Paradigmen für die Verhaltensbewertung im Drosophila-Modell der Autismus-Spektrum-Störung

Zusammenfassung

Die Autismus-Spektrum-Störung (ASS) ist mit einer Beeinträchtigung des sozialen und kommunikativen Verhaltens und dem Auftreten von sich wiederholendem Verhalten verbunden. Um die Wechselbeziehung zwischen ASD-Genen und Verhaltensdefiziten im Drosophila-Modell zu untersuchen, werden in dieser Arbeit fünf Verhaltensparadigmen zur Untersuchung von sozialem Abstand, Aggression, Balz, Pflege und Gewöhnungsverhalten beschrieben.

Zusammenfassung

Die Autismus-Spektrum-Störung (ASS) umfasst eine heterogene Gruppe von neurologischen Entwicklungsstörungen mit häufigen Verhaltenssymptomen, darunter Defizite in der sozialen Interaktion und Kommunikationsfähigkeit, verstärkte eingeschränkte oder sich wiederholende Verhaltensweisen und in einigen Fällen auch Lernbehinderung und motorisches Defizit. Drosophila diente als beispielloser Modellorganismus für die Modellierung einer großen Anzahl menschlicher Krankheiten. Da viele Gene mit ASS in Verbindung gebracht wurden, haben sich Fruchtfliegen als leistungsstarke und effiziente Methode erwiesen, um die Gene zu testen, die angeblich an der Störung beteiligt sind. Da Hunderte von Genen mit unterschiedlichen funktionellen Rollen an ASD beteiligt sind, ist ein einzelnes genetisches Fliegenmodell von ASD nicht möglich; Stattdessen sind einzelne genetische Mutanten, Gen-Knockdowns oder Überexpressions-basierte Studien der Fliegenhomologe von ASD-assoziierten Genen die üblichen Mittel, um Einblicke in die molekularen Signalwege zu gewinnen, die diesen Genprodukten zugrunde liegen. In Drosophila gibt es eine Vielzahl von Verhaltenstechniken, die ein leichtes Auslesen von Defiziten in bestimmten Verhaltenskomponenten ermöglichen. Es hat sich gezeigt, dass der Assay des Sozialraums sowie Aggressions- und Balztests bei Fliegen nützlich sind, um Defekte in der sozialen Interaktion oder Kommunikation zu beurteilen. Das Fellpflegeverhalten bei Fliegen ist eine hervorragende Lektüre für sich wiederholendes Verhalten. Der Gewöhnungsassay wird bei Fliegen verwendet, um die Fähigkeit zum Gewöhnungslernen abzuschätzen, die bei einigen ASD-Patienten beeinträchtigt ist. Eine Kombination dieser Verhaltensparadigmen kann verwendet werden, um eine gründliche Beurteilung des menschlichen ASD-ähnlichen Krankheitszustands bei Fliegen vorzunehmen. Unter Verwendung von Fmr1-mutierten Fliegen, der Rekapitulation des Fragile-X-Syndroms beim Menschen und des POGZ-homologen Row-Knockdowns in Fliegenneuronen haben wir quantifizierbare Defizite in den Bereichen Social spacing, Aggression, Balzverhalten, Pflegeverhalten und Gewöhnung gezeigt. Diese Verhaltensparadigmen werden hier in ihrer einfachsten und unkompliziertesten Form demonstriert, mit der Annahme, dass dies ihre breite Verwendung für die Forschung zu ASS und anderen neurologischen Entwicklungsstörungen in Fliegenmodellen erleichtern würde.

Einleitung

Die Autismus-Spektrum-Störung (ASS) umfasst eine heterogene Gruppe von neurologischen Störungen. Sie umfasst eine Reihe komplexer neurologischer Entwicklungsstörungen, die durch multikontextuelle und anhaltende Defizite in der sozialen Kommunikation und sozialen Interaktion sowie durch das Vorhandensein von eingeschränkten, sich wiederholenden Verhaltens- und Aktivitätsmustern und -interessen gekennzeichnet^{sind 1}. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) wird weltweit bei 1 von 100 Kindern ASS diagnostiziert, wobei das Verhältnis von Männern zu Frauen bei 4,2^{2 liegt}. Die Erkrankung macht sich im zweiten oder dr....

Protokoll

In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Aggressions-Assay

1. Vorbereitung der Aggressions-Assay-Arena
   1. Nehmen Sie eine Standard-24-Well-Platte (Abbildung 1A) und verwenden Sie jede Vertiefung der Platte als eine einzelne "Arena" (Abbildung 1B) für die Aggression der Fliegen. Füllen Sie die Hälfte jeder Mulde mit normalem Fliegenfutter und lassen Sie es über Nacht trocknen.
      HINWEIS: Optional kann ein Brennpunkt für Aggression in die Arena eingeba....

Diskussion

Drosophila wird aufgrund eines hohen Grades an Konservierung von Gensequenzen zwischen Fliegen- und menschlichen Krankheitsgenen als guter Modellorganismus für die Erforschung humaner neurologischer Erkrankungen verwendet⁹. Zahlreiche robuste Verhaltensparadigmen machen es zu einem attraktiven Modell für die Untersuchung von Phänotypen, die sich in Mutanten manifestieren, die menschliche Krankheiten rekapitulieren. Da Hunderte von Genen an der Autismus-Spektrum-Störung (ASS) beteiligt.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aggression arena:
Standard 24-well plate made of transparent polystyrene			12 cm x 8 cm x 2 cm. Diameter of a single well= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; depth = 1 cm
Transparent plastic/acrylic sheet			Alternative: a perforated lid of a cell culture plate
Social Space Assay:
Binder clips			19 mm
Glass sheets and acrylic sheets of customized sizes			Thickness = 5 mm
Courtship assay:
Nut and bolt with threading
Perspex sheets of customized shapes			i) Lid: A custom-made round transparent Perspex disk (2-3 mm thickness, 70 mm diameter) with one loading hole at the peripheral region and another screw hole at the center (diameter ~ 3 mm for each); ii) A second transparent thicker Perspex disk (3-4 mm thickness, 70 mm diameter), with 6-8 perforations of diameter 15 mm, equidistant from the center; iii) Base: Same as lid except without the loading hole
Grooming assay:
Diffused glass-covered LED panel			10–15-Watt ceiling mountable LED panel
Habituation and Y-maze assay
Climbing chambers			x2, Borosilicate glass
Adapter for connecting Y-maze with entry vial			Perspex, custom made, measurements in Figure 5A
Clear reagent bottles			Borosil #1500017
Gas washing stopper			Borosil #1761021
Glass vial			OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Odorant (Ethyl Butyrate)			Merck #E15701
Paraffin wax (liquid) light			SRL #18211
Roller clamps			Polymed #14098
Silicone tubes			OD = 0.6 cm, ID = 0.3 cm; roller clamps for flow control
Vacuum pump			Hana #HN-648 (Any aquarium pump with flow direction reversed manually)
Y-maze			Borosilicate glass
Y-shaped glass tube (borosilicate glass)			Custom made, measurements in Figure 5A
Common items:
Any software for video playback (eg.- VLC media player)			https://www.videolan.org/vlc/
Computer for video data analysis
Fly bottles			OD= 60 mm x Height= 140 mm; glass/polypropylene
Fly vials			OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Graph-pad Prism software			https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ImageJ software			https://imagej.net/downloads
Timer
Video camera with video recording set up			Camcorder or a mobile phone camera will work
For Fly Aspirator:
Cotton			Absorbent, autoclaved
Parafilm			Sigma-aldrich #P7793
Pipette tips			200 µL or 1000 µL, choose depeding on outer diameter of the silicone tube
Silicone/rubber tube			length= 30-50 cm. The tube should be odorless
Composition of Fly food:
Ingredients (amount for 1 L of food)
Agar (8 g)			SRL # 19661 (CAS : 9002-18-0)
Cornflour (80 g)			Organic, locally procured
D-Glucose (20 g)			SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
Propionic acid (4 g)			SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
Sucrose (40 g)			SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
Tego (Methyl para hydroxy benzoate) (1.25 g)			SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
Yeast Powder (10 g)			HIMEDIA # RM027
Fly lines used in the experiments in this study:
Wild type (Canton S or CS)			BDSC # 64349
w1118			BDSC # 3605
w[1118]; Fmr1[Δ50M]/TM6B, Tb[+]			BDSC # 6930
w[*]; Fmr1[Δ113M]/TM6B, Tb[1]			BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)			BDSC # 50742
LN1-GAL4			NP1227, NP consortium, Japan
row-shRNA			BDSC # 25971