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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il disturbo dello spettro autistico (ASD) è associato a un comportamento sociale e comunicativo alterato e all'emergere di comportamenti ripetitivi. Per studiare l'interrelazione tra i geni ASD e i deficit comportamentali nel modello di Drosophila , in questo articolo vengono descritti cinque paradigmi comportamentali per valutare il distanziamento sociale, l'aggressività, il corteggiamento, l'adescamento e il comportamento di assuefazione.

Abstract

Il Disturbo dello Spettro Autistico (ASD) comprende un gruppo eterogeneo di disturbi dello sviluppo neurologico con sintomi comportamentali comuni, tra cui deficit nell'interazione sociale e nella capacità di comunicazione, comportamenti limitati o ripetitivi migliorati e, in alcuni casi, difficoltà di apprendimento e deficit motorio. La Drosophila è servita come organismo modello senza pari per la modellazione di un gran numero di malattie umane. Poiché molti geni sono stati implicati nell'ASD, i moscerini della frutta sono emersi come un modo potente ed efficiente per testare i geni presumibilmente coinvolti nel disturbo. Poiché centinaia di geni, con vari ruoli funzionali, sono implicati nell'ASD, un singolo modello genetico di ASD è irrealizzabile; invece, singoli mutanti genetici, knockdown genici o studi basati sulla sovraespressione degli omologhi dei geni associati all'ASD sono i mezzi comuni per ottenere informazioni sui percorsi molecolari alla base di questi prodotti genici. In Drosophila sono disponibili una serie di tecniche comportamentali che forniscono una facile lettura dei deficit in specifiche componenti comportamentali. Il saggio dello spazio sociale e i saggi di aggressività e corteggiamento nelle mosche si sono dimostrati utili nella valutazione dei difetti nell'interazione sociale o nella comunicazione. Il comportamento di toelettatura nelle mosche è un'eccellente lettura del comportamento ripetitivo. Il test di assuefazione viene utilizzato nei moscerini per stimare la capacità di apprendimento dell'assuefazione, che risulta essere influenzata in alcuni pazienti con ASD. Una combinazione di questi paradigmi comportamentali può essere utilizzata per effettuare una valutazione approfondita dello stato di malattia umana simile all'ASD nei moscerini. Utilizzando le mosche mutanti Fmr1 , la ricapitolazione della sindrome dell'X fragile negli esseri umani e il knockdown delle file omologhe POGZ nei neuroni dei moscerini, abbiamo mostrato deficit quantificabili nel distanziamento sociale, nell'aggressività, nel comportamento di corteggiamento, nel comportamento di toelettatura e nell'assuefazione. Questi paradigmi comportamentali sono qui dimostrati nelle loro forme più semplici e dirette con l'ipotesi che ne faciliterebbero l'uso diffuso per la ricerca sull'ASD e altri disturbi dello sviluppo neurologico nei modelli di mosca.

Introduzione

Il Disturbo dello Spettro Autistico (ASD) comprende un gruppo eterogeneo di disturbi neurologici. Comprende una serie di disturbi complessi del neurosviluppo caratterizzati da deficit multicontestuali e persistenti nella comunicazione e nell'interazione sociale e dalla presenza di modelli comportamentali e di attività ristretti e ripetitivi e interessi1. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), a 1 bambino su 100 viene diagnosticato l'ASD in tutto il mondo con un rapporto maschi/femmine di 4,22. La malattia si manifesta nel secondo o terzo anno di vita. I bambini con ASD mostrano una mancanza di interesse per la reciprocità socio-emotiva, la comunicazione non verbale e le capacità relazionali. Esibiscono comportamenti ripetitivi come il movimento motorio stereotipato, il seguire la routine inflessibile e ritualizzata e un'intensa attenzione agli interessi ristretti. I bambini con ASD mostrano un alto grado di risposta al tatto, all'olfatto, al suono e al gusto, mentre la risposta al dolore e alla temperatura èrelativamente bassa. Anche la penetranza di questo disturbo è diversa tra i diversi pazienti affetti da ASD e quindi la variabilità aumenta.

L'attuale diagnosi clinica di ASD si basa sulla valutazione comportamentale degli individui in quanto non esiste un test genetico comune basato su biomarcatori di conferma che copra tutte le forme di ASD3. Decifrare le basi genetiche e neurofisiologiche sarebbe utile per indirizzare le strategie di trattamento. Nell'ultimo decennio, un ampio corpus di ricerche ha portato all'identificazione di centinaia di geni che sono stati eliminati o mutati o i cui livelli di espressione sono alterati nei pazienti con ASD. La ricerca in corso enfatizza la convalida del contributo di questi geni candidati utilizzando organismi modello come il topo o il moscerino della frutta, in cui questi geni vengono eliminati o abbattuti, seguiti da test per deficit comportamentali simili all'ASD e chiarimenti dei percorsi genetici e molecolari sottostanti che causano le anomalie. Un modello murino che ricapitola le variazioni del numero di copie (CNV) nei loci cromosomici umani 16p11.2 mostra alcuni dei difetti comportamentali dell'ASD 4,5,6. L'esposizione prenatale a un farmaco teratogeno, l'acido valproico (VPA) è un altro modello murino che raffigura tratti simili all'ASD 7,8 umano. Inoltre, esiste una serie di modelli murini che mostrano autismo associato alla sindrome genetica, ad esempio, modelli sindromici a singolo gene causati da mutazioni in Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c e modelli non sindromici a singolo gene causati da mutazioni in geni come Cntnap2, Shank, Neurexin o Neuroligin 5.

Il moscerino della frutta (Drosophila melanogaster) è un altro importante organismo modello per lo studio delle basi cellulari, molecolari e genetiche di una pletora di malattie umane9, tra cui l'ASD. La Drosophila e l'uomo condividono processi biologici altamente conservati a livello molecolare, cellulare e sinaptico. I moscerini della frutta sono stati utilizzati con successo negli studi sull'ASD 10,11,12 per caratterizzare i geni legati agli ASD e decifrare il loro ruolo esatto nella sinaptogenesi, nella funzione sinaptica e nella plasticità, nell'assemblaggio dei circuiti neurali e nella maturazione; Si è scoperto che gli omologhi dei geni associati all'ASD hanno un ruolo nella regolazione del comportamento sociale e/o ripetitivo 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Il moscerino della frutta ha anche funzionato come modello per lo screening dei geni ASD e delle loro varianti 15,22,23. La sfida più grande nella ricerca sull'ASD nei moscerini è che, a differenza di altri modelli di malattia, non esiste un unico modello di mosca ASD. Per comprendere l'impatto delle mutazioni o dell'abbattimento di uno specifico gene ASD, un ricercatore deve convalidare se i fenotipi comportamentali imitano sufficientemente i sintomi dei pazienti con ASD e quindi procedere verso la comprensione delle basi molecolari o fisiologiche dei fenotipi.

Pertanto, il rilevamento di fenotipi ASD-like è vitale per la ricerca sull'ASD nel modello di mosca. Nel corso degli anni sono emerse una manciata di tecniche comportamentali che ci consentono di rilevare anomalie come deficit nel comportamento/interazione sociale, comunicazione, comportamenti ripetitivi e reattività agli stimoli. Inoltre, diverse modifiche e aggiornamenti di queste tecniche comportamentali sono stati apportati in diversi laboratori per soddisfare requisiti specifici come l'upscaling, l'automazione dei saggi, le letture, la quantificazione e i metodi di confronto. In questo articolo video, vengono dimostrate le versioni più basilari di cinque paradigmi comportamentali che, in combinazione, possono essere utilizzati per rilevare gli esiti comportamentali simili all'ASD nel modo più semplice.

L'aggressività è un comportamento innato conservato evolutivamente che influenza la sopravvivenza e la riproduzione24. Il comportamento aggressivo nei confronti dei conspecifici è influenzato dalla "motivazione alla socializzazione"25,26 e dalla "comunicazione"27, entrambi compromessi negli individui affetti da ASD. Il comportamento aggressivo è ben descritto in Drosophila e la sua quantificabilità attraverso il robusto saggio di aggressività 28,29,30 e una base genetica e neurobiologica ben compresa31 lo rende un paradigma comportamentale adatto 32 per valutare il fenotipo ASD in un modello di mosca. L'aggressività è influenzata dall'isolamento sociale lontano da un ambiente sociale, che porta a una maggiore aggressività; Lo stesso è stato osservato quando i moscerini maschi sono alloggiati in isolamento per alcuni giorni33,34. Un altro test comportamentale che quantifica la socievolezza nei moscerini è il Social Space Assay35, che misura le distanze tra i vicini più prossimi e le distanze tra i moscerini in un piccolo gruppo di mosche, rendendolo perfettamente adatto per testare i ruoli degli ortologhi del gene ASD nei moscerini 12,21,36,37 e nei modelli di mosche ASD indotti dall'ambiente 38. 39.

Il test di corteggiamento della Drosophila è un altro paradigma comportamentale frequentemente utilizzato per analizzare l'alterazione delle abilità sociali e comunicative su circuito o manipolazione genetica, compresi i geni correlati all'autismo 18,19,21,40. I modelli di comportamento ripetitivi sono prevalenti nei pazienti con ASD, che si ricapitola nelle mosche con il comportamento di toelettatura, una serie di azioni distinte e stereotipate eseguite per la pulizia e altri scopi. È stato utilizzato con successo per valutare l'impatto delle mutazioni del gene ASD nei moscerini21,41 e l'esposizione a sostanze chimiche 38,39. Molteplici avanzamenti e automazione nel saggio sono stati descritti prima del 16,41,42,43; In questo articolo, stiamo dimostrando il modello di analisi più semplice, che è facile da adottare e quantificare.

È noto che l'ASD influisce sulla capacità di assuefazione, apprendimento e memoria in alcuni pazienti 44,45,46,47,48,49,50, organismi modello ASD 51,52 e causa anche deficit in diversi comportamenti olfattivi50. L'abitudine al salto a luci spente di Drosophila è stata utilizzata in precedenza per lo screening dei geni ASD23. L'assuefazione può essere valutata con un semplice metodo di saggio di assuefazione olfattiva 53,54,55. Descriviamo il metodo per indurre l'assuefazione olfattiva e saggiamo il risultato utilizzando un classico saggio binario di scelta dell'odore basato sul labirinto a Y56 che può essere utilizzato per rilevare difetti nell'assuefazione in condizioni di mutazione del gene ASD o knockdown genico. Per valutare se l'impatto di una mutazione (o di un gene knock-down) o di un trattamento farmacologico sul comportamento di una mosca equivalga a un fenotipo ASD-like, si può utilizzare una combinazione di questi 5 saggi descritti qui.

Protocollo

Consultare la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e i reagenti utilizzati in questo protocollo.

1. Saggio di aggressività

  1. Preparazione dell'arena del saggio di aggressione
    1. Prendi una piastra standard a 24 pozzetti (Figura 1A) e usa ogni pozzetto della piastra come un'unica "arena" (Figura 1B) per l'aggressione delle mosche. Riempi metà di ogni pozzetto con normale cibo per mosche e lascialo asciugare per una notte.
      NOTA: Opzionalmente, un punto focale per l'aggressione può essere incluso nell'arena, come un punto di pasta di lievito o una femmina decapitata per garantire l'aggressione maschile.
    2. Prendi qualsiasi foglio di plastica/acrilico trasparente, sufficiente a coprire la superficie di circa tre o quattro pozzetti. Forare il foglio per creare una piccola apertura di ~2,5 mm di diametro per inserire le singole mosche nei pozzetti attraverso di esso.
  2. Preparazione dell'aspiratore di mosche
    1. Prendi un tubo di gomma/silicone lungo 30-50 cm (Figura 1C1).
    2. Prendi un puntale per pipetta da 200 μl (o 1.000 μl) e taglialo a ~1 cm dal puntale stretto. Inserire l'estremità tagliata a un'estremità del tubo di gomma; Questa punta sarà l'"estremità della bocca", utilizzata per l'aspirazione basata sulla bocca.
    3. Prendi un altro puntale per pipetta e taglia l'estremità stretta di questo puntale per creare un'apertura sufficiente per consentire l'ingresso di una mosca attraverso di esso. Inserire la base di questo puntale per pipetta nell'estremità della coda del tubo; questa sarà l'"estremità di volo" dell'aspiratore, da cui la mosca verrà aspirata (Figura 1C2).
    4. Inserire un pezzo di stoffa a rete o un sottile strato di cotone sull'estremità "fly" del tubo, all'incrocio tra il tubo e la punta. Assicurarsi che una mosca aspirata nel puntale della pipetta rimanga intrappolata nel puntale, davanti alla rete.
    5. Sigillare le giunzioni tra il tubo e i puntali della pipetta utilizzando il parafilm.
  3. Preparazione di provette a corpo singolo e fiale con alloggiamento di gruppo
    1. Preparazione di tubi a corpo singolo
      1. Aggiungere quasi 500 μl di cibo per mosche appena preparato in una provetta per microfuge da 2 mL (Figura 1D). Usa una mini centrifuga per tirare giù il cibo fino alla parte inferiore del tubo.
      2. Impostare il cibo in modo che si solidifichi a temperatura ambiente tenendo il coperchio aperto per una notte. Coprire le provette con un panno sottile per evitare che le mosche vaganti entrino nelle provette.
      3. Forare i coperchi dei tubi di microfuga con aghi per la circolazione dell'aria e chiudere i coperchi dopo che il cibo si è solidificato.
    2. Preparazione di fiale per gruppi di stabulazione
      1. Prendi fiale di mosche normali e riempi almeno una parte delle fiale con cibo appena preparato (Figura 1D).
  4. Preparare le mosche prima dell'esperimento
    1. Mantenere le linee di mosca dei genotipi desiderati in normali bottiglie di vetro/plastica contenenti cibo standard per mosche in un'incubatrice a 25 °C con un ciclo luce/buio di 12 ore.
    2. Raccogliere le mosche appena chiuse (da 0 a 24 ore) del genotipo desiderato e separarle per sesso in anestesia con anidride carbonica utilizzando uno stereomicroscopio.
    3. Inserire metà delle mosche maschi singolarmente in "tubi a alloggiamento singolo". Tenete l'altra metà dei moscerini maschi in un gruppo di 10 con le mosche femmine in regolari "fiale di alloggio di gruppo" creando una condizione sociale. Conservare tutte le provette e i flaconcini a 25 °C per 5 giorni.
      NOTA: Mantenere una temperatura di 24-25 °C e ~50% di umidità nella stanza del comportamento. I ceppi di mosca utilizzati sono stati: w1118 e mosche mutanti trans-eterozigoti FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)57. Le mosche Fmr1 , che sono state tenute in isolamento per 5 giorni, mostrano attacchi di aggressività significativamente diminuiti nei confronti di un altro maschio (Figura 1E).
  5. Esecuzione dell'esperimento del comportamento aggressivo
    1. Esegui l'esperimento di aggressività durante la finestra temporale ZT0-ZT3 poiché le mosche mostrano il picco di attività durante questo momento della giornata.
      NOTA: ZT=Tempo Zeitgeber in un ciclo standard di luce/buio di 12 ore; ZT0= si accende, cioè l'inizio della fase di luce, ZT3= 3 h dopo l'inizio della fase di luce, e così via. ZT12= luci spente.
    2. Trasferire due moscerini maschi dalle camere di stabulazione singole o di gruppo con il metodo dell'aspirazione della bocca all'arena di aggressione attraverso il foro del coperchio; Allontanare immediatamente il foro per assicurarsi che le mosche non possano scappare.
    3. Lascia che le mosche si acclimatino all'interno dell'arena per 1-2 minuti. Avvia un timer per 20 minuti. Registra le mosche per tutti i 20 minuti posizionando una fotocamera o un telefono cellulare esattamente verticalmente sopra l'arena utilizzando un supporto. Assicurati che i tipi di attacchi aggressivi siano visibili nel video.
      NOTA: Garantire una chiara illuminazione dell'arena ed evitare qualsiasi abbagliamento/riflesso dal coperchio che cade direttamente sull'obiettivo della fotocamera.
    4. Ripetere l'esperimento per 15-20 coppie di mosche per ogni genotipo e ogni tipo di condizione abitativa.
      NOTA: Il pregiudizio inconscio può essere annullato con il doppio accecamento delle mosche di controllo e di prova, nonché dei file video appartenenti a più genotipi.
  6. Analisi dei dati del test di aggressione
    1. Trasferisci i file video su un computer con uno schermo sufficientemente grande in modo che gli attacchi aggressivi siano visibili.
    2. Riproduci il video e conta il numero totale di attacchi aggressivi in un arco di tempo di 20 minuti58,59.
    3. Compila e organizza i dati di ogni genotipo e di ogni modello di alloggiamento in un foglio di calcolo ed esegui l'analisi dei dati utilizzando qualsiasi software statistico. Esegui un test t a due code e traccia i dati come scatola e baffi.

2. Saggio dello spazio sociale

NOTA: Il protocollo del saggio, l'arena e l'analisi qui descritti sono stati descritti in precedenza60,61.

  1. Preparazione dell'arena del saggio dello spazio sociale (SSA)
    1. Posizionare entrambi i distanziatori triangolari in acrilico (altezza = 8,9 cm, base = 6,7 cm e spessore = 0,3 cm) in piano sopra una lastra di vetro rettangolare (13,5 cm x 10,4 cm, spessore 0,3 cm) in modo che gli angoli retti dei distanziatori in acrilico siano allineati con gli angoli della lastra di vetro (Figura 2A).
    2. Posizionare due distanziatori rettangolari in acrilico (6,7 cm x 1,5 cm, spessore = 0,3 cm) in piano sulla lastra di vetro, allineati con le basi dei due distanziatori triangolari. Dopo questa disposizione, verificare che i quattro distanziatori acrilici circondano un'arena triangolare (~2,16 cm²61) sulla lastra di vetro rettangolare che non è coperta da distanziatori (Figura 2A,B). Posiziona l'adesivo di un righello (Figura 2C) su uno dei distanziatori triangolari e assicurati che sia visibile dall'alto.
    3. Posizionare ora una seconda lastra di vetro rettangolare (13,5 cm x 10,4 cm, spessore 0,3 cm) sopra i distanziatori acrilici in modo che si allinei con la lastra di vetro nella parte inferiore; I distanziatori acrilici finirebbero inseriti tra lo spazio di vetro, lasciando uno spazio triangolare nel mezzo tra due lastre di vetro. Utilizzare quattro piccole clip per legare per tenere i vetri e i distanziatori.
  2. Preparazione delle mosche per SSA
    1. Raccogliere le mosche appena chiuse (da 0 a 24 ore) del genotipo desiderato e separarle per sesso in anestesia fredda utilizzando uno stereomicroscopio.
      NOTA: Raffreddare l'apparecchio per anestesia fredda (può essere utilizzata una piastra di Petri) in un'incubatrice a -20 °C. Metti le mosche in fiale vuote, immergi queste fiale nel ghiaccio (in un secchiello per il ghiaccio) fino a quando le mosche non diventano immobili, posizionale sulla capsula di Petri fredda e inizia a selezionarle.
    2. Conservare i moscerini maschio e femmina separatamente per 24 ore in fiale di cibo in un'incubatrice a 25 °C con un ciclo luce/buio di 12 ore.
      NOTA: Per gli esperimenti qui dimostrati, i ceppi di mosche utilizzati erano w1118 e mosche mutanti trans-eterozigoti FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
  3. Esecuzione dell'esperimento SSA
    1. Mantenere le stesse condizioni sperimentali del saggio di aggressione (temperatura: 24-25°C, umidità ~ 50%) ed eseguire l'esperimento durante la finestra temporale ZT0-ZT3.
    2. Rimuovere la clip del raccoglitore in basso a destra e spostare leggermente il distanziatore rettangolare verso l'esterno in modo da creare uno spazio (~0,5 cm) tra i due distanziatori rettangolari.
    3. Trasferire le mosche (raccolte il giorno precedente) dalla fiala di cibo in una fiala vuota. Trasferiscili nell'arena dello spazio sociale (l'area triangolare) con un'aspirazione delicata attraverso lo spazio creato tra i distanziatori rettangolari. Chiudere immediatamente lo spazio facendo scorrere il distanziatore rettangolare e la clip del raccoglitore nelle loro posizioni e assicurarsi che non rimanga spazio per la fuga delle mosche.
    4. Tenendo la camera in posizione verticale, battere delicatamente la camera 3 volte su un cuscinetto morbido per assicurarsi che tutte le mosche siano alla base della camera all'inizio dell'esperimento.
    5. Clamp la camera SSA in posizione verticale e avviare il timer. Scatta una foto nitida dell'arena dopo 20 minuti, quando le mosche si posano nelle loro posizioni nell'arena e mostrano un movimento minimo. Evitare l'abbagliamento e l'illuminazione irregolare.
    6. Ripetere l'esperimento 3 volte per la stessa popolazione di mosche martellando le mosche e ripetendo i passaggi dai passaggi 2.3.5 a 2.3.7 (repliche interne). Ripetere 3 volte con una diversa popolazione di mosche dello stesso genotipo/condizione (ripetizioni indipendenti).
      NOTA: Congelare la camera di analisi per scartare le mosche dalla camera. Pulisci le superfici di vetro e plastica con etanolo per rimuovere tutti gli odori dopo che un ciclo di esperimenti è stato fatto con un gruppo di mosche.
  4. Analisi dei dati del saggio dello spazio sociale
    1. Analizzare le immagini nel software ImageJ62 ed elencare le distanze tra le mosche più vicine come descritto in precedenza61.
    2. Esegui analisi statistiche e grafici grafici utilizzando software statistici.
      NOTA: I ceppi di mosca utilizzati per il test SSA qui descritto erano le mosche mutanti trans-eterozigoti w1118 e Fmr1 (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)57. Le mosche Fmr1 mostrano una distanza significativamente maggiore dai vicini più vicini (Figura 2D).

3. Saggio di corteggiamento

  1. La camera del corteggiamento
    1. Assemblare tutti e quattro i pezzi della camera di corteggiamento (Figura 3A) insieme nell'ordine mostrato nella Figura 3B. Ogni perforazione del disco centrale, inserita tra il coperchio e i pezzi di base, funzionerà come "camera di corteggiamento" (Figura 3C).
  2. Ottenere femmine preaccoppiate
    1. Avviare e mantenere più bottiglie di coltura di mosche CS (Canton S, wild type) con ~60-100 mosche maschi e femmine in ogni bottiglia di cibo.
    2. Quando emergono gli adulti, scartare tutte le mosche adulte e trasferire le mosche che emergono da queste bottiglie ogni 2-3 ore in nuove fiale di cibo integrate con una piccola quantità di pasta di lievito.
      NOTA: Evitare il sovraffollamento delle fiale. Fare attenzione a non trasferire vecchie mosche, larve o pupe nella fiala di accoppiamento.
    3. Incubare queste "fiale di accoppiamento" per 4 giorni per assicurarsi che tutte le femmine si siano accoppiate.
  3. Preparazione di tubi a corpo singolo per maschi
    1. Aggiungere quasi 500 μL di cibo per mosche a ciascuna provetta per microfuge da 2 mL. Utilizzare una minicentrifuga per tirare verso il basso il cibo nella parte inferiore del tubo.
    2. Lasciare che il cibo si solidifichi durante la notte, tagliare il coperchio del tubo di microfuge, coprirlo con parafilm e perforare il parafilm con un ago per la circolazione dell'aria.
  4. Raccolta e isolamento dei maschi vergini
    1. Impostare incroci con 10-15 maschi e 20-30 femmine vergini dei genotipi desiderati in fiale di cibo separate.
    2. Raccogliere maschi vergini dei genotipi desiderati dalla progenie e conservarli individualmente in "tubi a corpo singolo" utilizzando l'aspiratore. Continuate a raccogliere i maschi appena chiusi ogni 5-6 ore (fino a 40-50 maschi per ogni genotipo) e isolateli in provette individuali a stabulazione singola.
    3. Richiudere il coperchio del tubo con il parafilm.
  5. Esecuzione dell'esperimento del saggio di corteggiamento
    1. Dopo 5 giorni di isolamento dei maschi del test, eseguire il test di corteggiamento durante la finestra temporale ZT0-ZT3.
    2. Configura i dispositivi di registrazione video con largo anticipo, concentrandoti sull'area di lavoro del saggio.
    3. Con l'aiuto di un aspiratore, raccogli una femmina preaccoppiata (6-10 giorni) dalle fiale di accoppiamento e inseriscila in una camera di corteggiamento.
    4. Utilizzando l'aspiratore, trasferire delicatamente una mosca maschile (controllo/test) dal tubo a alloggiamento singolo alla camera di corteggiamento contenente la singola femmina preaccoppiata attraverso il foro di trasferimento. Ruotare rapidamente il coperchio per chiudere la camera.
    5. Registrare video il comportamento delle mosche per 15 minuti.
  6. Analisi dei dati video e statistiche
    1. Trasferisci i file video su un computer; Nota la durata del tempo trascorso dal maschio in corteggiamento durante 15 minuti esaminando manualmente il video.
    2. Calcola l'indice di corteggiamento (CI) per ogni mosca maschio, che è la frazione (o percentuale) del tempo trascorso dal maschio nel corteggiare la femmina durante 15 minuti.
    3. Conta il numero totale di tentativi di copulazione in 15 minuti.
    4. Si noti la durata del ritardo mostrato dal maschio prima del suo primo tentativo di corteggiamento come latenza di corteggiamento (CL).
      NOTA: Si raccomanda di analizzare 40-60 maschi per condizione/genotipo per ottenere la potenza statistica e determinare la coerenza dei risultati dell'IC.

4. Saggio del comportamento di toelettatura

  1. Arena del saggio del comportamento di toelettatura
    1. Utilizzare una piccola camera circolare con un volume di ~0,4 cm3 come arena per registrare il comportamento di toelettatura.
      NOTA: La stessa arena di corteggiamento descritta nella sezione 3 può essere utilizzata per il test del comportamento di toelettatura.
    2. Poiché il comportamento di toelettatura comporta la registrazione del movimento di organi più fini come le gambe, utilizzare la registrazione video ad alta risoluzione o ad alto contrasto. Per seguire questo protocollo, utilizzare un pannello LED rivestito in vetro diffuso come superficie illuminata in modo uniforme di dimensioni 20 cm x 20 cm. Posiziona la camera di corteggiamento sopra il pannello per garantire che la luce passi dal basso attraverso la camera.
  2. Preparare le mosche prima dell'esperimento
    1. Mantenere il genotipo sperimentale delle mosche in bottiglie per alimenti a 25 °C con un ciclo luce/buio di 12 ore.
    2. Raccogliere le mosche appena chiuse (da 0 a 24 ore) del genotipo desiderato e separarle per sesso in anestesia fredda utilizzando uno stereomicroscopio come descritto nel saggio dello spazio sociale.
    3. Isolare i moscerini maschi in provette a corpo singolo (come quelle utilizzate nel saggio di aggressione) per 24 ore.
      NOTA: Per l'esperimento qui dimostrato, i ceppi di mosche utilizzati sono stati: W1118 e mosche mutanti trans-eterozigoti FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
  3. Esecuzione del test del comportamento di toelettatura
    1. Mantenere una temperatura di 24-25 °C e umidità ~ 50%; eseguire l'esperimento durante la finestra temporale ZT0-ZT316.
    2. Trasferisci una mosca maschio a stabulazione singola da un tubo a stabulazione singola nell'arena di toelettatura utilizzando un aspiratore. Far scorrere immediatamente il foro nel coperchio per assicurarsi che le mosche non possano fuoriuscire.
    3. Posiziona l'arena di toelettatura su un pannello LED diffuso e lascia che la mosca si acclimati all'interno dell'arena per 1 minuto. Registra video la mosca per 10 minuti posizionando la telecamera esattamente verticalmente sopra l'arena montata su un supporto. Assicurati che i tipi di attacchi di toelettatura siano visibili e quantificabili nel video.
      NOTA: Il comportamento di toelettatura include lo sfregamento della testa, degli occhi, delle antenne, della proboscide, del torace, dell'addome, dei genitali e delle ali con le zampe (primo paio: T1, secondo paio: T2 o terzo paio di zampe: T3). I parametri comportamentali di toelettatura che sono stati presi in considerazione in questo studio sono quelli descritti in Andrew et al. 41 e dimostrati nella Figura 4.
    4. Ripeti l'esperimento per ogni genotipo.
    5. Analisi dei dati comportamentali di toelettatura
      1. Analizza i video e calcola i seguenti quattro parametri: Indice di toelettatura (percentuale di tempo trascorso in toelettatura); latenza di toelettatura (tempo fino al primo incontro di toelettatura); numero dell'incontro di toelettatura; e durata media dell'incontro di toelettatura (durata totale dell'incontro/numero di attacchi).
      2. Contrassegna un singolo incontro di toelettatura come terminato quando una mosca smette di mostrare uno qualsiasi dei parametri e rimane immobile per 2 s o interrompe l'incontro e cammina per almeno 4 passi.

5. Dosaggio dell'assuefazione olfattiva

NOTA: Come mostrato nella Figura 5, l'assemblaggio finale deve essere effettuato il giorno del saggio del labirinto a Y54,56.

  1. Preparare le mosche per l'assuefazione
    1. Allevare mosche dei genotipi desiderati per tutti gli esperimenti in un'incubatrice con una temperatura ambiente di 25 oC e 70% di umidità in condizioni standard di 12 ore di luce: 12 ore di ciclo di buio (LD).
    2. Raccogli le mosche vecchie da 0 a 12 ore, appena chiuse e trasferisci ~30-40 mosche in una bottiglia media fresca con un tappo di cotone stretto.
    3. Assegna codici a ogni bottiglia per mantenere lo sperimentatore cieco sui genotipi in fase di sperimentazione.
  2. Induzione dell'assuefazione olfattiva
    1. Mettere 1 mL dell'odorizzante preferito diluito con liquido di paraffina (leggero) in una provetta per microfughe da 1,5 mL. Per il controllo, è sufficiente utilizzare 1 mL di luce liquida di paraffina in una provetta microfuge da 1,5 mL. Agitare il contenuto nel tubo per 10 minuti per garantire una miscelazione uniforme e poi coprirlo con pellicola trasparente uniformemente perforata.
      NOTA: Nel video verrà utilizzato il butirrato di etile al 20%.
    2. Utilizzare il filo per sospendere i tubi contenenti l'odorizzante diluito o solo il liquido diluente in flaconi di terreno separati contenenti mosche.
    3. Coprite bene le bottiglie con del cotone e poi avvolgetele con carta kraft per evitare la diffusione del vapore odorizzante. Etichettare le bottiglie di controllo e quelle contenenti odori come naive e esposte agli odori (abituate), rispettivamente. Conservare questi biberon a induzione per 3 giorni in un'incubatrice con le condizioni sopra menzionate.
  3. Preparazione delle mosche e l'apparato del labirinto a Y
    1. Trasferire le mosche dalle bottiglie di induzione in fiale contenenti solo carta da filtro imbevuta d'acqua.
    2. Lasciarli morire di fame per circa 16-18 ore a temperatura ambiente prima dell'esperimento per aumentare la motivazione.
    3. Assicurarsi che i componenti dell'apparato del labirinto a Y siano puliti e inodori; Assemblare le quattro parti in modo verticale. Fissare le camere di arrampicata al labirinto a Y, che viene poi collegato alla parte superiore dell'adattatore. Fissare saldamente la parte inferiore del labirinto a Y alla fiala d'ingresso che funge da stelo centrale nella parte inferiore, come mostrato nella Figura 5.
    4. Collegare l'estremità conica di ciascuna camera di risalita con i flaconi di reagenti contenenti odorizzante (10-3 diluizioni con acqua distillata) utilizzando tubi di silicone inodori.
    5. Pompare l'odorizzante a una portata uguale (~120 mL/min) dalle bombole del gas ai due bracci della Y con l'aiuto di una pompa a vuoto e lasciarlo saturare per 15 minuti per ottenere consistenza.
  4. Esecuzione del classico saggio del labirinto a Y
    1. Introduci delicatamente le mosche affamate di ogni fiala nella fiala d'ingresso della configurazione del labirinto a Y.
    2. Lasciali acclimatare per un breve periodo; collegare la fiala di ingresso con l'adattatore Y-maze per iniziare il test; e lascia che le mosche si arrampichino sui bracci del labirinto a Y e rimangano intrappolate nelle due camere di raccolta. Impostare la durata di ogni test su 1 minuto.
    3. Al termine, tocca le mosche sul fondo della fiala d'ingresso e cambia la posizione delle braccia del labirinto a Y per evitare la polarizzazione laterale. Effettua quattro letture per la stessa serie di mosche.
    4. Registra il numero di mosche che si arrampicano su ciascuno dei due bracci del labirinto a Y entro il tempo stabilito.
    5. Ripetere il test per almeno 8 lotti per ottenere un set di dati rappresentativo.
  5. Analisi e interpretazione dei dati raccolti
    1. Quantificare i risultati calcolando l'indice di prestazione (PI), che può essere rappresentato come la differenza tra il numero di mosche che scelgono il braccio dell'aria (A) e il numero di mosche che scelgono il braccio dell'odore (O) come frazione del numero totale di mosche partecipanti.
    2. Utilizzare test statistici ( test t di Student non accoppiato) per verificare se il PI delle mosche naïve rispetto a quelle esposte agli odori è significativo.

Risultati

Saggio di aggressione
Come modello ASD a mosca, sono state utilizzate mosche mutanti Fmr1 63,64. w1118 maschi sono stati utilizzati come mosche di controllo e Fmr1 trans-eterozigote Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M57 mosche maschi come mosche sperimentali; I maschi adulti sono stati alloggiati in tubi di isolamento per 5 giorni. I maschi omotipici (stesso genotipo, stesse condizioni di...

Discussione

La Drosophila è utilizzata come organismo modello per la ricerca sui disturbi neurologici umani a causa di un alto grado di conservazione delle sequenze geniche tra la mosca e i geni della malattia umana9. Numerosi e robusti paradigmi comportamentali lo rendono un modello attraente per lo studio dei fenotipi manifestati nei mutanti che ricapitolano le malattie umane. Poiché centinaia di geni sono implicati nel disturbo dello spettro autistico (ASD), non esiste un modello comune di ASD i...

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Riconoscimenti

Siamo immensamente grati a Mani Ramaswami (NCBS, Bangalore) e Baskar Bakthavachalu (IIT Mandi) per la configurazione del saggio di assuefazione e scelta dell'odore, Pavan Agrawal (MAHE) per i suoi preziosi suggerimenti sul test di aggressione, Amitava Majumdar (NCCS, Pune) per aver condiviso il suo prototipo di camera di corteggiamento e le linee di mosca mutanti Fmr1 e Gaurav Das (NCCS, Pune) per aver condiviso la linea MB247-GAL4. Ringraziamo il Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, Indiana, USA), il National Institute of Genetics (NIG, Kyoto, Giappone), la Banaras Hindu University (BHU, Varanasi, India) e il National Center for Biological Science (NCBS, Bangalore, India) per le linee di Drosophila . Il lavoro nel laboratorio è stato sostenuto da sovvenzioni da SERB-DST (ECR/2017/002963) ad AD, borsa di studio DBT Ramalingaswami assegnata ad AD (BT/RLF/Re-entry/11/2016) e supporto istituzionale da IIT Kharagpur, India. SD e SM ricevono borse di dottorato da CSIR-Senior Research Fellowship; PM riceve un dottorato di ricerca da MHRD, India.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Aggression arena:
Standard 24-well plate made of transparent polystyrene12 cm x 8 cm x 2 cm. Diameter of a single well= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; depth = 1 cm
Transparent plastic/acrylic sheetAlternative: a perforated lid of a cell culture plate
Social Space Assay:
Binder clips19 mm
Glass sheets and acrylic sheets of customized sizesThickness = 5 mm
Courtship assay:
Nut and bolt with threading
Perspex sheets of customized shapesi) Lid: A custom-made round transparent Perspex disk (2-3 mm thickness, 70 mm diameter) with one loading hole at the peripheral region and another screw hole at the center (diameter ~ 3 mm for each); ii) A second transparent thicker Perspex disk (3-4 mm thickness, 70 mm diameter), with 6-8 perforations of diameter 15 mm, equidistant from the center; iii) Base: Same as lid except without the loading hole
Grooming assay:
Diffused glass-covered LED panel10–15-Watt ceiling mountable LED panel
Habituation and Y-maze assay
Climbing chambersx2, Borosilicate glass
Adapter for connecting Y-maze with entry vialPerspex, custom made, measurements in Figure 5A
Clear reagent bottlesBorosil #1500017
Gas washing stopperBorosil #1761021
Glass vialOD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Odorant (Ethyl Butyrate)Merck #E15701
Paraffin wax (liquid) lightSRL #18211
Roller clampsPolymed #14098
Silicone tubesOD = 0.6 cm, ID = 0.3 cm; roller clamps for flow control
Vacuum pumpHana #HN-648 (Any aquarium pump with flow direction reversed manually)
Y-mazeBorosilicate glass
Y-shaped glass tube (borosilicate glass)Custom made, measurements in Figure 5A
Common items:
Any software for video playback (eg.- VLC media player)https://www.videolan.org/vlc/
Computer for video data analysis
Fly bottlesOD= 60 mm x Height= 140 mm; glass/polypropylene
Fly vialsOD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Graph-pad Prism softwarehttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ImageJ softwarehttps://imagej.net/downloads
Timer
Video camera with video recording set upCamcorder or a mobile phone camera will work
For Fly Aspirator:
CottonAbsorbent, autoclaved
ParafilmSigma-aldrich #P7793
Pipette tips200 µL or 1000 µL, choose depeding on outer diameter of the silicone tube
Silicone/rubber tubelength= 30-50 cm. The tube should be odorless
Composition of Fly food:
Ingredients (amount for 1 L of food)
Agar (8 g)SRL # 19661 (CAS : 9002-18-0)
Cornflour (80 g)Organic, locally procured
D-Glucose (20 g)SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
Propionic acid (4 g)SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
Sucrose (40 g)SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
Tego (Methyl para hydroxy benzoate) (1.25 g)SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
Yeast Powder (10 g)HIMEDIA # RM027
Fly lines used in the experiments in this study:
Wild type (Canton S or CS)BDSC # 64349
w1118BDSC # 3605
w[1118]; Fmr1[Δ50M]/TM6B, Tb[+]BDSC # 6930
w[*]; Fmr1[Δ113M]/TM6B, Tb[1]BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)BDSC # 50742
LN1-GAL4NP1227, NP consortium, Japan
row-shRNABDSC # 25971

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