פרדיגמות להערכה התנהגותית במודל דרוזופילה של הפרעת הספקטרום האוטיסטי

Summary

הפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD) קשורה להתנהגות חברתית ותקשורתית לקויה ולהופעתה של התנהגות חזרתית. לצורך חקר הקשר בין גנים אוטסיים וליקויים התנהגותיים במודל דרוזופילה , מתוארות במאמר זה חמש פרדיגמות התנהגותיות להערכת ריווח חברתי, תוקפנות, חיזור, טיפוח והתנהגות הרגלה.

Abstract

הפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD) כוללת קבוצה הטרוגנית של הפרעות נוירו-התפתחותיות עם סימפטומים התנהגותיים נפוצים, כולל ליקויים באינטראקציה חברתית וביכולת תקשורת, התנהגויות מוגבלות או חוזרות משופרות, וגם, במקרים מסוימים, לקות למידה וליקוי מוטורי. דרוזופילה שימשה כאורגניזם מודל שאין שני לו למידול מספר רב של מחלות אנושיות. מכיוון שגנים רבים היו מעורבים באוטיזם, זבובי פירות התגלו כדרך רבת עוצמה ויעילה לבחון את הגנים המעורבים לכאורה בהפרעה. מכיוון שמאות גנים, בעלי תפקידים תפקודיים מגוונים, מעורבים באוטיזם, מודל זבוב גנטי יחיד של ASD אינו ישים; במקום זאת, מוטציות גנטיות בודדות, הפלות גנים, או מחקרים מבוססי ביטוי יתר של הומולוגים של זבובים של גנים הקשורים ל- ASD הם האמצעי הנפוץ להשגת תובנה לגבי מסלולים מולקולריים העומדים בבסיס תוצרי גנים אלה. שורה של טכניקות התנהגותיות זמינות בדרוזופילה המספקות קריאה קלה של ליקויים במרכיבים התנהגותיים ספציפיים. מבחני מרחב חברתי ומבחני תוקפנות וחיזור בזבובים הוכחו כיעילים בהערכת פגמים באינטראקציה חברתית או בתקשורת. התנהגות טיפוח בזבובים היא קריאה מצוינת של התנהגות חזרתית. בדיקת הרגלה משמשת בזבובים כדי להעריך את היכולת ללמידה של הרגלה, אשר נמצא מושפע אצל חלק מחולי ASD. שילוב של פרדיגמות התנהגותיות אלה יכול לשמש כדי לבצע הערכה יסודית של מצב המחלה דמוי ASD האנושי בזבובים. באמצעות שימוש בזבובים מוטנטיים מסוג Fmr1 , שחזור תסמונת ה-X השביר בבני אדם, והפלה בשורה הומולוגית של POGZ בנוירונים של זבובים, הראינו ליקויים הניתנים לכימות בריווח חברתי, תוקפנות, התנהגות חיזור, התנהגות טיפוח והרגלה. פרדיגמות התנהגותיות אלה מודגמות כאן בצורותיהן הפשוטות והפשוטות ביותר, מתוך הנחה שזה יקל על השימוש הנרחב בהן למחקר על ASD והפרעות נוירו-התפתחותיות אחרות במודלים של זבובים.

Introduction

הפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD) כוללת קבוצה הטרוגנית של הפרעות נוירולוגיות. הוא כולל מגוון של הפרעות נוירו-התפתחותיות מורכבות המאופיינות בגירעונות רב-הקשריים ומתמשכים בתקשורת חברתית ובאינטראקציה חברתית ובנוכחות דפוסי התנהגות ופעילות ותחומי עניין מוגבלים, חוזרים ונשנים¹. על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), 1 מכל 100 ילדים מאובחן עם ASD ברחבי העולם עם יחס זכר-נקבה של 4.2². המחלה מתגלה בשנה השנייה או השלישית לחיים. ילדים אוטיסטים מראים חוסר עניין בהדדיות חברתית-רגשית, תקשורת לא מילולית ומיומנויות יחסים. הם מפגינים התנהגויות חוזרות ונשנות כמו תנועה מוטורית סטריאוטיפית, מעקב שגרתי לא גמיש וטקסי, והתמקדות אינטנסיבית בתחומי עניין מוגבלים. ילדים אוטיסטים מראים רמה גבוהה של תגובה כלפי מגע, ריח, צליל וטעם, בעוד שתגובת כאב וטמפרטורה נמוכה יחסית¹. החדירה של הפרעה זו שונה גם בקרב חולים שונים הסובלים מאוטיזם ולכן השונות עולה.

האבחנה הקלינית הנוכחית של ASD מבוססת על הערכה התנהגותית של האנשים מכיוון שאין בדיקה גנטית מבוססת סמנים ביולוגיים או נפוצה המכסה את כל הצורות של ASD³. פענוח הבסיס הגנטי והנוירופיזיולוגי יסייע במיקוד אסטרטגיות הטיפול. בעשור האחרון, גוף גדול של מחקר הביא לזיהוי של מאות גנים שנמחקו או עברו מוטציה או שרמות הביטוי שלהם משתנות בחולי ASD. מחקר מתמשך מדגיש את אימות תרומתם של גנים מועמדים אלה באמצעות אורגניזמים מודל כמו עכבר או זבוב פירות, שבמסגרתם, גנים אלה מושמטים או מופלים ולאחר מכן בדיקות ליקויים התנהגותיים דמויי ASD והבהרת מסלולים גנטיים ומולקולריים בסיסיים הגורמים לאנומליות. מודל עכבר המשחזר וריאציות של מספר העתק (CNVs) באתרים הכרומוזומליים האנושיים 16p11.2 מראה חלק מהפגמים ההתנהגותיים של ASD ^4,5,6. חשיפה טרום לידתית לתרופה טרטוגנית חומצה ולפרואית (VPA) היא מודל עכבר נוסף המתאר תכונות הדומות^{לאוטיזם 7,8} אנושי. בנוסף, קיים מגוון מודלים של עכברים המציגים אוטיזם הקשור לתסמונת גנטית, לדוגמה, מודלים סינדרומיים של גן יחיד הנגרמים על ידי מוטציות ב- Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c, ומודלים לא סינדרומיים של גן יחיד הנגרמים על ידי מוטציות בגנים כמו Cntnap2, Shank, Neurexin, או Neuroligin ^{גנים 5}.

זבוב פירות (Drosophila melanogaster) הוא אורגניזם מודל בולט נוסף לחקר הבסיס התאי, המולקולרי והגנטי של שפע של הפרעות אנושיות⁹, כולל ASD. דרוזופילה ובני אדם חולקים תהליכים ביולוגיים שמורים מאוד ברמה המולקולרית, התאית והסינפטית. זבובי פירות שימשו בהצלחה במחקרי ASD 10,11,12 כדי לאפיין גנים הקשורים לאוטיזם ולפענח את תפקידם המדויק בסינפטוגנזה, תפקוד סינפטי ופלסטיות, הרכבת מעגלים עצביים והתבגרות; הומולוגים של זבובים של גנים הקשורים לאוטיזם נמצאו כבעלי תפקידים בוויסות התנהגות חברתית ו / או חזרתית 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. זבוב הפירות עבד גם כמודל לבדיקת גנים ASD וגרסאותיהם 15,22,23. האתגר הגדול ביותר במחקר ASD בזבובים הוא שבניגוד למודלים אחרים של מחלות, אין מודל אחד של זבוב ASD. כדי להבין את ההשפעה של מוטציות או הפלת גן ASD ספציפי, חוקר צריך לאמת אם הפנוטיפים ההתנהגותיים מחקים מספיק את הסימפטומים של חולי ASD ולאחר מכן, להתקדם לקראת הבנת הבסיס המולקולרי או הפיזיולוגי של הפנוטיפים.

לפיכך, זיהוי פנוטיפים דמויי ASD חיוני למחקר ASD במודל הזבוב. קומץ טכניקות התנהגותיות התפתחו במהלך השנים המאפשרות לנו לזהות חריגות כמו ליקויים בהתנהגות / אינטראקציה חברתית, תקשורת, התנהגויות חזרתיות והיענות לגירויים. בנוסף, מספר שינויים ושדרוגים של טכניקות התנהגותיות אלה נעשו במעבדות שונות כדי להתאים לדרישות ספציפיות כגון upscaling, אוטומציה של מבחנים, קריאות, כימות ושיטות השוואה. במאמר וידאו זה, הגרסאות הבסיסיות ביותר של חמש פרדיגמות התנהגותיות מודגמות, אשר, בשילוב, ניתן להשתמש בהן כדי לזהות תוצאות התנהגותיות דמויות ASD בצורה הקלה ביותר.

תוקפנות היא התנהגות מולדת שמורה אבולוציונית המשפיעה על הישרדות ורבייה²⁴. התנהגות תוקפנית כלפי פרטים מושפעת מ"מוטיבציה לחיברות"^25,26 כמו גם מ"תקשורת"²⁷, שתיהן נפגעות אצל אנשים הסובלים מאוטיזם. התנהגות תוקפנית מתוארת היטב בדרוזופילה ויכולת הכימות שלה באמצעות בדיקת תוקפנות חזקה 28,29,30 ובסיס גנטי ונוירוביולוגי מובן היטב ³¹ הופכת אותה לפרדיגמה התנהגותית מתאימה³² להערכת פנוטיפ ASD במודל זבוב. תוקפנות מושפעת מבידוד חברתי הרחק מסביבה חברתית, מה שמוביל לתוקפנות מוגברת; אותו הדבר נצפה כאשר זבובים זכרים שוכנים בבידוד במשך כמה ימים^33,34. בדיקה התנהגותית נוספת המכמתת חברותיות בזבובים היא Social Space Assay³⁵, המודדת מרחקים בין שכנים קרובים ומרחקים בין זבובים בקבוצה קטנה של זבובים, מה שהופך אותה למתאימה באופן מושלם לבדיקת תפקידם של אורתולוגים גנטיים ASD בזבוב 12,21,36,37 וכן במודלים סביבתיים של זבוב ASD ^{38, 39}.

בדיקת החיזור של דרוזופילה היא פרדיגמה התנהגותית נוספת המשמשת לעתים קרובות להערכת שינויים במיומנויות חברתיות ותקשורתיות על מעגלים או מניפולציות גנטיות, כולל גנים הקשורים לאוטיזם 18,19,21,40. דפוסי התנהגות חוזרים שכיחים בחולי ASD, אשר מגולמים בזבובים על ידי התנהגות טיפוח - סדרה של פעולות מובחנות וסטריאוטיפיות המבוצעות לצורך ניקוי ומטרות אחרות. הוא שימש בהצלחה לבדיקת ההשפעה של מוטציות בגן ASD בזבובים^21,41, כמו גם חשיפה לכימיקלים^38,39. התקדמות ואוטומציה מרובות בבדיקה תוארו לפני 16,41,42,43; כאן, אנו מדגימים את דפוס הבדיקה הבסיסי ביותר, שקל לאמץ ולכמת.

ASD ידוע כמשפיע על היכולת להרגלה, למידה וזיכרון אצל חלק מהחולים 44,45,46,47,48,49,50, אורגניזמים מודל ASD ^51,52 וגם גורם לליקויים בהתנהגויות ריח שונות⁵⁰. התרגלות קפיצה קלה של דרוזופילה שימשה בעבר לסינון גנים ASD²³. ניתן לבדוק את ההרגלה על ידי שיטה פשוטה של בדיקת הרגלת חוש הריח 53,54,55. אנו מתארים את השיטה לגרימת הרגלת חוש הריח ובודקים את התוצאה באמצעות בדיקת בחירת ריח בינארית^{קלאסית 56} המבוססת על מבוך Y, שניתן להשתמש בה כדי לזהות פגמים בהתרגלות בגן ASD, מוטציה או מצב של הפלה גנטית. כדי להעריך אם ההשפעה של מוטציה (או הפלת גנים) או טיפול תרופתי על התנהגותו של זבוב מסתכמת בפנוטיפ דמוי ASD, ניתן להשתמש בשילוב של 5 הבדיקות הללו המתוארות כאן.

Protocol

עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. מבחן תוקפנות

1. הכנת זירת מבחני התוקפנות
   1. קחו צלחת סטנדרטית של 24 בארות (איור 1A) והשתמשו בכל באר של הצלחת כ"זירה" אחת (איור 1B) לתוקפנות זבובים. מלאו חצי מכל באר במזון זבובים רגיל והניחו לו להתייבש למשך הלילה.
      הערה: לחלופין, ניתן לכלול מוקד לתוקפנות בזירה, כגון נקודה של משחת שמרים או נקבה ערופה כדי להבטיח תוקפנות גברית.
   2. קח כל יריעת פלסטיק / אקריליק שקופה, מספיק כדי לכסות את פני השטח של כשלוש עד ארבע בארות. נקב את היריעה כדי ליצור צמצם קטן בקוטר ~ 2.5 מ"מ להחדרת זבובים בודדים לבארות דרכו.
2. הכנת שואב הזבוב
   1. קחו צינור גומי/סיליקון באורך 30-50 ס"מ (איור 1C1).
   2. קח קצה פיפטה של 200 μL (או 1,000 μL) וקצץ ~ 1 ס"מ מהקצה הצר. הכנס את הקצה החתוך בקצה אחד של צינור הגומי; טיפ זה יהיה 'קצה הפה', המשמש לשאיפה מבוססת פה.
   3. קח קצה פיפטה נוסף וחתך את הקצה הצר של קצה זה כדי ליצור פתח מספיק כדי שזבוב ייכנס דרכו. הכנס את הבסיס של קצה פיפטה זה לקצה הזנב של הצינור; זה יהיה "קצה הזבוב" של השואפ, שממנו הזבוב יישאב (איור 1C2).
   4. הכניסו פיסת בד רשת או שכבה דקה של כותנה על 'קצה הזבוב' של הצינור - בצומת שבין הצינור לקצה. ודאו שזבוב שנשאף לתוך קצה הפיפטה נשאר לכוד בקצה, לפני הרשת.
   5. אוטמים את הצמתים בין הצינור לקצות הפיפט באמצעות פרפילם.
3. הכנת צינורות לבתים בודדים ובקבוקונים לדיור קבוצתי
   1. הכנת צינורות דיור יחיד
      1. הוסיפו כמעט 500 מיקרוליטר של מזון זבובים טרי לצינור מיקרופוגה בנפח 2 מ"ל (איור 1D). השתמש בצנטריפוגה קטנה כדי למשוך את המזון למטה לחלק התחתון של הצינור.
      2. הניחו את המזון כך שיתמצק בטמפרטורת החדר על ידי השארת המכסה פתוח למשך הלילה. כסו את הצינורות בחתיכת בד עדינה כדי למנוע מזבובים תועים להיכנס לצינורות.
      3. לנקב את המכסים של צינורות microfuge עם מחטים לזרימת האוויר, ולסגור את העפעפיים לאחר המזון הוא מוצק.
   2. הכנת בקבוקוני דיור קבוצתי
      1. קחו בקבוקוני זבוב רגילים ומלאו מינימום מהבקבוקונים במזון טרי שהוכן (איור 1D).
4. הכנת הזבובים לפני הניסוי
   1. לשמור על קווי זבוב של הגנוטיפים הרצויים בבקבוקי זכוכית/פלסטיק רגילים המכילים מזון זבובים סטנדרטי באינקובטור בטמפרטורה של 25°C במחזור אור/חושך של 12 שעות.
   2. אספו זבובים חדשים (0 עד 24 שעות) מהגנוטיפ הרצוי והפרידו ביניהם בהרדמה של פחמן דו חמצני באמצעות סטריאומיקרוסקופ.
   3. הכניסו מחצית מהזבובים הזכרים בנפרד ל'צינורות חד-ביתיים'. החזיקו את המחצית השנייה של הזבובים הזכרים בקבוצה של 10 עם נקבות הזבובים ב"בקבוקוני דיור קבוצתיים" רגילים היוצרים מצב חברתי. יש לאחסן את כל הצינורות והבקבוקונים בטמפרטורה של 25°C למשך 5 ימים.
      הערה: שמור על טמפרטורה של 24-25 ° C ו~ 50% לחות בחדר ההתנהגות. זני הזבובים בהם נעשה שימוש היו: w¹¹¹⁸ וזבובים מוטנטיים טרנס-הטרוזיגוטים FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)⁵⁷. זבובי Fmr1 , שהוחזקו בבידוד במשך 5 ימים, מראים ירידה משמעותית בהתקפי תוקפנות כלפי זכר אחר (איור 1E).
5. ביצוע ניסוי התנהגות תוקפנות
   1. בצע את ניסוי התוקפנות במהלך חלון הזמן ZT0-ZT3 מכיוון שהזבובים מראים פעילות שיא בתקופה זו של היום.
      הערה: ZT=זמן צייטגבר במחזור אור/חושך סטנדרטי של 12 שעות; ZT0= אורות דולקים, כלומר, תחילת שלב האור, ZT3= 3 שעות לאחר תחילת שלב האור, וכן הלאה. ZT12= אורות כבויים.
   2. להעביר שני זבובים זכרים מתאי השיכון היחידים או הקבוצתיים בשיטת שאיפת הפה לזירת התוקפנות דרך החור במכסה; הרחיקו את החור מיד כדי להבטיח שהזבובים לא יוכלו לברוח.
   3. אפשרו לזבובים להתאקלם בתוך הזירה למשך 1-2 דקות. הפעל טיימר למשך 20 דקות. וידאו להקליט את הזבובים במשך כל 20 דקות על ידי הצבת מצלמה או טלפון נייד בדיוק אנכית מעל הזירה באמצעות מעמד. ודא שסוגי ההתקפות התוקפניות גלויים בסרטון.
      הערה: הקפד על תאורה ברורה של הזירה והימנע מכל סינוור/השתקפות מהמכסה הנופל ישירות על עדשת המצלמה.
   4. חזור על הניסוי עבור 15-20 זוגות זבובים עבור כל גנוטיפ וכל סוג של תנאי דיור.
      הערה: ניתן לשלול הטיה לא מודעת על ידי סמיות כפולה של זבובי הבקרה והבדיקה, כמו גם קבצי וידאו השייכים למספר גנוטיפים.
6. ניתוח נתוני בדיקת התוקפנות
   1. העבר את קבצי הווידאו למחשב עם מסך גדול מספיק, כך שההתקפות התוקפניות גלויות.
   2. הפעל את הווידאו וספור את המספר הכולל של התקפות אגרסיביות בטווח זמן של 20 דקות^58,59.
   3. לאסוף ולארגן נתונים מכל גנוטיפ ומכל תבנית דיור בגיליון אלקטרוני ולבצע ניתוח נתונים באמצעות כל תוכנה סטטיסטית. בצע בדיקת t דו-זנבית והתווה את הנתונים כקופסה ושפם.

2. בדיקת מרחב חברתי

הערה: פרוטוקול הבדיקה, הזירה והניתוח המתוארים כאן תוארו בעבר^60,61.

1. הכנת זירת מבחן המרחב החברתי (SSA)
   1. הניחו את שני הספייסרים האקריליים המשולשים (גובה = 8.9 ס"מ, בסיס = 6.7 ס"מ, ועובי = 0.3 ס"מ) שטוחים על גבי חלון זכוכית מלבני (13.5 ס"מ x 10.4 ס"מ, עובי 0.3 ס"מ) כך שהזוויות הישרות של המרווחים האקריליים מיושרות עם פינות חלון הזכוכית (איור 2A).
   2. הניחו שני ספייסרים אקריליים מלבניים (6.7 ס"מ x 1.5 ס"מ, עובי = 0.3 ס"מ) שטוחים על שמשת הזכוכית, מיושרים עם בסיסי שני המרווחים המשולשים. לאחר סידור זה, אשרו שארבעת הספייסרים האקריליים מקיפים זירה משולשת (~2.16 ס"מ מרובע⁶¹) על חלון הזכוכית המלבנית שאינה מכוסה על ידי ספייסרים (איור 2A,B). הניחו מדבקה של סרגל (איור 2C) על אחד המרווחים המשולשים וודאו שהוא נראה מלמעלה.
   3. כעת הניחו חלונית זכוכית מלבנית שנייה (13.5 ס"מ על 10.4 ס"מ, עובי 0.3 ס"מ) על גבי המרווחים האקריליים כך שהיא מתיישרת עם זגוגית הזכוכית בתחתית; ספייסרים אקריליים היו בסופו של דבר דחוקים בין חלל הזכוכית, ומשאירים חלל משולש באמצע בין שתי שמשות זכוכית. השתמש בארבעה תפסי קלסר קטנים כדי להחזיק את החלוניות והספייסרים.
2. הכנת הזבובים ל-SSA
   1. אספו זבובים שזה עתה נסגרו (0 עד 24 שעות) מהגנוטיפ הרצוי והפרידו ביניהם בהרדמה קרה באמצעות סטריאומיקרוסקופ.
      הערה: יש לקרר את מנגנון ההרדמה הקרה (ניתן להשתמש בצלוחית פטרי) באינקובטור של -20°C. הכניסו את הזבובים לבקבוקונים ריקים, טבלו אותם בקרח (בדלי קרח) עד שהזבובים יהפכו לחסרי תנועה, הניחו אותם על צלחת הפטרי הקרה והתחילו למיין.
   2. אחסנו את הזבובים הזכרים והנקבות בנפרד למשך 24 שעות בבקבוקוני מזון באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס עם מחזור אור/חושך של 12 שעות.
      הערה: עבור הניסויים שהודגמו כאן, זני הזבובים ששימשו היו w¹¹¹⁸ וזבובים מוטנטיים טרנס-הטרוזיגוטים FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
3. ביצוע ניסוי SSA
   1. שמור על אותם תנאי ניסוי כמו בדיקת התוקפנות (טמפרטורה: 24-25 מעלות צלזיוס, לחות ~ 50%) ובצע את הניסוי בחלון הזמן ZT0-ZT3.
   2. הסר את תפס הקלסר הימני התחתון והסט מעט את המרווח המלבני כלפי חוץ, כך שייווצר רווח (~0.5 ס"מ) בין שני המרווחים המלבניים.
   3. מעבירים זבובים (שנאספו ביום הקודם) מבקבוקון המזון לבקבוקון ריק. העברתם לזירת המרחב החברתי (האזור המשולש) על ידי שאיפה עדינה דרך החלל שנוצר בין הספייסרים המלבניים. סגרו מיד את החלל על ידי החלקת הספייסר המלבני ותפס הקלסר בחזרה למקומם וודאו שלא נותר מקום לזבובים לברוח.
   4. על ידי החזקת התא במצב זקוף, הכו בעדינות את התא 3x על כרית רכה כדי להבטיח שכל הזבובים נמצאים בבסיס התא בתחילת הניסוי.
   5. מהדק את תא SSA במצב זקוף והפעל את הטיימר. צלם תמונה ברורה של הזירה לאחר 20 דקות כאשר הזבובים מתיישבים בעמדותיהם בזירה ומראים תנועה מינימלית. הימנעו מסנוור ומתאורה לא סדירה.
   6. חזור על הניסוי 3x עבור אותה אוכלוסיית זבובים על ידי הכאת הזבובים וחזרה על השלבים משלבים 2.3.5 עד 2.3.7 (העתקים פנימיים). חזור 3x עם אוכלוסייה שונה של זבובים מאותו גנוטיפ/מצב (חזרות בלתי תלויות).
      הערה: הקפא את תא הבדיקה כדי להשליך את הזבובים מהחדר. נגבו את משטחי הזכוכית והפלסטיק באתנול כדי להסיר את כל הריחות לאחר סבב אחד של ניסוי שנעשה עם קבוצה אחת של זבובים.
4. ניתוח נתוני בדיקת המרחב החברתי
   1. נתחו את התמונות בתוכנת ImageJ⁶² ורשמו את מרחקי השכנים הקרובים ביותר לטיסה כפי שתואר קודם לכן⁶¹.
   2. ביצוע ניתוח סטטיסטי ושרטוט גרפים באמצעות תוכנה סטטיסטית.
      הערה: זני הזבובים ששימשו לבדיקת SSA המתוארת כאן היו w¹¹¹⁸ ו-Fmr1 trans-heterozygote mutant flies (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)⁵⁷. זבובי Fmr1 מראים מרחק גדול משמעותית מהשכנים הקרובים ביותר (איור 2D).

3. בדיקת חיזור

1. תא החיזור
   1. הרכיבו את כל ארבעת חלקי תא החיזור (איור 3A) יחד בסדר שמוצג באיור 3B. כל נקב של הדיסק המרכזי, הדחוק בין המכסה לחלקי הבסיס, ישמש כ"תא חיזור" (איור 3C).
2. השגת נקבות מזווגות מראש
   1. התחל ותחזק בקבוקי תרבית מרובים של CS (קנטון S, סוג פראי) זבובים עם ~ 60-100 זבובים זכרים ונקבות בכל בקבוק מזון.
   2. כאשר הבוגרים מגיחים, השליכו את כל הזבובים הבוגרים והעבירו את הזבובים היוצאים מבקבוקים אלה כל 2-3 שעות לבקבוקוני מזון חדשים בתוספת כמות זעירה של משחת שמרים.
      הערה: הימנעו מצפיפות יתר של הבקבוקונים. היזהרו שלא להעביר זבובים, זחלים או גלמים ישנים לבקבוקון ההזדווגות.
   3. דגרו על "בקבוקוני הזדווגות" אלה במשך 4 ימים כדי להבטיח שכל הנקבות הזדווגו.
3. הכנת צינורות דיור יחיד לזכרים
   1. הוסף כמעט 500 μL של מזון זבובים לכל צינור מיקרופוגה 2 מ"ל. השתמש במכונת מיניצנטריפוגות כדי למשוך את המזון למטה לחלק התחתון של הצינור.
   2. אפשר התמצקות לילה של המזון, לחתוך את המכסה של צינור microfuge, לכסות אותו עם parafilm, ולנקב את parafilm עם מחט לזרימת האוויר.
4. איסוף ובידוד זכרים בתולים
   1. הגדר צלבים עם 10-15 זכרים ו 20-30 נקבות בתולות של הגנוטיפים הרצויים בבקבוקוני מזון נפרדים.
   2. אספו זכרים בתולים מהגנוטיפים הרצויים מהצאצאים ושמרו אותם בנפרד ב"צינורות חד-ביתיים" באמצעות השואב. המשיכו לאסוף זכרים שזה עתה נסגרו כל 5-6 שעות (עד 40-50 זכרים לכל גנוטיפ) ולבודד אותם בצינורות בודדים בעלי דיור יחיד.
   3. אטמו מחדש את מכסה הצינור עם הפרפילם.
5. ביצוע ניסוי בדיקת החיזור
   1. לאחר 5 ימים של בידוד של זכרי הבדיקה, בצע את בדיקת החיזור בחלון הזמן ZT0-ZT3.
   2. הגדר את התקני הקלטת הווידאו זמן רב מראש תוך התמקדות בסביבת העבודה של המבחן.
   3. בעזרת שואף, לאסוף נקבה אחת premated (6-10 ימים) מן בקבוקוני ההזדווגות ולהכניס לתוך תא חיזור.
   4. בעזרת השואב, מעבירים בעדינות זבוב זכר (בקרה/בדיקה) מצינור השיכון הבודד לתא החיזור המכיל את הנקבה הקדם-מזווגת היחידה דרך חור ההעברה. סובב את המכסה במהירות כדי לסגור את התא.
   5. וידאו להקליט את ההתנהגות של הזבובים במשך 15 דקות.
6. ניתוח נתוני וידאו וסטטיסטיקה
   1. להעביר את קבצי הווידאו למחשב; שימו לב למשך הזמן שבילה הזכר בחיזור במשך 15 דקות על ידי מעבר ידני על הסרטון.
   2. חשב את מדד החיזור (CI) עבור כל זבוב זכר, שהוא החלק (או האחוז) של הזמן שהזכר בילה בחיזור אחר הנקבה במשך 15 דקות.
   3. ספרו את המספר הכולל של ניסיונות ההזדווגות ב-15 דקות.
   4. שימו לב למשך זמן הפיגור שהפגין הזכר לפני ניסיונו הראשון לחזר אחריו כחביון החיזור (CL).
      הערה: מומלץ לנתח 40-60 זכרים לכל מצב/גנוטיפ כדי להשיג כוח סטטיסטי ולקבוע את עקביות תוצאות CI.

4. בדיקת התנהגות טיפוח

1. זירת בדיקת התנהגות טיפוח
   1. השתמש בתא עגול קטן עם נפח של ~0.4 ס"מ³ כזירה לתיעוד התנהגות הטיפוח.
      הערה: אותה זירת חיזור המתוארת בסעיף 3 עשויה לשמש לבדיקת התנהגות טיפוח.
   2. מכיוון שהתנהגות הטיפוח כוללת הקלטה של תנועה של איברים עדינים יותר כמו רגליים, השתמש בהקלטת וידאו ברזולוציה גבוהה או בניגודיות גבוהה. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש בלוח LED מכוסה זכוכית מפוזרת כמשטח מואר באופן אחיד במידות 20 ס"מ x 20 ס"מ. הניחו את תא החיזור על גבי הפאנל כדי להבטיח שהאור יעבור מלמטה דרך החדר.
2. הכנת הזבובים לפני הניסוי
   1. שמור על גנוטיפ ניסיוני זבובים בבקבוקי מזון ב 25 ° C עם מחזור אור / חושך 12 שעות.
   2. אספו זבובים שזה עתה נסגרו (0 עד 24 שעות) מהגנוטיפ הרצוי והפרידו ביניהם בהרדמה קרה באמצעות סטריאומיקרוסקופ כמתואר במבחן המרחב החברתי.
   3. בודדו את הזבובים הזכרים בצינורות חד-ביתיים (כפי שנעשה בהם שימוש בבדיקת התוקפנות) למשך 24 שעות.
      הערה: בניסוי שהודגם כאן, זני הזבובים בהם נעשה שימוש היו: W¹¹¹⁸ וזבובים מוטנטיים טרנס-הטרוזיגוטים FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
3. ביצוע בדיקת התנהגות הטיפוח
   1. לשמור על טמפרטורה של 24-25 °C ולחות ~ 50%; בצע את הניסוי במהלך חלון הזמן ZT0-ZT3¹⁶.
   2. העבירו זבוב זכר בודד מצינור חד-ביתי לזירת הטיפוח באמצעות שאיפה. החלק מיד את החור במכסה כדי להבטיח שהזבובים לא יוכלו לברוח.
   3. הניחו את זירת הטיפוח על לוח LED מפוזר ואפשרו לזבוב להתאקלם בתוך הזירה למשך דקה. וידאו להקליט את הזבוב במשך 10 דקות על ידי הצבת המצלמה בדיוק אנכית מעל הזירה רכוב על מעמד. ודא שסוגי התקפי הטיפוח גלויים וניתנים לכימות בסרטון.
      הערה: התנהגות הטיפוח כוללת שפשוף של הראש, העיניים, האנטנות, בית החזה, הבטן, איברי המין והכנפיים ברגליים (זוג ראשון: T1, זוג שני: T2, או זוג רגליים שלישי: T3). פרמטרים התנהגותיים של טיפוח שנלקחו בחשבון במחקר זה הם כפי שתוארו ב-Andrew et al. ⁴¹ והודגמו באיור 4.
   4. חזור על הניסוי עבור כל גנוטיפ.
   5. ניתוח הנתונים ההתנהגותיים של הטיפוח
      1. נתח את הסרטונים וחשבארבעת הפרמטרים הבאים: מדד הטיפוח (אחוז הזמן המושקע בטיפוח); חביון טיפוח (זמן עד התקף הטיפוח הראשון); מספר התקפת טיפוח; ומשך התקף טיפוח ממוצע (משך התקף כולל/מספר התקף).
      2. סמן התקף טיפוח יחיד כגמור כאשר זבוב מפסיק להראות את אחד הפרמטרים ונשאר ללא תנועה במשך 2 שניות או עוצר את ההתקף והולך לפחות 4 צעדים.

5. בדיקה להרגל חוש הריח

הערה: כפי שניתן לראות באיור 5, ההרכבה הסופית צריכה להיעשות ביום בדיקת מבוך Y-maze^54,56.

1. הכנת זבובים להרגלה
   1. להעלות זבובים של הגנוטיפים הרצויים לכל הניסויים באינקובטור עם טמפרטורת סביבה של 25 ^oC ו 70% לחות תחת תקן 12 שעות אור: 12 שעות מחזור כהה (LD).
   2. אספו 0-12 שעות, זבובים חדשים שנסגרו לאחרונה והעבירו ~ 30-40 זבובים בבקבוק בינוני טרי עם פקק כותנה מהודק.
   3. הקצו קודים לכל בקבוק כדי לשמור על הנסיין עיוור לגבי הגנוטיפים הנמצאים בניסוי.
2. השראת הרגלת חוש הריח
   1. מניחים 1 מ"ל של הריח המועדף מהולל בנוזל פרפין (קל) בצינור מיקרופוגה של 1.5 מ"ל. עבור הבקרה, פשוט להשתמש 1 מ"ל של אור נוזלי פרפין בצינור microfuge 1.5 מ"ל. מערבבים את התוכן בצינור למשך 10 דקות כדי להבטיח ערבוב אחיד ולאחר מכן מכסים אותו בניילון נצמד מחורר באופן שווה.
      הערה: בסרטון, 20% אתיל בוטיראט ישמש.
   2. השתמש בחוט כדי להשהות את הצינורות המכילים את הריח המדולל או רק את הנוזל המדלל בבקבוקי מדיה נפרדים המכילים זבובים.
   3. מכסים היטב את הבקבוקים בצמר גפן ולאחר מכן עוטפים בנייר קראפט כדי למנוע דיפוזיה של אדי הריח. תייגו את בקבוקי הבקרה והריח כנאיביים וחשופים לריח (רגילים), בהתאמה. שמור בקבוקי אינדוקציה אלה במשך 3 ימים באינקובטור עם התנאים הנ"ל.
3. הכנת זבובים ומנגנון מבוך Y
   1. מעבירים את הזבובים מבקבוקי האינדוקציה לבקבוקונים המכילים רק נייר סינון ספוג מים.
   2. הרעיבו אותם במשך כ-16-18 שעות בטמפרטורת החדר לפני הניסוי כדי להגביר את המוטיבציה.
   3. ודא שהרכיבים של מנגנון מבוך Y נקיים ונטולי ריח; להרכיב את ארבעת החלקים בצורה אנכית. חברו את תאי הטיפוס למבוך Y, המחובר לאחר מכן לחלק העליון של המתאם. חברו היטב את תחתית מבוך ה-Y לבקבוקון הכניסה המשמש כגבעול המרכזי בתחתית, כפי שמוצג באיור 5.
   4. חברו את הקצה המתחדד של כל תא טיפוס לבקבוקי ריאגנטים המכילים ריחות (^10-3 דילול עם מים מזוקקים) באמצעות צינורות סיליקון נטולי ריח.
   5. יש לשאוב את הריח בקצב זרימה שווה (~120 מ"ל/דקה) מבקבוקי הגז לשתי זרועות ה-Y בעזרת משאבת ואקום ולאפשר לו להרוות למשך 15 דקות לקבלת עקביות.
4. ביצוע מבחן מבוך Y קלאסי
   1. הכניסו בעדינות את הזבובים המורעבים של כל בקבוקון לבקבוקון הכניסה של מערך מבוך Y.
   2. לאפשר להם להתאקלם לתקופה קצרה; חבר את בקבוקון הכניסה עם מתאם Y מבוך כדי להתחיל את הבדיקה; והניחו לזבובים לטפס על זרועות מבוך ה-Y ולהילכד בשני תאי האיסוף. הגדר את משך הזמן של כל בדיקה לדקה אחת.
   3. בסיום, הקש בחזרה על הזבובים לתחתית בקבוקון הכניסה והחלף את מיקום הזרועות של מבוך Y כדי למנוע הטיית צד. קח ארבע קריאות עבור אותה קבוצה של זבובים.
   4. רשום את מספר הזבובים המטפסים על כל אחת משתי הזרועות של מבוך Y בתוך משך הזמן.
   5. חזור על הבדיקה עבור לפחות 8 אצוות כדי לקבל ערכת נתונים מייצגת.
5. ניתוח ופרשנות של נתונים שנאספו
   1. כמת את התוצאות על ידי חישוב מדד הביצועים (PI), אשר יכול להיות מיוצג כהפרש בין מספר הזבובים הבוחרים בזרוע האוויר (A) לבין מספר הזבובים הבוחרים בזרוע הריח (O) כשבריר מהמספר הכולל של הזבובים המשתתפים.
   2. השתמש במבחנים סטטיסטיים ( מבחן t של סטודנט לא מזווג) כדי לבדוק אם PI של זבובים תמימים לעומת זבובים שנחשפו לריח הוא משמעותי.

תוצאות

בדיקת תוקפנות
כמודל ASD זבוב, זבובים מוטנטיים Fmr1 שימשו^63,64. w¹¹¹⁸ זכרים שימשו כביקורת ו-Fmr1 trans-heterozygote Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M⁵⁷ זבובים זכרים כזבובי ניסוי; זכרים בוגרים שוכנו בצינורות בידוד במשך 5 ימים. זכרים הומוטיפיים (אותו גנ?...

Discussion

דרוזופילה משמשת כאורגניזם מודל משובח למחקר בהפרעות נוירולוגיות בבני אדם בשל רמה גבוהה של שימור רצפי גנים בין גנים של זבובים ומחלות אנושיות⁹. פרדיגמות התנהגותיות חזקות רבות הופכות אותו למודל אטרקטיבי לחקר פנוטיפים המתבטאים במוטציות המשחזרות מחלות אנושיות. מכיוון שמאות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aggression arena:
Standard 24-well plate made of transparent polystyrene			12 cm x 8 cm x 2 cm. Diameter of a single well= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; depth = 1 cm
Transparent plastic/acrylic sheet			Alternative: a perforated lid of a cell culture plate
Social Space Assay:
Binder clips			19 mm
Glass sheets and acrylic sheets of customized sizes			Thickness = 5 mm
Courtship assay:
Nut and bolt with threading
Perspex sheets of customized shapes			i) Lid: A custom-made round transparent Perspex disk (2-3 mm thickness, 70 mm diameter) with one loading hole at the peripheral region and another screw hole at the center (diameter ~ 3 mm for each); ii) A second transparent thicker Perspex disk (3-4 mm thickness, 70 mm diameter), with 6-8 perforations of diameter 15 mm, equidistant from the center; iii) Base: Same as lid except without the loading hole
Grooming assay:
Diffused glass-covered LED panel			10–15-Watt ceiling mountable LED panel
Habituation and Y-maze assay
Climbing chambers			x2, Borosilicate glass
Adapter for connecting Y-maze with entry vial			Perspex, custom made, measurements in Figure 5A
Clear reagent bottles			Borosil #1500017
Gas washing stopper			Borosil #1761021
Glass vial			OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Odorant (Ethyl Butyrate)			Merck #E15701
Paraffin wax (liquid) light			SRL #18211
Roller clamps			Polymed #14098
Silicone tubes			OD = 0.6 cm, ID = 0.3 cm; roller clamps for flow control
Vacuum pump			Hana #HN-648 (Any aquarium pump with flow direction reversed manually)
Y-maze			Borosilicate glass
Y-shaped glass tube (borosilicate glass)			Custom made, measurements in Figure 5A
Common items:
Any software for video playback (eg.- VLC media player)			https://www.videolan.org/vlc/
Computer for video data analysis
Fly bottles			OD= 60 mm x Height= 140 mm; glass/polypropylene
Fly vials			OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Graph-pad Prism software			https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ImageJ software			https://imagej.net/downloads
Timer
Video camera with video recording set up			Camcorder or a mobile phone camera will work
For Fly Aspirator:
Cotton			Absorbent, autoclaved
Parafilm			Sigma-aldrich #P7793
Pipette tips			200 µL or 1000 µL, choose depeding on outer diameter of the silicone tube
Silicone/rubber tube			length= 30-50 cm. The tube should be odorless
Composition of Fly food:
Ingredients (amount for 1 L of food)
Agar (8 g)			SRL # 19661 (CAS : 9002-18-0)
Cornflour (80 g)			Organic, locally procured
D-Glucose (20 g)			SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
Propionic acid (4 g)			SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
Sucrose (40 g)			SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
Tego (Methyl para hydroxy benzoate) (1.25 g)			SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
Yeast Powder (10 g)			HIMEDIA # RM027
Fly lines used in the experiments in this study:
Wild type (Canton S or CS)			BDSC # 64349
w1118			BDSC # 3605
w[1118]; Fmr1[Δ50M]/TM6B, Tb[+]			BDSC # 6930
w[*]; Fmr1[Δ113M]/TM6B, Tb[1]			BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)			BDSC # 50742
LN1-GAL4			NP1227, NP consortium, Japan
row-shRNA			BDSC # 25971