanabilir.

Özet

Anaerobik mikroorganizmaların kültüre bağlı araştırmaları metodolojik yeterliliğe dayanır. Bu yöntemler, anaerobik mikroorganizmalar için uygun büyüme koşulları (örneğin, pH ve karbon kaynakları) yaratmalı ve sürdürmeli, aynı zamanda yapay ortamdan ödün vermeden numunelerin ekstrakte edilmesine izin vermelidir. Bu amaçla, yerinde bir ortam tarafından bilgilendirilen ve simüle edilen yöntemler, o ortamdan mikroorganizmaların kültürlenmesinde çok yardımcı olabilir. Burada, minimum bozulma ile anaerobik numune toplamayı vurgulayarak, karasal yüzey ve yüzey altı mikroorganizmaların kültürlenmesi için yerinde bilgilendirilmiş ve simüle edilmiş bir anaerobik yöntemin ana hatlarını çiziyoruz. Bu protokol, özelleştirilebilir bir anaerobik sıvı ortamın üretimini ve anaerobik mikroorganizmaların çevresel edinimini ve in vitro büyümesini detaylandırır. Protokol ayrıca, çevresel olarak edinilen kültürler için tortu ve anaerobik sıvı ortamın çevresel simülasyonları için kullanılan bir anaerobik biyoreaktörün kritik bileşenlerini de kapsar. Aktif kültürün deneysel bir karbon kaynağına yanıt olarak dinamik olarak ayarlandığı bir biyoreaktörün ömrü boyunca korunan bir mikrobiyomdan elde edilen ön Yeni Nesil Dizileme verilerini dahil ettik.

Giriş

Çoğu mikroorganizma kültürlenmemiş olarak kalır; Bu, agar plakaları kullanılarak başarılı bir şekilde kültürlenen birkaç mikroorganizmanın aksine, mikroskopi ile gözlemlenen hücreler arasındaki büyük eşitsizlik ile desteklenir. Staley ve Konopka bu eşitsizliği "Büyük Plaka Sayısı Anomalisi" olarak ^{adlandırdılar1}. Tahmini hesaplanmamış çeşitlilik, birkaç farklı ortamdan sıra bolluk eğrilerinde dağılmış birçok yeni cinsi gösteren metagenomik ve metatranskriptomik verilerle desteklenmektedir². Gözlemlenen mikroorganizmalar (genellikle bir mikrobiyal topluluğun rastgele av tüfeği dizilimi ile) ancak kültürlenmemiş "mikrobiyal karanlık madde" olarak ^{adlandırılmıştır3,4}.

-Omik çağında, genomik verileri tam olarak değerlendirmek ve mevcut genlerin işlevini/fenotipini doğrulamak için mikroorganizmaların kültürlenmesi zorunludur. Kültürlenmiş mikroorganizmaların dizilenmesi, av tüfeği metagenomikleri ve çevreden metagenomla birleştirilmiş genomlar gibi teknolojiler kabul edilebilir bir şekilde yanılmaz hale gelene kadar tam genomları güvenle elde etmenin tek yoludur⁵. Kültürlenmiş mikroorganizmalarla birleştirilmiş genomik değerlendirmeler, "mikrobiyal karanlık maddeyi" anlamak için güçlü çıkarımlar sağlar. "Mikrobiyal karanlık maddenin" birçok üyesi, besinlerin ve diğer elementlerin döngüsünü ve değerli doğal ürünlerin üretimini etkileyen, ekolojik sistemleri destekleyen ve ekolojik hizmetleri yerine getiren önemli işlevleri yerine getirir. Tıbbi açıdan bakıldığında, şu anda pazarlanan tüm ilaçların yaklaşık yarısı, bakterilerden elde edilen ürünlerin ürünleri ve türevleridir ve kültürlenmemiş türlerin profillenmesinin geleceğin antibiyotiklerini ortaya çıkardığından şüphelenilmektedir. Bu kültürsüz çoğunluğa erişmek için, çeşitli kültür metodolojileri artırılmalıdır⁶. "Mikrobiyal karanlık madde" üyeleri arasında, anaerobik oligotrofik mikroorganizmalar büyük ölçüde rapor edilmemiştir ve muhtemelen ekolojik ve endüstriyel olarak değerli biyokimyasal yollara⁷ sahiptir, bu da onları kültürlemenin önemli hedefleri haline getirir. Bununla birlikte, anaerobik oligotrofik mikroorganizmaların kültürlenmesi, genellikle gerekli olan daha uzun inkübasyon süreleri, titiz koşullar (örneğin, belirli standart dışı in vitro sıcaklıklar) ve özel ortam tariflerinin kullanımı nedeniyle aerobik ve kopiotrofik muadillerine göre daha zordur.

Yeni anaerobik oligotrofik mikroorganizmalar da dahil olmak üzere "mikrobiyal karanlık madde" üyelerini kültürlemek için mevcut gelişen teknikler, anlayışımızı büyük ölçüde geliştirdi ve bu mikroorganizmaların filogenetik ağaç içindeki temsilini artırdı. Yeni mikroorganizmaların kültürlenmesi için bilgilendirilmiş ortam kullanan mevcut teknikler (yani, ilgilenilen mikroorganizma/organizmaların bilgisi kullanılarak türetilen ortam) üç farklı yönteme ayrılabilir. Yöntemlerden ilki, bir zar içinde ilgilenilen mikroorganizmaları zaten içeren bir in vitro büyüme odasına transfer için ortamın ayrı bir bölümünün doğrudan çıkarılmasını gerektirir. Ayrık bölüm (örneğin, deniz suyu), ilgilenilen mikroorganizmalara yerinde kullandıkları jeokimyasal habitatı sağlamak için hareket ederken, zar hücrelerin hareketini durdurur (ilgilenilen hücreler içeride kalacaktır; ayrık bölümle gelen yabancı hücreler dışarıda kalacaktır). Mikroorganizmaları doğal ortamlarında hedeflemek için doğal olarak bulunan bileşikleri dahil ederek, bu tür mikroorganizmalar kültürlenebilir⁸. İkinci yöntem, metabolik yetenekleri aydınlatmak için metatranskriptomik veya genomik kullanır ve hedeflenen bir ortam tasarımı için dar kültür parametrelerine ipuçları sağlar. Bu yaklaşım, belirli mikroorganizma türlerinin bir ortamdan zenginleştirilmesini hedeflemek için kullanılabilecek eko-fizyolojik bir profil sağlar. Ortamın hükümleri, zenginleştirme çeşitliliğini azaltmak için hedeflenen mikroorganizma(lar)ı desteklediği varsayılan mevcut tanımlanmış genlere ^{yöneliktir,9,10}. Bir uyarı, genomik bilginin genlerin ekspresyonunu doğrudan anlamadığı, transkriptomik bilginin ise çıkardığıdır.

Üçüncü yöntem, medyayı simüle etmeyen, bunun yerine çevreyi doğrudan bir medya kaynağı olarak kullanan birinci yöntemden farklı olarak, çevresel olarak bilgilendirilmiş ve simüle edilmiş medyayı kapsar. Bu üçüncü yöntem, ilgilenilen mikroorganizmaları içeren bir saha sahasının jeokimyasının çevresel keşfini gerektirir. Bu bilgiyle, çevresel olarak bilgilendirilmiş simüle edilmiş bir ortam üretmek için birincil bileşenler ve fiziksel parametreler tanımlanır. Ortam daha sonra ortamdan ortama mikroorganizma içeren tortu veya sıvının doğrudan infüzyonunu alır. Bu yöntem, kültür mikrobiyoloğunun yeterli miktarda kaynak ortama (ilk yöntem için gerektiği gibi) veya uygun metatranskriptomik veya genomik verilere (ikincisi için gerektiği gibi) erişiminin olmadığı durumlarda özellikle değerlidir.

Aşağıdaki protokol üçüncü yönteme bir örnektir; İlgilenilen ortamlar tarafından bilgilendirilir ve simüle etmeyi amaçlar. Protokol kapsamında, sahada elde edilen farklı anaerobik mikroorganizma kültürlerini hedef alan üç naif besiyeri reçetesi paralel olarak sunulmaktadır. Temsil edilen üç kültür, topraktan kaynaklanan karışık kültürler (bundan sonra toprak karışık kültür olarak anılacaktır), bir sondaj deliğinden kaynaklanan karışık kültürler (bundan sonra sondaj deliği karışık kültürü) ve bir sondaj deliğinden kaynaklanan izole edilmiş bir metanojendir (bundan sonra, sondaj deliği izole metanojen). Burada paylaşılan medya tariflerinde yer alan bileşik kimlikler ve miktarlar bir başlangıç rehberi niteliğindedir; Okuyucunun çevresine ve ilgilendiği mikroorganizmalara göre özelleştirilebilir ve teşvik edilirler.

Protokol

1. Özelleştirilebilir anaerobik sıvı ortam üretimi

1. Kültür şişeleri için ortam (500 mL üretim)
   1. Bileşikleri ölçün ve 1 L'lik bir şişeye ekleyin ve okuyucunun ilgilendiği kültüre karşılık gelen Tablo 1'deki sütunu kullanarak pH'ı ayarlayın ( Tablo 1'deki miktarlar 1.000 mL'lik üretim için kaydedilir, buna göre ayarlayın). Şişeyi döndürerek bileşikleri homojen hale getirin.
   2. Şişeyi 5-6 dakika mikrodalgada pişirerek sıvıyı kaynama noktasına kadar ısıtın. Mikrodalgayı sık sık açın ve ısıya dayanıklı bir eldiven kullanarak sıvıyı hafifçe döndürün. Köpürdükten sonra sıvı hareketsiz kalırsa mikrodalgayı hızlı bir şekilde açın; Aksi takdirde, sıvı hızla genişleyebilir ve şişeden taşabilir.
   3. N₁₀ gaz manifoldu kurulumuna steril bir 2 mL cam pipet takın (Balch ve ^ark.11'in tasarımına dayalıdır, ancak N₂ saflık gazı için ısıtılmış bir bakır kolon gerektirmez; daha fazla gaz manifoldu bilgisi için Ek Dosya 1'e bakın). _O2'yi havalandırmak için manifoldu açın ve_N2 gazının dışarı akmasına izin verin.
   4. Pipet ucunu sıvıya yerleştirin ve kabarcıklar orta derecede kuvvetli olacak şekilde gaz akışını ayarlayın. Şişe artık dokunulamayacak kadar sıcak olana kadar sıvıyı_N2 ile yıkayın.
      NOT: Bu, ortamın içeriğine bağlıdır ancak genellikle ~20 dakika sürer.
   5. Şişenin soğumasını beklerken 10 adet steril 100 mL kültür şişesi koyun; veya toprakla karıştırılmış kültürün toplanması için ortam hazırlıyorsanız, iki adet steril 500 mL şişe koyun.
   6. Medya şişesi dokunulamayacak kadar soğuduktan sonra, pipet ucunu şişenin üst boşluğuna doğru çekin. 0.125 g_NaHCO3 ve 0.300 g_Na2S∙_9H2Oekleyin ve resazurin renksiz hale gelene kadar bekleyin.
      DİKKAT: Na 2 S_∙9 H₂O aşındırıcı, toksik ve tahriş edicidir. Tutarken kişisel koruyucu ekipman kullanın ve temastan sonra metal aletleri iyice durulayın.
   7. Resazurin'in renginin değişmesini beklerken, gaz manifoldu kurulumuna metal kanüller takın ve kanül uçlarını kültür şişelerine yerleştirin. N2'nin şişelere akışını ılımlı bir hıza ayarlayın, böylece bir sonraki adımda eklenen sıvı gaz akışı nedeniyle kaymaz.
   8. Resazorin renksiz olduğunda, her kültür şişesine 50 mL sıvı veya her 500 mL şişeye 250 mL sıvı alikot.
   9. Kanülleri çıkardıktan hemen sonra her şişeyi uygun boyutta bir lastik tıpa ile kapatın. Tıpayı alüminyum conta (kültür şişeleri için) veya GL45 üstü açık vidalı kapak (500 mL şişeler için) ile sabitleyin.
   10. Şişeleri otoklavlanabilir bir çöp kutusuna koyun ve su seviyeleri şişelerdekilerle eşleşene kadar hazneyi musluk suyuyla doldurun.
       NOT: Bu, otoklavlama sırasında cam üzerindeki sıcaklık farklılıklarının neden olduğu stres nedeniyle şişelerin yırtılmamasını sağlayacaktır.
   11. Şişeleri 121 °C'de 30 dakika otoklavlayın.
2. Biyoreaktör ortamı (8 L üretimi)
   1. Damacana hazırlanması
      1. 1/4" (6.4 mm) hortum dikenli küresel vananın vanasını açın. Hortum dikenli küresel vananın her iki ucuna 6/1" (4 mm) iç çaplı (ID) ve 4/1" (2 mm) dış çaplı (OD) iki adet 12.7 cm uzunluğunda silikon boru takın.
      2. Düzeneğin bir ucuna 5/16"-1/4" (7.9 mm-6.4 mm) hortum dikeni adaptör bağlantısı takın. Düzeneğin diğer ucunu 8 L'lik bir damacananın hortum ucuna takın.
      3. Damacananın hortum ucu ile hortum arasındaki bağlantıyı ve hortum ucu adaptör bağlantısı ile boru arasındaki bağlantıyı sabitlemek için bir fermuar kullanın.
      4. Damacanayı 121 °C'de 30 dakika otoklavlayın.
   2. Orta üretim
      1. 8 L damacana tertibatındaki hortum dikenli küresel vananın vanasını kapatın.
      2. 8 L damacanaya bileşikleri ölçün ve ekleyin ve okuyucunun ilgilendiği kültüre karşılık gelen Tablo 1'deki sütunu kullanarak pH'ı ayarlayın ( Tablo 1'deki miktarlar 1.000 mL'lik üretim için kaydedilmiştir, buna göre ayarlayın). Bir karıştırma çubuğu ekleyin ve bileşikleri homojen hale getirmek için bir karıştırma sıcak plakası kullanın.
      3. Sıvıyı karıştıran sıcak plaka ile kaynayana kadar ısıtın. Sıvının 30 dakika kaynamasına izin verin.
         NOT: Sıvının kaynama noktasına kadar ısıtılması, ortamın içeriğine bağlıdır ancak 2-3 saat sürebilir.
      4. N₁₀ gaz manifoldu kurulumuna steril bir 2 mL cam pipet takın (Balch ve ^ark.11'in tasarımına dayalıdır, ancak N₂ saflık gazı için ısıtılmış bir bakır kolon gerektirmez; daha fazla gaz manifoldu bilgisi için Ek Dosya 1'e bakın). _O2'yi havalandırmak için manifoldu açın ve_N2 gazının dışarı akmasına izin verin.
      5. Isıyı kapatın, ardından pipet ucunu sıvıya yerleştirin ve gaz akışını, kabarcıklar orta derecede kuvvetli olacak ancak taşmayacak şekilde ayarlayın. Sıvıyı N₂ ile 30 dakika yıkayın.
      6. Pipet ucunu damacananın baş boşluğuna doğru çekin. 2.0 g_NaHCO3 ve 4.8 g_Na2S∙_9H2Oekleyin ve resazurin renksiz hale gelene kadar bekleyin.
         DİKKAT: Na 2 S_∙9 H₂O aşındırıcı, toksik ve tahriş edicidir. Tutarken kişisel koruyucu ekipman kullanın ve temastan sonra metal aletleri iyice durulayın.
      7. Resazurin renksiz olduğunda, cam pipeti çıkarın ve hemen damacanayı #10 tıpa ile kapatın. Tıpayı sabitlemek için tıpanın üzerine ve damacananın dudağının etrafına bir tel bükün.

2. Çevresel anaerobik mikroorganizmaların yerinde edinilmesi

1. Yüzey anaerobik numune alımı (toprak karışık kültür)
   1. Yukarıdaki gibi yapılmış karışık toprak kültürü ortamının şişelerini / şişelerini ve bir çekirdeği tarlaya getirin.
      NOT: Yazarlar tarafından bir Giddings 2 5/8" standart konik toprak ucu kullanılmıştır (Malzeme Tablosu). Bununla birlikte, istenen derinliğe kadar numune alabilen herhangi bir toprak karot veya mala kullanılabilir.
   2. Numune toplama silindirinin üst kısmı tortunun yüzeyi ile aynı hizaya gelene kadar çekirdeği tortunun içine itin (kazık/kazık çakmak).
   3. Çekirdeği serbest bırakmak için çekirdeği 90° döndürün ve numune ortamdan çıkarılana kadar yukarı doğru çekin.
   4. Gevşek çökeltilerde (sulak alanlardan numune alırken karşılaşılabilecekler gibi), numunenin ekstraksiyon sırasında düşmesini veya suya yayılmasını önlemek için ekstrakte edilirken çekirdeğin tabanını yeni bir nitril eldivenli el ile örtün.
   5. Çekirdeğin tabanından 6-7 cm yukarıya doğru gözle hızlı bir şekilde yaklaşın. Çekirdeği dilimlemek için yeni bir nitril eldivenli el kullanın ve altını 6-7 cm ayırın.
   6. Çekirdeğin altını hemen kültür şişesine aktarın. Toprak/tortu çok büyükse, aerobik atmosfere maruz kalmayı mümkün olduğunca en aza indirerek şişeye daha kolay sığacak şekilde hızlı bir şekilde şekillendirin.
   7. Numune aktarıldıktan sonra, durdurucuyu hemen yeniden konumlandırın ve bir vidalı kapakla yerinde tutun.
   8. Numuneyi serin tutun. Laboratuvara döndükten sonra toplama şişesini 4 °C'de soğutun.
2. Yeraltı anaerobik numune alımı (sondaj deliği karışık kültürü)
   1. Gaz manifoldunun yanına steril 1 L'lik bir şişe koyun. Şişeyi lastik bir tıpa ile kapatın. Tıpa üzerine% 100 etanol damlatın ve bir çakmak kullanarak ateşe verin.
   2. _N 23 gaz manifoldu kurulumuna steril bir 2 G iğne takın. _O2'yi havalandırmak için manifoldu açın ve_N2 (veya Ar) gazının ılımlı bir hızda dışarı akmasına izin verin.
   3. Tıpa artık yanmadığında, iğneyi şişeye sokun. Gaz manifolduna takılı olmayan ikinci bir steril 23 G iğneyi şişeye yerleştirin. Şişeyi 1-2 dakika yıkayın.
   4. Gaz manifolduna bağlı olmayan iğneyi çıkarın. Şişeyi 1 dakika basınçlandırın. Kalan iğneyi çıkarın.
   5. Basınçlı şişeyi ve sterilize edilmiş 23 G'lik bir iğneyi sondaj deliği alanına getirin. Merinos ve ^ark.12'nin yöntemlerini izleyerek sondaj deliğinden sıvı çekin.
      NOT: Sondaj deliğinin yöntemine, bağlantısına ve akış hızına bağlı olarak bu, bir su numunesi alma stratejisini değiştirir. Sürekli bir su akışı varsa, adım 2.2.6'da belirtildiği gibi su toplamak. yeterli olacaktır. Su akışı toplu olarak toplanmışsa veya düşük akışlıysa, alternatif bir giriş/çıkış yöntemi kullanılabilir. Her durumda, kontaminasyonu en aza indirin ve toplanan numunenin, numune alınması istenen ortamı temsil ettiğinden emin olmaya çalışın. Bu genel olarak genelleştirilmiş bir ifadedir, çünkü yazarların deneyimi, devlet veya özel sitelerden gelen her örnek toplama etkinliğinin mevcut erişilebilirliğe son derece uyarlanabilir olması gerektiğidir.
   6. Şişeyi hızlıca açın, şişeyi tamamen doldurmak için sıvıyı pompalayın ve şişeyi kapatın.
   7. Şişedeki basıncı hafifletmek için bölgeye getirilen 23 G iğneyi şişenin kauçuk tıpasına sokun. İğneyi çıkarın.
   8. Numuneyi serin tutun. Laboratuvara döndükten sonra toplama şişesini 4 °C'de soğutun.

3. Sahada edinilen anaerobik mikroorganizmaların in vitro büyümesi

1. Kültür şişesi ile büyüme
   1. Tıpalı steril bir N₂ şişesi ve yukarıdaki gibi hazırlanmış kültür şişeleri ve toplama şişesi yerleştirin. Tıpaların üzerine %100 etanol damlatın ve çakmak kullanarak ateşe verin.
   2. 23 G'lik bir iğneyi 1 mL'lik bir şırıngaya monte edin. Tıpalar artık yanmadığında, iğneyi_N2 şişesine sokun ve ~1 mL_N2 çekin. İğneyi çıkarın.
   3. N_2'yi serbest bırakmak için pistona yavaşça bastırın. Şırınga boşalır boşalmaz, iğneyi toplama şişesine yerleştirin ve 0,5 mL çevresel numune alın. İğneyi çıkarın.
   4. İğneyi kültür şişesine yerleştirin ve numuneyi enjekte edin. İğneyi çıkarın.
   5. Şişeyi döndürün ve Tablo 1'de veya okuyucunun ilgilendiği ortamda belirtildiği gibi sıcaklıkta bir inkübatöre yerleştirin.
      NOT: Kültür ilerlemesi (şişe veya biyoreaktör) 0.02 mm derinliğinde bir Petroff-Hauser hemositometresi kullanılarak izlenir. Anaerobik veya titiz mikroorganizmaların zenginleştirilmesi tipik olarak OD_600'ün kullanılabildiği hücre yoğunluklarına ulaşmaz ve diğer tespit yöntemleri rutin ve tekrarlayan izleme için pratik değildir. Algılama limitleri, kalite kontrol ve istatistiksel hesaplamalar, hücre sayma odasının tipine ve kullanıcının ihtiyaçlarına bağlıdır.
2. Biyoreaktör ile büyüme
   1. Modifiye edilmiş bir şırınga ile bir balonun hazırlanması
      1. Pistonu üç adet 10 mL luer kilit şırıngasından çıkarın (her son montaj için bir tane). Her şırınganın flanşını kesin ve kopan ucu balonları delmeyecek şekilde törpüleyin. Değiştirilmiş şırıngadaki tüm talaşları temizleyin.
      2. Bir balonu diğerinin içine yerleştirerek ikiye katlanmış bir balon hazırlayın.
      3. İki katına çıkarılmış balonun ucunu modifiye edilmiş 10 mL'lik şırınganın üzerine gerin.
      4. Dış balonun ucunu iç balondan biraz ayırın. Balonlar arasında sıkışan tüm havayı sıkın.
      5. Balonları şırıngaya sabitlemek için balonların tabanının etrafına bir fermuar sıkın.
   2. Modifiye edilmiş bir tıpanın hazırlanması
      1. Pistonları on adet 1 mL luer kilit şırıngasından çıkarın (değiştirilecek her tıpa için iki tane). Flanşı şırıngalardan kesin.
      2. #10 boyutunda iki lastik tıpa (8 L damacanalar için) ve GL45 iplik kaplamalı şişeler için üç boy (yakalama şişeleri için) ayarlayın. 1/4" (6.4 mm) matkap ucu kullanarak, her bir lastik tıpanın üstünden, modifiye edilmiş şırıngaların sığması için yeterince geniş ve geçme parçasının hava geçirmez olması için yeterince dar iki delik açın.
      3. Modifiye edilmiş şırıngaları lastik tıpanın deliklerinden geçirin.
      4. Modifiye edilmiş tıpayı 121 °C'de 30 dakika boyunca temizleyin ve otoklavlayın.
   3. Biyoreaktör düzeneğinin hazırlanması
      1. Tüm muslukları, dişi luer kilit adaptörü konektörlerini ve diğer otoklavlanamayan biyoreaktör malzemelerini %70 etanol ile dezenfekte edin ve tüm boruları (uzunlamasına kestikten sonra), tıpaları, cam yünü ve diğer otoklavlanabilir biyoreaktör malzemelerini 121 °C'de 30 dakika otoklavlayın.
      2. Steril bir biyoreaktörü (Şekil 1 ve Şekil 2) bir halka standına yerleştirin ve bir zincir kayışla sabitleyin. Ayrıca bir su banyosu, bir peristaltik pompa, orta içeren tıpalı 8 L damacana (protokol adımı 1.2'den itibaren), bir adet 3,5 L şişe (örneksiz yakalama şişesi) ve bir adet 500 mL şişe (örnekleme yakalama şişesi) hazırlayın.
      3. Damacanayı durdurmak
         1. Modifiye edilmiş bir şırınga ile bir balon yerleştirin. Şırınganın luer kilit ucuna üç bir musluk bağlayın.
         2. Balon tertibatını alın ve üç vanayı_N2'lik bir tankın borusuna bağlayın. Atmosfere açık ucu kapatmak için üç vanayı çevirin.
         3. Benzin deposunu açın ve balonu_N2 ile doldurun. Dolduğunda, balonun ucunu bloke etmek için üç vanayı çevirin. Benzin deposunu kapatın ve depo borusunu üç vanadan ayırın.
         4. Aşağıdakileri sırayla bağlayın: üç bir musluk (modifiye şırıngalı balonun ucu), iki yönlü bir musluk, bir dişi luer kilit adaptörü kuplörü ve modifiye edilmiş tıpa şırıngalarından birinin luer kilit ucu.
         5. Diğer şırınganın luer kilit ucuna iki yönlü bir musluk bağlayın. Modifiye edilmiş durdurucu tertibatındaki iki vanaların her iki valfini de kapatın.
         6. Damacananın değiştirilmemiş #10 numara tıpasını tutan teli açın. Değiştirilmemiş durdurucuyu değiştirilmiş durdurucu tertibatı ile hızlı bir şekilde değiştirin ve değiştirilmiş durdurucu tertibatını damacanaya sabitlemek için teli daha önce olduğu gibi bükün.
            NOT: Kendinden emin ve hazırlıklı olunursa, modifiye edilmiş tıpa tertibatı, orta hazırlığın son adımında damacanayı durdurmak için kullanılabilir (adım 1.2.2.7).
         7. Atmosfere açık ucu kapatmak için üç vanayı çevirin. Sıralı iki yönlü vanayı açın. Balonun gazı ve 8 litrelik damacananın tepe boşluğu artık birbirine bağlanmıştır.
      4. Numune alınmayan ve numune alma yakalama şişelerinin durdurulması
         1. 3,5 L'lik örneksiz yakalama şişesini, GL45 diş kaplamalı şişeler için boyutlandırılmış, şişeye sığdırmaya yardımcı olmak için tıpanın tabanına %70 etanol uygulayarak durdurun. Şişeyi GL45 üstü açık vidalı kapakla kapatın.
         2. Aşağıdakileri sırayla bağlayın: modifiye edilmiş şırınganın luer kilit ucuna sahip bir balon, üç bir musluk, bir dişi luer kilit adaptör kuplörü ve modifiye edilmiş tıpa şırıngalarından birinin luer kilit ucu. Doğrudan atmosfere açılan ucu kapatmak için üç vanayı çevirin.
         3. Diğer şırınganın luer kilit ucuna bir dişi luer kilit adaptör kuplörü bağlayın.
         4. 500 mL örnekleme yakalama şişesi için yukarıdaki üç adımı tekrarlayın.
      5. Boru kurulumu
         1. Biyoreaktör su ceketi portları ile su banyosu hortumu dikenleri arasındaki mesafeyi ölçün. Bu mesafeyi genişletmek için iki uzunlukta 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD silikon boru kesin.
         2. GL14 üstü açık vidalı kapaklı iki düz hortum konektörünü birleştirin. Her birini iki boru parçasının bir ucuna takın.
         3. Vidalı kapakları biyoreaktör su ceketinin bağlantı noktalarına çevirin. Borunun diğer uçlarını su banyosu hortum dikenlerine takın, böylece su su banyosundan dışarı akacak, biyoreaktör su ceketinin altından girecek, su ceketinin üstünden çıkacak ve su banyosuna geri dönecektir. Boruyu su banyosu hortum dikenlerine sabitlemek için borunun uçlarının etrafındaki fermuarları sıkın.
         4. VWR Ultra Düşük Akışlı Değişken Akışlı Mini Pompaya benzer pompalar için, beraberindeki 3/16" (4.8 mm) OD oluklu boru tertibatını pompadan geçirin.
         5. Damacana boru tertibatı ile peristaltik pompa hortum tertibatı arasındaki mesafeyi ölçün. Bu mesafeyi genişletmek için 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD silikon boru uzunluğunu kesin.
         6. Borunun bir ucunu damacana boru tertibatının hortum ucuna ve diğer ucunu peristaltik pompa boru tertibatının hortum ucuna, ortamın damacanadan ve peristaltik pompadan akacak şekilde yönlendirilmiş olarak takın.
         7. Peristaltik pompa hortumu tertibatı ile biyoreaktörün alt portu arasındaki mesafeyi ölçün. Bu mesafeyi genişletmek için 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD silikon boru uzunluğunu kesin.
         8. Bu borunun bir ucunu peristaltik pompa borusu tertibatının hortum ucuna takın ve diğer ucunu dikkatlice biyoreaktörün alt portuna takın. Camı çatlatmamaya ve aynı zamanda bağlantıyı sabitlemeye dikkat ederek, boruyu biyoreaktörün alt portuna sabitlemek için borunun ucundaki bir fermuarı sıkın.
         9. Yaklaşık 5" (127 mm) uzunluğunda 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD silikon boruyu ölçün ve kesin.
         10. Üç bir vanaya bir dişi luer kilit adaptörü konektörü takın. Üç musluğun herhangi bir ucunu boruya takın.
         11. GL14 üstü açık vidalı kapaklı bir açılı hortum konektörünü monte edin. Borunun diğer ucuna takın.
         12. Vidalı kapağı biyoreaktörün en üstteki dikey portuna çevirin. Biyoreaktörü gösteren ucu kapatmak için üç vanayı çevirin.
         13. En üstteki dikey port tertibatı ile örnekleme yapmayan yakalama şişesi tertibatı arasındaki mesafeyi ölçün. Bu mesafeyi genişletmek için 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD silikon boru uzunluğunu kesin. Flanşları iki adet 1 mL luer kilitli şırıngadan kesin ve borunun uçlarına yerleştirin.
         14. Bu boru tertibatının bir ucunu en üstteki dikey bağlantı noktası tertibatının üç vanasına takın ve diğer ucunu sampling olmayan yakalama şişesi tertibatındaki dişi luer kilit adaptör konektörüne takın.
         15. En üstteki dikey port tertibatı ile numune alma şişesi tertibatı arasındaki mesafeyi ölçün. Bu mesafeyi genişletmek için 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD silikon boru uzunluğunu kesin. Flanşları iki adet 1 mL luer kilitli şırıngadan kesin ve borunun uçlarına yerleştirin.
         16. Bu boru tertibatının bir ucunu en üstteki dikey bağlantı noktası tertibatının üç vanasına takın ve diğer ucunu sampling catch şişe tertibatındaki dişi luer kilit adaptörü konektörüne.
   4. Biyoreaktörün doldurulması
      1. Biyoreaktörün GL18 portlarından birini beyaz kauçuk bir septum ile kapatın. Diğer GL18 bağlantı noktasını ve kalan dikey açıkta kalan GL14 bağlantı noktalarını GL18/GL14 boyutlu PTFE yüzlü silikon septa (PTFE cama bakacak şekilde) ve üstü açık vidalı kapaklarla kapatın.
      2. 50 cm uzunluğunda bir çubukla, biyoreaktörün tabanına 0,9 g cam yünü koyun.
      3. 121 °C'de 1,3 L kumu 30 dakika boyunca otoklavlayın. Bir huni kullanarak biyoreaktörü kumla doldurun.
         NOT: Okuyucunun çevresi ve ilgilenilen mikroorganizmalar tarafından bilgilendirilen diğer tortu türleri burada ikame edilebilir.
      4. Boruyu biyoreaktörün tepesine_N2'lik bir tanka yerleştirin ve biyoreaktör üst boşluğunu_N2 ile 2 dakika yıkayın. Biyoreaktörü hemen #7 boyutlu bir tıpa ve bir GL45 üstü açık vidalı kapakla kapatın.
      5. Örnekleme yapmayan yakalama şişesinden, hortumu ayırın ve balonu gösteren ucu kapatmak için üç vanayı çevirin. Boruyu N_2'lik bir tanka dişi luer kilit adaptörü konektörüne bağlayın ve biyoreaktör üst boşluğunu 2 dakika boyunca N₂ ile yıkayın. Boruyu hemen yeniden bağlayın ve atmosfere açık ucu kapatmak için üç vanayı geri takın.
      6. Örnekleme yakalama şişesi için yukarıdaki adımı tekrarlayın.
      7. Sampling catch şişesine işaret eden ucu kapatmak için biyoreaktörün en üstteki dikey portunun üç vanasını çevirin. Damacanadan biyoreaktöre sıvı pompalayın. Pompayı duraklatın ve numune alma şişesinin balonunu havalandırın ve damacananın balonunu gerektiği gibi N₂ ile doldurun.
      8. Biyoreaktör ortamla doldurulduktan sonra, pompa akış hızını 0,6 mL/dk'ya ayarlayın (Mini Pompada dijital değer 40).
         NOT: Okuyucu tarafından istenen diğer akış hızları burada değiştirilebilir.
      9. Su banyosu sıcaklığını, Tablo 1'de veya okuyucunun ilgilendiği ortamda belirtildiği gibi ayarlayın.
         NOT: Aşı, çalışma özelliklerine bağlı olarak bu noktada veya daha sonra eklenebilir. Bu noktada aşı yapıyorsanız, adım 3.2.4.10'a geçin. Daha sonra aşılama yapıyorsanız, adım 3.2.5'e geçin.
      10. Bir toplama şişesi veya aşılanmış kültür şişesi ve tıpalı steril bir N₂ şişesi yerleştirin. Tıpaların üzerine %100 etanol damlatın ve çakmak kullanarak ateşe verin.
      11. 23 G'lik bir iğneyi 60 mL'lik bir şırıngaya monte edin. Tıpalar artık yanmadığında, iğneyi_N2 şişesine sokun ve ~50 mL_N2 çekin. İğneyi çıkarın.
      12. N_2'yi serbest bırakmak için pistona yavaşça bastırın. Şırınga boşalır boşalmaz, iğneyi toplama şişesine yerleştirin ve 50 mL çevresel numune alın. İğneyi çıkarın.
      13. 23 G iğneyi steril uzun bir metal iğne (kanül, uzunluk 31,5 cm) ile değiştirin. Uzun metal iğneyi biyoreaktörün GL18 portundaki beyaz kauçuk septumdan geçirin.
      14. İğneyi tortuya itin ve aşıyı enjekte edin. İğneyi çıkarın.
   5. Biyoreaktör bakımının çalıştırılması
      1. Biyoreaktörün çalıştığı her gün aşağıdakileri gerçekleştirin:
         1. Su banyosu seviyesini kontrol edin. Düşükse, daha fazla su ekleyin (korozyonu ve mineral birikimini azaltarak ekipmanın uzun ömürlü olması için damıtılmış su kullanın).
         2. Örnekleme yapmayan yakalama şişesinin balonunu kontrol edin; Dolu bir balon, ortamın akışını engelleyecektir. Dolduğunda, yakalama şişesine bakan ucu kapatmak için üç vanayı çevirin. Balonu boşaltmak için sıkın; Ardından, atmosfere açık ucu kapatmak için üç vanayı geri getirin; Balon boşalana kadar tekrarlayın.
         3. 8 L damacananın balonunu kontrol edin. Düşükse, sıralı iki yönlü vanayı kapatın ve üç vanayı iki yönlü vanadan ayırın. 3.2.3.3.2, 3.2.3.3.3 ve 3.2.3.3.7 adımlarını izleyerek balon düzeneğini yeniden doldurun ve yeniden takın.
         4. 8 L damacanadaki ortamın seviyesini kontrol edin. Düşükse, başka bir 8 L damacana monte edin ve protokol adımları 1.2'yi izleyerek daha fazla orta hazırlayın. ve 3.2.3.3. Pompayı duraklatın, hortum dikenli küresel vanayı kapatın, eski damacanayı hızlıca ayırın ve yeni damacanayı bağlayın.
            NOT: 0.6 mL/dk'lık bir akış hızı için her 9 günde bir yeni ortama ihtiyaç duyulacaktır.
         5. Örnekleme yapılmayan yakalama şişesindeki ortamın seviyesini kontrol edin. Doluysa, 3.2.3.4.1 adımına göre numune alınmayan başka bir yakalama şişesi takın. Yeni şişeyi_N2 ile yıkayın, modifiye edilmiş şırınga ve hortum ile balonu eski şişeden hızlı bir şekilde ayırın ve yeni şişeye bağlayın.
         6. Değiştirilmiş tıpayı dolu, numune alınmayan bir yakalama şişesinden çıkarın. Sıvıyı 121 °C'de 30 dakika otoklavlayın; Ardından, sıvıyı okuyucunun kurumsal politikalarına göre atın. Numune alınmayan yakalama şişesi tertibatının tüm parçalarını bir sonraki kullanıma hazırlamak için temizleyin ve otoklavlayın.
      2. Aşağıdakileri yaparak her 7 günde bir (veya okuyucu tarafından istenen sayıda) örnekleme gerçekleştirin:
         1. Biyoreaktörün en üstteki dikey portunun üç vanasını, numune alınmayan yakalama şişesine işaret eden ucu bloke etmek için çevirin. 250 mL sıvı toplayın.
            NOT: 0.6 mL/dk'lık bir akış hızı için 250 mL toplamak ~7 saat sürecektir.
         2. Biyoreaktörün en üstteki dikey portunun üç vanasını, numune alma yakalama şişesine işaret eden ucu bloke etmek için geri takın. Boruyu ve s'yi ayırınampling yakalama şişesi, biyoreaktörün en üstteki dikey portunun üç vanasından.
         3. Test ettikten, sakladıktan ve/veya uygun şekilde imha edildikten sonraampling sıvısı, s'nin tüm parçalarını temizleyinampling yakalama şişesi tertibatı balon hariç, modifiye şırınga ile. Modifiye şırınga ve dişi luer kilit adaptör konektörlü balon hariç tüm parçaları 121 °C'de 30 dakika otoklavlayın. Bir sonraki numune alma günü için tekrar birleştirin.
            NOT: Gerekirse hızlı onarım ve değiştirme için parçaların, kapakların, boruların ve septaların çoğaltılması veya üç kez yedeklenmesi şiddetle tavsiye edilir.

Sonuçlar

Burada, burada açıklandığı gibi bir sondaj deliği karışık kültür ortamı hazırlama yöntemi ve bir biyoreaktör kurulum yöntemi kullanan bir biyoreaktör çalışmasının sonuçlarını gösteriyoruz. Sondaj deliği karışık kültür ortamı, bir karbon kaynağı olarak Oksidatif Hidrotermal Çözünme (OHD) ^13,14 ile işlenmiş bir mısır koçanı bulamacı içerecek şekilde modifiye edildi. Modifiye edilmiş sondaj deliği karışık kültür ...

Tartışmalar

Bu protokolün orta üretim bölümü (bölüm 1) yapısını, yayınlanmasından bu yana yaygın olarak kullanılan Miller ve Wolin^17'nin değiştirilmiş Hungate tekniğine borçludur. Bu genişletilmiş protokolün pratikliği, tanımlayıcı doğasından ve mikroorganizmaların yerinde edinilmesiyle eşleşmesinden kaynaklanmaktadır. Çevresel olarak bilgilendirilmiş ve simüle edilmiş ortam içeren kültür şişeleri, "mikrobiyal karanlık maddenin" yerinde edinilmiş eski üyele...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Materials
1 L borosillicate bottle	Fisher Scientific
1 mL syringe with slip tip	Fisher Scientific
10 mL glass pipette	Fisher Scientific
100 mL culture bottle	Fisher Scientifc
20 mm hand crimper	Fisher Scientifc
23 G needle	Fisher Scientifc
500 mL borosilicate bottle	Fisher Scientific
Aluminum seal	Fisher Scientifc
Cannula, 31.5 cm length	Fisher Scientific
Cannula, 6 cm length	Fisher Scientifc
Corer	Giddings Machine Company		Assembled from company parts
Gas manifold	Swagelok		Assembled from many different parts
Lighter	Lowe's
N2 gas	Airgas
Nitrile gloves	Fisher Scientific
Rubber stopper (for GL45 bottles)	Glasgeratebau OCHS
Rubber stopper (for culture bottles)	Ace Glass
Stirring hot plate	Corning
Trace minerals	ATCC
Vitamins	ATCC
Bioreactor-specific Materials
#10 rubber stopper	Ace Glass
#7 rubber stopper	Fisher Scientifc
1 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
1/4" hose barb ball valve	Amazon
10 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
3.5 L borosilicate bottle	Fisher Scientific
5/16" - 1/4" hose barb adapter fitting	Amazon
60 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
8 L borosillicate carboy	Allen Glass
Angled hose connector for GL14 open top cap	Ace Glass	7623-20
Balloon	Party City
Borosillicate bioreactor	Allen Scientific Glass		Custom made upon request
Drill	Lowe's
Female luer lock adapter coupler	Amazon
GL14 open top cap	Ace Glass	7621-04
GL18 open top cap	Ace Glass	7621-08
GL45 open top cap	Ace Glass
PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap	Ace Glass	7625-06
PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap	Ace Glass	7625-07
Ring stand	Fisher Scientific
Ring stand chain clamp	Amazon
Ring stand clamp	Fisher Scientific
Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od	Grainger	55YG13
Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od	Grainger
Straight hose connector for GL14 open top cap	Ace Glass	7623-22
Three-way stopcock	Amazon
Two-way stopcock	Amazon
Ultra low flow variable flow mini-pump	VWR
Water bath	Fisher Scientifc
White rubber septum for 13-18 mm od tubes	Ace Glass	9096-49
Wire	Lowe's
Zip tie	Lowe's