Paradigmi per la valutazione comportamentale nel modello di Drosophila del disturbo dello spettro autistico

Riepilogo

Il disturbo dello spettro autistico (ASD) è associato a un comportamento sociale e comunicativo alterato e all'emergere di comportamenti ripetitivi. Per studiare l'interrelazione tra i geni ASD e i deficit comportamentali nel modello di Drosophila , in questo articolo vengono descritti cinque paradigmi comportamentali per valutare il distanziamento sociale, l'aggressività, il corteggiamento, l'adescamento e il comportamento di assuefazione.

Abstract

Il Disturbo dello Spettro Autistico (ASD) comprende un gruppo eterogeneo di disturbi dello sviluppo neurologico con sintomi comportamentali comuni, tra cui deficit nell'interazione sociale e nella capacità di comunicazione, comportamenti limitati o ripetitivi migliorati e, in alcuni casi, difficoltà di apprendimento e deficit motorio. La Drosophila è servita come organismo modello senza pari per la modellazione di un gran numero di malattie umane. Poiché molti geni sono stati implicati nell'ASD, i moscerini della frutta sono emersi come un modo potente ed efficiente per testare i geni presumibilmente coinvolti nel disturbo. Poiché centinaia di geni, con vari ruoli funzionali, sono implicati nell'ASD, un singolo modello genetico di ASD è irrealizzabile; invece, singoli mutanti genetici, knockdown genici o studi basati sulla sovraespressione degli omologhi dei geni associati all'ASD sono i mezzi comuni per ottenere informazioni sui percorsi molecolari alla base di questi prodotti genici. In Drosophila sono disponibili una serie di tecniche comportamentali che forniscono una facile lettura dei deficit in specifiche componenti comportamentali. Il saggio dello spazio sociale e i saggi di aggressività e corteggiamento nelle mosche si sono dimostrati utili nella valutazione dei difetti nell'interazione sociale o nella comunicazione. Il comportamento di toelettatura nelle mosche è un'eccellente lettura del comportamento ripetitivo. Il test di assuefazione viene utilizzato nei moscerini per stimare la capacità di apprendimento dell'assuefazione, che risulta essere influenzata in alcuni pazienti con ASD. Una combinazione di questi paradigmi comportamentali può essere utilizzata per effettuare una valutazione approfondita dello stato di malattia umana simile all'ASD nei moscerini. Utilizzando le mosche mutanti Fmr1 , la ricapitolazione della sindrome dell'X fragile negli esseri umani e il knockdown delle file omologhe POGZ nei neuroni dei moscerini, abbiamo mostrato deficit quantificabili nel distanziamento sociale, nell'aggressività, nel comportamento di corteggiamento, nel comportamento di toelettatura e nell'assuefazione. Questi paradigmi comportamentali sono qui dimostrati nelle loro forme più semplici e dirette con l'ipotesi che ne faciliterebbero l'uso diffuso per la ricerca sull'ASD e altri disturbi dello sviluppo neurologico nei modelli di mosca.

Introduzione

Il Disturbo dello Spettro Autistico (ASD) comprende un gruppo eterogeneo di disturbi neurologici. Comprende una serie di disturbi complessi del neurosviluppo caratterizzati da deficit multicontestuali e persistenti nella comunicazione e nell'interazione sociale e dalla presenza di modelli comportamentali e di attività ristretti e ripetitivi e interessi¹. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), a 1 bambino su 100 viene diagnosticato l'ASD in tutto il mondo con un rapporto maschi/femmine di 4,2². La malattia si manifesta nel secondo o terzo anno di vita. I bambini con ASD mostrano una mancanza di interesse pe....

Protocollo

Consultare la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e i reagenti utilizzati in questo protocollo.

1. Saggio di aggressività

1. Preparazione dell'arena del saggio di aggressione
   1. Prendi una piastra standard a 24 pozzetti (Figura 1A) e usa ogni pozzetto della piastra come un'unica "arena" (Figura 1B) per l'aggressione delle mosche. Riempi metà di ogni pozzetto con normale cibo per mosche e lascialo asciugare per una notte.
      NOTA: Opzionalmente, un punto focale per l'aggressione può essere incluso nell'arena,....

Discussione

La Drosophila è utilizzata come organismo modello per la ricerca sui disturbi neurologici umani a causa di un alto grado di conservazione delle sequenze geniche tra la mosca e i geni della malattia umana⁹. Numerosi e robusti paradigmi comportamentali lo rendono un modello attraente per lo studio dei fenotipi manifestati nei mutanti che ricapitolano le malattie umane. Poiché centinaia di geni sono implicati nel disturbo dello spettro autistico (ASD), non esiste un modello comune di ASD i.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aggression arena:
Standard 24-well plate made of transparent polystyrene			12 cm x 8 cm x 2 cm. Diameter of a single well= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; depth = 1 cm
Transparent plastic/acrylic sheet			Alternative: a perforated lid of a cell culture plate
Social Space Assay:
Binder clips			19 mm
Glass sheets and acrylic sheets of customized sizes			Thickness = 5 mm
Courtship assay:
Nut and bolt with threading
Perspex sheets of customized shapes			i) Lid: A custom-made round transparent Perspex disk (2-3 mm thickness, 70 mm diameter) with one loading hole at the peripheral region and another screw hole at the center (diameter ~ 3 mm for each); ii) A second transparent thicker Perspex disk (3-4 mm thickness, 70 mm diameter), with 6-8 perforations of diameter 15 mm, equidistant from the center; iii) Base: Same as lid except without the loading hole
Grooming assay:
Diffused glass-covered LED panel			10–15-Watt ceiling mountable LED panel
Habituation and Y-maze assay
Climbing chambers			x2, Borosilicate glass
Adapter for connecting Y-maze with entry vial			Perspex, custom made, measurements in Figure 5A
Clear reagent bottles			Borosil #1500017
Gas washing stopper			Borosil #1761021
Glass vial			OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Odorant (Ethyl Butyrate)			Merck #E15701
Paraffin wax (liquid) light			SRL #18211
Roller clamps			Polymed #14098
Silicone tubes			OD = 0.6 cm, ID = 0.3 cm; roller clamps for flow control
Vacuum pump			Hana #HN-648 (Any aquarium pump with flow direction reversed manually)
Y-maze			Borosilicate glass
Y-shaped glass tube (borosilicate glass)			Custom made, measurements in Figure 5A
Common items:
Any software for video playback (eg.- VLC media player)			https://www.videolan.org/vlc/
Computer for video data analysis
Fly bottles			OD= 60 mm x Height= 140 mm; glass/polypropylene
Fly vials			OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Graph-pad Prism software			https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ImageJ software			https://imagej.net/downloads
Timer
Video camera with video recording set up			Camcorder or a mobile phone camera will work
For Fly Aspirator:
Cotton			Absorbent, autoclaved
Parafilm			Sigma-aldrich #P7793
Pipette tips			200 µL or 1000 µL, choose depeding on outer diameter of the silicone tube
Silicone/rubber tube			length= 30-50 cm. The tube should be odorless
Composition of Fly food:
Ingredients (amount for 1 L of food)
Agar (8 g)			SRL # 19661 (CAS : 9002-18-0)
Cornflour (80 g)			Organic, locally procured
D-Glucose (20 g)			SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
Propionic acid (4 g)			SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
Sucrose (40 g)			SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
Tego (Methyl para hydroxy benzoate) (1.25 g)			SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
Yeast Powder (10 g)			HIMEDIA # RM027
Fly lines used in the experiments in this study:
Wild type (Canton S or CS)			BDSC # 64349
w1118			BDSC # 3605
w[1118]; Fmr1[Δ50M]/TM6B, Tb[+]			BDSC # 6930
w[*]; Fmr1[Δ113M]/TM6B, Tb[1]			BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)			BDSC # 50742
LN1-GAL4			NP1227, NP consortium, Japan
row-shRNA			BDSC # 25971