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요약

자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 사회적 및 의사소통 행동의 장애 및 반복적 행동의 출현과 관련이 있습니다. 초파리 모델에서 ASD 유전자와 행동 결핍 사이의 상관 관계를 연구하기 위해 이 논문에서는 사회적 간격, 공격성, 구애, 그루밍 및 습관화 행동을 분석하기 위한 5가지 행동 패러다임을 설명합니다.

초록

자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 사회적 상호 작용 및 의사 소통 능력의 결핍, 제한적이거나 반복적인 행동 증가, 경우에 따라 학습 장애 및 운동 장애를 포함한 일반적인 행동 증상을 가진 이질적인 신경 발달 장애 그룹을 포함합니다. 초파리(Drosophila )는 수많은 인간 질병을 모델링하는 데 있어 타의 추종을 불허하는 모델 유기체 역할을 해왔습니다. 많은 유전자가 ASD와 관련이 있음에 따라, 초파리는 이 장애와 관련이 있는 것으로 추정되는 유전자를 검사할 수 있는 강력하고 효율적인 방법으로 부상했습니다. 다양한 기능적 역할을 가진 수백 개의 유전자가 ASD와 관련되어 있기 때문에 ASD의 단일 유전적 파리 모델은 실현 불가능합니다. 대신, 개별 유전적 돌연변이, 유전자 녹다운 또는 ASD 관련 유전자의 파리 상동체에 대한 과발현 기반 연구는 이러한 유전자 산물의 기저에 있는 분자 경로에 대한 통찰력을 얻기 위한 일반적인 수단입니다. Drosophila 에서는 특정 행동 구성 요소의 결함을 쉽게 읽을 수 있는 다양한 행동 기술을 사용할 수 있습니다. 파리의 사회적 공간 분석과 공격성 및 구애 분석은 사회적 상호 작용 또는 의사 소통의 결함을 평가하는 데 유용한 것으로 나타났습니다. 파리의 그루밍 행동은 반복적인 행동을 잘 읽을 수 있습니다. 습관화 분석은 파리에서 습관화 학습 능력을 추정하는 데 사용되며, 이는 일부 ASD 환자에서 영향을 받는 것으로 밝혀졌습니다. 이러한 행동 패러다임의 조합은 파리의 인간 ASD와 유사한 질병 상태를 철저히 평가하는 데 활용될 수 있습니다. Fmr1 돌연변이 파리를 사용하여 인간의 Fragile-X 증후군을 요약하고 파리 뉴런의 POGZ-homolog row knockdown을 사용하여 사회적 간격, 공격성, 구애 행동, 그루밍 행동 및 습관화에서 정량화 가능한 결함을 보여주었습니다. 이러한 행동 패러다임은 파리 모델에서 ASD 및 기타 신경 발달 장애에 대한 연구에 널리 사용될 수 있다는 가정과 함께 가장 간단하고 직접적인 형태로 입증되었습니다.

서문

자폐 스펙트럼 장애(Autism Spectrum Disorder, ASD)는 이질적인 신경 장애 그룹을 포함합니다. 여기에는 사회적 의사소통 및 사회적 상호 작용의 다맥락적이고 지속적인 결핍과 제한적이고 반복적인 행동 및 활동 패턴과 관심의 존재를 특징으로 하는 다양한 복잡한 신경 발달 장애가 포함됩니다1. 세계보건기구(WHO)에 따르면 전 세계적으로 아동 100명 중 1명이 ASD 진단을 받고 있으며, 남성과 여성의 비율은 4.2입니다2. 이 병은 생후 2년이나 3년째에 뚜렷하게 나타난다. ASD 아동은 사회-정서적 호혜성, 비언어적 의사소통 및 관계 기술에 대한 관심이 부족합니다. 그들은 정형화된 운동 운동, 융통성 없고 의례적인 일상 추종, 제한된 관심사에 대한 강렬한 집중과 같은 반복적인 행동을 보입니다. ASD 아동은 촉각, 후각, 소리, 미각에 대한 반응이 높은 반면, 통증과 온도 반응은 상대적으로 낮습니다1. 이 장애의 침투율은 ASD를 앓고 있는 환자마다 다르기 때문에 변동성이 증가합니다.

현재 ASD의 임상적 진단은 모든 형태의 ASD를 포괄하는 확증적인 바이오마커 기반 또는 일반적인 유전자 검사가 없기 때문에 개인의 행동 평가를 기반으로 합니다3. 유전적 및 신경생리학적 기반을 해독하는 것은 치료 전략을 표적으로 삼는 데 도움이 될 것입니다. 지난 10년 동안 대규모 연구를 통해 ASD 환자에서 삭제되거나 돌연변이가 발생하거나 발현 수준이 변경된 수백 개의 유전자를 확인할 수 있었습니다. 현재 진행 중인 연구는 생쥐나 초파리와 같은 모델 유기체를 사용하여 이러한 후보 유전자의 기여도를 검증하는 데 중점을 두고 있으며, 이러한 유전자를 녹아웃하거나 녹다운시킨 후 ASD와 같은 행동 결함을 검사하고 이상을 유발하는 기저 유전 및 분자 경로를 규명합니다. 인간 염색체 유전자좌 16p11.2에서 복제 수 변이(CNV)를 요약한 마우스 모델은 ASD 행동 결함 중 일부를 보여줍니다 4,5,6. 기형 유발 약물인 발프로산(VPA)에 대한 태아 노출은 인간 ASD 7,8과 유사한 특성을 나타내는 또 다른 마우스 모델입니다. 또한, 유전적 증후군 관련 자폐증을 나타내는 다양한 마우스 모델이 존재하는데, 예를 들어, Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c의 돌연변이에 의한 단일 유전자 증후군 모델과 Cntnap2, Shank, Neurexin 또는 Neuroligin 유전자와 같은 유전자의 돌연변이에 의한 단일 유전자 비증후군 모델5.

초파리(Drosophila melanogaster)는 ASD를 포함한 다양한 인간 질환9의 세포, 분자 및 유전적 기반을 연구하기 위한 또 다른 저명한 모델 유기체이다. 초파리와 인간은 분자, 세포 및 시냅스 수준에서 고도로 보존된 생물학적 과정을 공유합니다. 초파리는 ASD 연구에서 성공적으로 사용되어 왔다10,11,12 ASD와 연결된 유전자를 특성화하고 시냅스 형성, 시냅스 기능 및 가소성, 신경 회로 조립 및 성숙에서 그들의 정확한 역할을 해독하기 위해; ASD 관련 유전자의 파리 상동체는 사회적 및/또는 반복적 행동의 조절에 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. 초파리는 또한 ASD 유전자 및 그 변이체 15,22,23의 스크리닝을 위한 모델로 작용했습니다. 파리에 대한 ASD 연구의 가장 큰 과제는 다른 질병 모델과 달리 단일 ASD 파리 모델이 없다는 것입니다. 돌연변이 또는 특정 ASD 유전자의 파괴의 영향을 이해하기 위해 연구자는 행동 표현형이 ASD 환자의 증상을 충분히 모방하는지 검증한 다음 표현형의 분자 또는 생리학적 토대를 이해해야 합니다.

따라서 ASD와 유사한 표현형을 검출하는 것은 플라이 모델에서 ASD 연구에 매우 중요합니다. 사회적 행동/상호 작용, 의사 소통, 반복적 행동 및 자극에 대한 반응의 결함과 같은 이상을 감지할 수 있는 몇 가지 행동 기술이 수년에 걸쳐 등장했습니다. 또한 이러한 행동 기법의 여러 수정 및 업그레이드는 업스케일링, 분석 자동화, 판독, 정량화 및 비교 방법과 같은 특정 요구 사항에 맞게 여러 실험실에서 이루어졌습니다. 이 비디오 기사에서는 5가지 행동 패러다임의 가장 기본적인 버전을 보여주며, 이를 조합하여 가장 쉬운 방법으로 ASD와 유사한 행동 결과를 감지하는 데 사용할 수 있습니다.

공격성은 생존과 번식에 영향을 미치는 진화적으로 보존된 타고난 행동이다24. 동족에 대한 공격적 행동은 '사회화 동기'25,26 및 '의사소통'27에 의해 영향을 받으며, 둘 다 ASD의 영향을 받은 개인에서 손상됩니다. 공격적인 행동은 초파리(Drosophila)에 잘 설명되어 있으며, 강력한 공격성 분석법(aggressive assay)28,29,30을 통한 정량화(quantifiability)와 잘 이해된 유전적 및 신경생물학적 기반(neurobiological basis)31은 파리 모델에서 ASD 표현형을 평가하기 위한 적합한 행동 패러다임(behavioral paradigm)32을 만든다. 공격성은 사회적 환경으로부터 멀리 떨어진 사회적 고립에 의해 영향을 받으며, 이는 공격성을 강화합니다. 수컷 파리가 며칠 동안 고립되어 있을 때도 동일한 현상이 관찰되었다33,34. 파리의 사교성을 정량화하는 또 다른 행동 분석법은 소셜 스페이스 어세이 (Social Space Assay) (35)로, 이는 작은 파리 그룹에서 가장 가까운 이웃과 파리 사이의 거리를 측정하여 파리 12,21,36,37 및 환경적으로 유도 된 ASD 파리 모델(38)에서 ASD 유전자 ortholog의 역할을 테스트하는 데 완벽하게 적합합니다. 39.

Drosophila courtship assay는 자폐증 관련 유전자 18,19,21,40을 포함하여 회로 또는 유전자 조작에 따른 사회적 및 의사 소통 기술의 변화를 분석하는 데 자주 사용되는 또 다른 행동 패러다임입니다. ASD 환자에서는 반복적인 행동 패턴이 널리 나타나며, 이는 청소 및 기타 목적을 위해 수행되는 일련의 뚜렷하고 정형화된 행동인 그루밍 행동에 의해 파리에서 재현됩니다. 그것은 파리21,41에서 ASD 유전자 돌연변이의 영향과 화학 물질 38,39에 대한 노출을 분석하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 분석의 여러 발전 및 자동화는 16,41,42,43 이전에 설명되었습니다. 여기에서는 채택하고 정량화하기 쉬운 가장 기본적인 분석 패턴을 시연합니다.

ASD는 일부 환자44,45,46,47,48,49,50, ASD 모델 유기체(51,52)에서 습관화, 학습 및 기억 능력에 영향을 미치며 다양한 후각 행동(50)에서 결함을 유발하는 것으로 알려져 있다. 초파리(Drosophila)의 빛-떨어짐 점프 습관화(Drosophila light-off jump habituation)는 이전에 ASD 유전자를 선별하기 위해 사용되었다23. 습관화는 후각 습관화 분석법(53,54,55)의 간단한 방법으로 분석할 수 있다. ASD 유전자 돌연변이 또는 유전자 녹다운 조건에서 습관화의 결함을 감지하는 데 사용할 수 있는 고전적인 Y-maze-based binary odor-choice assay56을 사용하여 후각 습관화를 유도하고 결과를 분석하는 방법을 설명합니다. 돌연변이(또는 유전자 녹다운) 또는 약리학적 치료가 파리의 행동에 미치는 영향이 ASD와 유사한 표현형에 해당하는지 평가하기 위해 여기에 설명된 이 5가지 분석을 조합하여 사용할 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜에 사용된 모든 재료 및 시약과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 공격성 분석

  1. 침략 분석 분야 준비
    1. 표준 24웰 플레이트(그림 1A)를 사용하여 플레이트의 각 웰을 플라이 공격을 위한 단일 '아레나'(그림 1B)로 사용합니다. 각 우물의 절반을 일반 플라이 푸드로 채우고 밤새 말리십시오.
      참고: 선택적으로, 남성의 공격성을 보장하기 위해 효모 페이스트 점 또는 목이 잘린 여성과 같이 공격성의 초점이 경기장에 포함될 수 있습니다.
    2. 약 3-4개의 웰 표면을 덮을 수 있을 만큼 투명한 플라스틱/아크릴 시트를 사용하십시오. 시트에 구멍을 뚫어 개별 파리를 웰에 삽입하기 위해 직경 ~ 2.5mm 의 작은 구멍을 만듭니다.
  2. 플라이 흡입기 준비
    1. 30-50cm 길이의 고무/실리콘 튜브를 사용합니다(그림 1C1).
    2. 200 μL(또는 1,000 μL) 피펫 팁을 사용하여 좁은 팁에서 ~1cm를 잘라냅니다. 고무 튜브의 한쪽 끝에 절단 끝을 삽입하십시오. 이 팁은 구강 기반 흡인에 사용되는 '입 끝'이 될 것입니다.
    3. 다른 피펫 팁을 가져다가 이 팁의 좁은 끝을 잘라 파리가 들어갈 수 있는 충분한 구멍을 만듭니다. 이 피펫 팁의 베이스를 튜브의 꼬리 끝에 삽입합니다. 이것은 플라이가 흡입되는 흡인기의 '플라이 끝'이 될 것입니다(그림 1C2).
    4. 튜브와 팁 사이의 접합부에서 튜브의 '플라이 끝'에 메쉬 천 조각이나 얇은 면화 층을 삽입합니다. 피펫 팁으로 흡인된 플라이가 메쉬 앞의 팁에 갇혀 있는지 확인합니다.
    5. 파라필름을 사용하여 파이프와 피펫 팁 사이의 접합부를 밀봉합니다.
  3. single-housing tube 및 group-housing 바이알 준비
    1. 단일 하우징 튜브의 준비
      1. 거의 500μL의 갓 준비된 플라이 푸드를 2mL 미세분리 튜브에 추가합니다(그림 1D). 미니 원심분리기를 사용하여 식품을 튜브의 바닥 부분으로 아래로 당깁니다.
      2. 밤새 뚜껑을 열어 두어 식품을 실온에서 굳히도록 설정하세요. 길 잃은 파리가 튜브에 들어가는 것을 방지하기 위해 고운 천 조각으로 튜브를 덮으십시오.
      3. 공기 순환을 위해 미세분리 튜브의 뚜껑을 바늘로 구멍을 뚫고 식품이 응고된 후 뚜껑을 닫습니다.
    2. 그룹 하우징 바이알 준비
      1. 일반 플라이 바이알을 사용하여 신선하게 준비된 음식으로 최소한의 바이알을 채웁니다(그림 1D).
  4. 실험 전에 파리를 준비합니다.
    1. 12시간 밝은/어두운 주기로 25°C의 인큐베이터에서 표준 플라이 푸드가 들어 있는 일반 유리/플라스틱 병에 원하는 유전자형의 플라이 라인을 유지합니다.
    2. 원하는 유전자형의 새로 폐쇄 된 (0-24 시간) 파리를 수집하고 실체 현미경을 사용하여 이산화탄소 마취하에 성별 분리합니다.
    3. 수컷 파리의 절반을 '단일 하우징 튜브'에 개별적으로 삽입합니다. 수컷 파리의 나머지 절반은 10 마리 그룹으로 유지하고 암컷 파리는 일반 '그룹 하우징 바이알'에 넣어 사회적 조건을 만듭니다. 모든 튜브와 바이알을 25°C에서 5일 동안 보관합니다.
      알림: 행동실에서 24-25°C의 온도와 ~50%의 습도를 유지하십시오. 사용된 파리 균주는 w1118 및 FMR 트랜스-이형접합 돌연변이 파리(Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)57이었다. 5일 동안 격리된 Fmr1 파리는 다른 수컷에 대한 공격성이 현저히 감소한 것으로 나타났습니다(그림 1E).
  5. 공격성 행동 실험 수행
    1. 파리가 하루 중 이 시간 동안 최대 활동을 보이므로 ZT0-ZT3 시간 창 동안 공격성 실험을 수행합니다.
      참고: ZT=Zeitgeber 표준 12시간 라이트/다크 사이클의 시간; ZT0= 점등, 즉 광상 시작, ZT3= 광상 시작 후 3시간 등입니다. ZT12= 꺼집니다.
    2. 입 흡인 방법에 의해 단일 또는 집단 수용 방에서 두 마리의 수컷 파리를 뚜껑의 구멍을 통해 공격 영역으로 이동시킵니다. 파리가 도망칠 수 없도록 구멍을 즉시 치우십시오.
    3. 파리가 1-2분 동안 경기장 내에서 적응하도록 합니다. 20분 동안 타이머를 시작합니다. 비디오는 스탠드를 사용하여 카메라나 휴대폰을 경기장 위에 정확히 수직으로 배치하여 전체 20분 동안 파리를 녹화합니다. 공격적인 시합 유형이 비디오에서 보이는지 확인하십시오.
      알림: 경기장의 밝은 조명을 보장하고 카메라 렌즈에 직접 떨어지는 뚜껑의 눈부심/반사를 피하십시오.
    4. 각 유전자형과 모든 유형의 주거 조건에 대해 15-20쌍의 파리에 대해 실험을 반복합니다.
      참고: 무의식적 편향은 대조군 및 테스트 파리와 여러 유전자형에 속하는 비디오 파일의 이중 맹검을 통해 무효화할 수 있습니다.
  6. 침략 분석 데이터 분석
    1. 공격적인 시합이 보일 수 있도록 충분히 큰 화면이 있는 컴퓨터로 비디오 파일을 전송하십시오.
    2. 비디오를 재생하고 20분58,59의 시간 범위 동안 공격적인 시합의 총 수를 계산합니다.
    3. 스프레드시트에서 각 유전자형과 각 하우징 패턴의 데이터를 컴파일 및 구성하고 통계 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다. 양측 t-검정을 수행하고 데이터를 상자 수염과 수염으로 플로팅합니다.

2. 사회 공간 분석

참고: 여기에 설명된 분석 프로토콜, 영역 및 분석은 이전에60,61에서 설명되었습니다.

  1. SSA(Social Space Assay) 분야 준비
    1. 삼각형 아크릴 스페이서(높이 = 8.9cm, 밑면 = 6.7cm, 두께 = 0.3cm)를 직사각형 유리판(13.5cm x 10.4cm, 두께 0.3cm) 위에 평평하게 놓고 아크릴 스페이서의 직각이 유리판의 모서리와 정렬되도록 합니다(그림 2A).
    2. 두 개의 직사각형 아크릴 스페이서(6.7cm x 1.5cm, 두께 = 0.3cm)를 두 개의 삼각형 스페이서의 바닥과 정렬하여 유리판에 평평하게 놓습니다. 이 배열 후, 4 개의 아크릴 스페이서가 스페이서로 덮이지 않은 직사각형 유리판의 삼각형 경기장 (~ 2.16 sq. cm61)을 둘러싸고 있는지 확인하십시오 (그림 2A, B). 삼각형 스페이서 중 하나에 눈금자(그림 2C) 스티커를 붙이고 위에서 볼 수 있는지 확인합니다.
    3. 이제 두 번째 직사각형 유리판(13.5cm x 10.4cm, 두께 0.3cm)을 아크릴 스페이서 위에 놓고 바닥의 유리판과 정렬되도록 합니다. 아크릴 스페이서는 유리 공간 사이에 끼워져 두 개의 유리판 사이 중간에 삼각형 공간을 남깁니다. 4개의 작은 바인더 클립을 사용하여 창과 스페이서를 고정합니다.
  2. SSA를 위한 파리의 준비
    1. 원하는 유전자형의 새로 폐쇄 된 (0-24 시간) 파리를 수집하고 실체 현미경을 사용하여 냉간 마취하에 성별 분리합니다.
      알림: -20 °C 인큐베이터에서 차가운 마취 장치(페트리 접시를 사용할 수 있음)를 식힙니다. 파리를 빈 유리병에 넣고 파리가 움직일 수 없게 될 때까지 이 유리병을 얼음(얼음 양동이에 담근)에 담근 다음 차가운 페트리 접시에 놓고 분류를 시작합니다.
    2. 수컷과 암컷 파리를 24시간 동안 식품 바이알에 따로 보관하고 12시간 밝은/어두운 주기로 25°C 인큐베이터에 보관합니다.
      참고: 여기에서 시연된 실험을 위해 사용된 파리 균주는 w1118 및 FMR 트랜스-이형접합 돌연변이 파리(Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)였습니다.
  3. SSA 실험 수행
    1. 침략 분석과 동일한 실험 조건(온도: 24-25°C, 습도 ~ 50%)을 유지하고 ZT0-ZT3 시간 창 동안 실험을 수행합니다.
    2. 오른쪽 하단 바인더 클립을 제거하고 두 개의 직사각형 스페이서 사이에 간격(~0.5cm)이 생성되도록 직사각형 스페이서를 바깥쪽으로 약간 이동합니다.
    3. 식품 바이알에서 빈 바이알로 파리(전날 수집)를 옮깁니다. 직사각형 스페이서 사이에 만들어진 공간을 통해 부드러운 열망으로 사회적 공간 영역(삼각형 영역)으로 이동합니다. 직사각형 스페이서와 바인더 클립을 제자리로 밀어 즉시 공간을 닫고 파리가 탈출할 공간이 남아 있지 않은지 확인하십시오.
    4. 챔버를 수직 위치로 잡고 챔버를 부드러운 패드에 3번 부드럽게 두드려 실험 시작 시 모든 파리가 챔버 바닥에 있는지 확인합니다.
    5. Clamp SSA 챔버를 수직 위치에 놓고 타이머를 시작합니다. 파리가 경기장의 위치에 정착하고 최소한의 움직임을 보일 때 20분 후에 경기장의 선명한 사진을 찍습니다. 눈부심과 불규칙한 조명을 피하십시오.
    6. 파리를 두드리고 2.3.5단계부터 2.3.7단계(내부 반복실험)까지의 단계를 반복하여 동일한 파리 집단에 대해 실험을 3번 반복합니다. 동일한 유전자형/조건의 다른 파리 집단으로 3회 반복합니다(독립 반복).
      알림: 분석 챔버를 얼려 챔버에서 파리를 버립니다. 한 그룹의 파리로 한 번의 실험을 수행한 후 유리와 플라스틱 표면을 에탄올로 닦아 모든 냄새를 제거합니다.
  4. 소셜 공간 분석 데이터 분석
    1. ImageJ62 소프트웨어에서 이미지를 분석하고 앞서 설명한 대로 플라이 간 최근접 이웃 거리를 나열합니다(61).
    2. 통계 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하고 그래프를 플로팅합니다.
      참고: 여기에 기술된 SSA 분석에 사용된 파리 균주는 w1118 및 Fmr1 트랜스-이형접합 돌연변이 파리(Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)57이었다. Fmr1 파리는 가장 가까운 이웃으로부터 상당히 증가한 거리를 보여줍니다(그림 2D).

3. 구애 분석

  1. 구혼의 방
    1. 구혼실(그림 3A)의 4개 부품을 그림 3B에 표시된 순서대로 함께 조립합니다. 뚜껑과 베이스 피스 사이에 끼워진 중앙 디스크의 각 구멍은 '구혼실'로 작동합니다(그림 3C).
  2. 미리 교미된 암컷 얻기
    1. 각 식품 병에 ~ 60-100 마리의 수컷과 암컷 파리가 있는 CS(Canton S, 야생형) 파리의 여러 배양 병을 시작하고 유지 관리하십시오.
    2. 성충이 나오면 모든 성충 파리를 버리고 이 병에서 나오는 파리를 2-3시간마다 소량의 효모 페이스트가 첨가된 새 식품 바이알로 옮깁니다.
      알림: 바이알이 과도하게 붐비지 않도록 하십시오. 늙은 파리, 유충 또는 번데기를 짝짓기 바이알로 옮기지 않도록 주의하십시오.
    3. 이 "짝짓기 바이알"을 4일 동안 배양하여 모든 암컷이 짝짓기를 했는지 확인합니다.
  3. 남성을위한 단일 하우징 튜브 준비
    1. 각 2mL 마이크로퓨지 튜브에 거의 500μL의 플라이 푸드를 추가합니다. 미니 원심 분리기를 사용하여 식품을 튜브의 바닥 부분으로 끌어 내립니다.
    2. 음식물을 밤새 응고시키고 미세 분리 튜브의 뚜껑을 자르고 파라 필름으로 덮고 공기 순환을 위해 바늘로 파라 필름을 천공하십시오.
  4. 처녀 남성의 수집과 격리
    1. 원하는 유전자형을 가진 10-15명의 남성과 20-30명의 처녀 암컷과 함께 별도의 식품 바이알에 교배를 설정합니다.
    2. 자손에서 원하는 유전자형의 처녀 남성을 수집하고 흡인기기를 사용하여 '단일 하우징 튜브'에 개별적으로 보관합니다. 5-6시간마다 새로 폐쇄된 수컷을 계속 수집하고(각 유전자형당 최대 40-50명의 수컷) 개별 단일 하우징 튜브에 격리합니다.
    3. 파라필름으로 튜브의 뚜껑을 다시 밀봉합니다.
  5. 구애 분석 실험 수행
    1. 테스트 남성을 5일 동안 격리한 후 ZT0-ZT3 시간 창 동안 구애 분석을 수행합니다.
    2. 분석 작업 공간에 초점을 맞춰 비디오 녹화 장치를 미리 설정합니다.
    3. 흡인기의 도움을 받아 짝짓기 바이알에서 교미된 암컷(생후 6-10일) 한 마리를 모아 구혼실에 삽입합니다.
    4. 흡인기(aspirator)를 사용하여 단일 하우징 튜브에서 수컷(대조군/테스트) 파리를 이식 구멍을 통해 단일 교미된 암컷이 포함된 구애 챔버로 부드럽게 옮깁니다. 뚜껑을 빠르게 돌려 챔버를 닫습니다.
    5. 15분 동안 파리의 행동을 비디오로 녹화합니다.
  6. 비디오 데이터 분석 및 통계
    1. 비디오 파일을 컴퓨터로 전송하십시오. 15분 동안 남성이 구애에 소요한 시간을 수동으로 비디오를 살펴보면서 기록하십시오.
    2. 각 수컷 파리에 대한 구애 지수(CI)를 계산하는데, 이는 15분 동안 수컷이 암컷에게 구애하는 데 소비한 시간의 비율(또는 백분율)입니다.
    3. 15분 동안 총 교미 시도 횟수를 계산합니다.
    4. 남성이 첫 번째 구애 시도 전에 보여주는 시간 지연을 구애 잠복기(CL)로 주목하십시오.
      참고: 통계적 검정력을 달성하고 CI 결과의 일관성을 결정하기 위해 조건/유전자형당 40-60명의 남성을 분석하는 것이 권장됩니다.

4. 그루밍 행동 분석

  1. 그루밍 행동 분석 분야
    1. ~0.4cm3 부피의 작은 원형 챔버를 그루밍 행동을 기록하기 위한 장소로 사용하십시오.
      참고: 섹션 3에 설명된 것과 동일한 구애 영역이 그루밍 행동 분석에 사용될 수 있습니다.
    2. 그루밍 행동에는 다리와 같은 미세한 장기의 움직임을 기록하는 것이 포함되므로 고해상도 또는 고대비 비디오 녹화를 사용하십시오. 이 프로토콜을 따르려면 확산 유리로 덮인 LED 패널을 20cm x 20cm 크기의 균일하게 조명된 표면으로 사용하십시오. 구애 챔버를 패널 위에 배치하여 빛이 바닥에서 챔버를 통과하도록 합니다.
  2. 실험 전에 파리를 준비합니다.
    1. 12시간의 밝음/어두운 주기로 25°C에서 식품 병의 실험용 유전자형 파리를 유지합니다.
    2. 원하는 유전자형의 새로 폐쇄 된 (0-24 시간) 파리를 수집하고 사회적 공간 분석에 설명 된대로 실체 현미경을 사용하여 냉간 마취하에 성별 분리합니다.
    3. 수컷 파리를 단일 하우징 튜브(침략 분석에 사용됨)에 24시간 동안 격리합니다.
      참고: 여기에서 시연된 실험을 위해 사용된 파리 균주는 W1118 및 FMR 트랜스 이형접합 돌연변이 파리(Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)입니다.
  3. 그루밍 거동 분석 수행
    1. 24-25 °C의 온도와 습도 ~ 50 %를 유지하십시오. ZT0-ZT3 시간 창16 동안 실험을 수행합니다.
    2. 흡인기기를 사용하여 단일 주택 튜브에서 단일 주택 수컷 파리를 그루밍 경기장으로 옮깁니다. 파리가 도망갈 수 없도록 뚜껑의 구멍을 즉시 밀어냅니다.
    3. 그루밍 아레나를 확산된 LED 패널에 놓고 파리가 1분 동안 아레나 내에 적응하도록 합니다. 스탠드에 장착된 경기장 위에 카메라를 정확히 수직으로 배치하여 10분 동안 비행을 비디오로 녹화합니다. 그루밍 시합 유형이 비디오에서 볼 수 있고 정량화할 수 있는지 확인하십시오.
      참고: 그루밍 행동에는 머리, 눈, 더듬이, 흉부, 복부, 생식기, 다리로 날개를 문지르는 것이 포함됩니다(첫 번째 쌍: T1, 두 번째 쌍: T2 또는 세 번째 다리 쌍: T3). 이 연구에서 고려된 그루밍 행동 매개변수는 Andrew et al. 41 에 설명되어 있고 그림 4에 설명되어 있습니다.
    4. 각 유전자형에 대해 실험을 반복합니다.
    5. 그루밍 행동 데이터 분석
      1. 비디오를 분석하고 다음 네 가지 매개 변수를 계산하십시오 : 그루밍 지수 (그루밍에 소요 된 시간의 백분율); 그루밍 대기 시간 (첫 번째 그루밍 시합까지의 시간); 그루밍 시합 번호; 및 평균 그루밍 시합 기간 (총 시합 시간/시합 수).
      2. 파리가 매개 변수 중 하나를 표시하지 않고 2초 동안 움직이지 않거나 시합을 중단하고 최소 4걸음을 걸을 때 단일 그루밍 시합을 완료된 것으로 표시합니다.

5. 후각 습관화를 위한 분석

참고: 그림 5에서 볼 수 있듯이 최종 조립은 Y-maze 분석54,56 당일에 수행해야 합니다.

  1. 파리의 습성 준비
    1. 주변 온도가 25 oC이고 습도가 70%인 인큐베이터에서 표준 12시간 빛(12시간 h 어두운 주기(LD) 12시간 어두운 주기)로 모든 실험에 대해 원하는 유전자형의 파리를 키웁니다.
    2. 0-12 시간 된 새로 폐쇄 된 파리를 수집하고 조여진 면화 마개가있는 신선한 중간 병에 30-40 마리의 파리를 옮깁니다.
    3. 실험자가 실험 중인 유전자형에 대해 눈멀 수 있도록 각 병에 코드를 할당합니다.
  2. 후각 습관화의 유도
    1. 파라핀 액체(빛)로 희석된 선호하는 냄새 유발제 1mL를 1.5mL 미세분리 튜브에 넣습니다. 대조군의 경우 1.5mL 미세분리 튜브에 1mL의 파라핀 액체 광을 사용하십시오. 균일한 혼합을 보장하기 위해 튜브의 내용물을 10분 동안 소용돌이치게 한 다음 균일하게 구멍이 뚫린 플라스틱 랩으로 덮습니다.
      참고: 비디오에서는 20% 에틸 부티레이트가 사용됩니다.
    2. 와이어를 사용하여 희석된 냄새 유발제가 들어 있는 튜브를 매달거나 희석액만 파리가 들어 있는 별도의 미디어 병에 매달아 놓습니다.
    3. 병을 면으로 잘 덮은 다음 크래프트 종이로 싸서 냄새 나는 증기의 확산을 방지하십시오. 대조군과 냄새가 함유된 병을 각각 나이브(naive)와 냄새 노출(습관화)로 표시합니다. 이 인덕션 병을 위에서 언급한 조건의 인큐베이터에서 3일 동안 유지하십시오.
  3. 파리와 Y-미로 장치의 준비
    1. 인덕션 병의 파리를 물에 적신 여과지만 들어 있는 바이알로 옮깁니다.
    2. 동기 부여를 높이기 위해 실험 전에 실온에서 약 16-18시간 동안 굶깁니다.
    3. Y-maze 장치의 구성 요소가 깨끗하고 냄새가 없는지 확인하십시오. 네 개의 부품을 수직으로 조립합니다. 등반 챔버를 Y-미로에 부착한 다음 어댑터 상단에 연결합니다. Y-maze의 하단을 그림 5와 같이 하단의 중앙 줄기 역할을 하는 입구 바이알에 단단히 부착합니다.
    4. 냄새가 나지 않는 실리콘 튜브를 사용하여 각 클라이밍 챔버의 테이퍼링 끝을 냄새 유발제(증류수로 10-3 희석)가 들어 있는 시약 병과 연결합니다.
    5. 진공 펌프를 사용하여 가스 실린더에서 Y의 두 암까지 동일한 유속(~120mL/분)으로 냄새 유발제를 펌핑하고 일관성을 위해 15분 동안 포화되도록 합니다.
  4. 고전적인 Y-미로 분석 수행
    1. 각 바이알의 굶주린 파리를 Y-미로 설정의 입구 바이알에 부드럽게 넣습니다.
    2. 잠깐 동안 적응할 수 있도록 하십시오. 엔트리 바이알을 Y-메이즈 어댑터와 연결하여 테스트를 시작합니다. 파리가 Y-미로 팔을 타고 올라가 두 개의 수집실에 갇히게 하십시오. 각 테스트의 시간을 1분으로 설정합니다.
    3. 완료하면 파리를 입구 바이알 하단으로 다시 탭하고 측면 편향을 피하기 위해 Y-미로의 팔 위치를 전환합니다. 같은 파리 세트에 대해 4 회 판독하십시오.
    4. 시간 내에 Y-미로의 두 팔을 각각 오르는 파리의 수를 기록합니다.
    5. 대표 데이터 세트를 얻기 위해 최소 8개의 배치에 대해 분석을 반복합니다.
  5. 수집된 데이터의 분석 및 해석
    1. 성능 지수(PI)를 계산하여 결과를 정량화하며, 이는 에어 암(A)을 선택하는 파리 수와 냄새 암(O)을 선택하는 파리 수의 차이를 총 참가자 파리 수의 일부로 나타낼 수 있습니다.
    2. 통계적 검정(짝을 이루지 않은 학생 t-검정)을 사용하여 순진한 파리와 냄새에 노출된 파리의 PI가 유의한지 확인합니다.

결과

공격성 분석
파리 ASD 모델로, Fmr1 돌연변이 파리는63,64 번 사용되었습니다. w1118 수컷을 대조군으로 사용하고 Fmr1 트랜스 이형 접합체 Fmr1Δ113M / Fmr1Δ50M57 수컷 파리를 실험 파리로 사용했습니다. 성인 남성은 5일 동안 격리 튜브에 수용되었습니다. 동형형 수컷(동일한 유전자형, 동일한 ?...

토론

초파리(Drosophila )는 파리와 인간 질병 유전자 사이의 유전자 염기서열 보존이 높기 때문에 인간 신경 질환 연구를 위한 훌륭한 모델 유기체로 사용된다9. 수많은 강력한 행동 패러다임은 인간의 질병을 요약하는 돌연변이에서 나타나는 표현형을 연구하기 위한 매력적인 모델입니다. 수백 개의 유전자가 자폐 스펙트럼 장애(ASD)와 관련이 있기 때문에 어떤 모델 유기체에도 ...

공개

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

습관화 및 냄새 선택 분석 설정을 해준 Mani Ramaswami(NCBS, 방갈로르)와 Baskar Bakthavachalu(IIT Mandi), 공격성 분석에 대한 귀중한 제안을 해준 Pavan Agrawal(MAHE), 구애 분석 챔버 프로토타입 및 Fmr1 돌연변이 플라이 라인을 공유해 준 Amitava Majumdar(NCCS, Pune), MB247-GAL4 라인을 공유해 준 Gaurav Das(NCCS, 푸네)에게 깊은 감사를 드립니다. Bloomington Drosophila Stock Center(BDSC, 인디애나, 미국), National Institute of Genetics(NIG, 교토, 일본), Banaras Hindu University(BHU, 바라나시, 인도) 및 National Center for Biological Science(NCBS, 방갈로르, 인도)에 초파리 계통에 감사드립니다. 실험실에서의 연구는 SERB-DST (ECR/2017/002963)에서 AD에 수여한 보조금, AD에 수여된 DBT Ramalingaswami 펠로우십(BT/RLF/재진입/2016년 11월) 및 인도 IIT Kharagpur의 기관 지원으로 지원되었습니다. SD와 SM은 CSIR-Senior Research Fellowship에서 박사 학위를 받습니다. PM은 인도 MHRD에서 박사 학위 펠로우십을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Aggression arena:
Standard 24-well plate made of transparent polystyrene12 cm x 8 cm x 2 cm. Diameter of a single well= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; depth = 1 cm
Transparent plastic/acrylic sheetAlternative: a perforated lid of a cell culture plate
Social Space Assay:
Binder clips19 mm
Glass sheets and acrylic sheets of customized sizesThickness = 5 mm
Courtship assay:
Nut and bolt with threading
Perspex sheets of customized shapesi) Lid: A custom-made round transparent Perspex disk (2-3 mm thickness, 70 mm diameter) with one loading hole at the peripheral region and another screw hole at the center (diameter ~ 3 mm for each); ii) A second transparent thicker Perspex disk (3-4 mm thickness, 70 mm diameter), with 6-8 perforations of diameter 15 mm, equidistant from the center; iii) Base: Same as lid except without the loading hole
Grooming assay:
Diffused glass-covered LED panel10–15-Watt ceiling mountable LED panel
Habituation and Y-maze assay
Climbing chambersx2, Borosilicate glass
Adapter for connecting Y-maze with entry vialPerspex, custom made, measurements in Figure 5A
Clear reagent bottlesBorosil #1500017
Gas washing stopperBorosil #1761021
Glass vialOD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Odorant (Ethyl Butyrate)Merck #E15701
Paraffin wax (liquid) lightSRL #18211
Roller clampsPolymed #14098
Silicone tubesOD = 0.6 cm, ID = 0.3 cm; roller clamps for flow control
Vacuum pumpHana #HN-648 (Any aquarium pump with flow direction reversed manually)
Y-mazeBorosilicate glass
Y-shaped glass tube (borosilicate glass)Custom made, measurements in Figure 5A
Common items:
Any software for video playback (eg.- VLC media player)https://www.videolan.org/vlc/
Computer for video data analysis
Fly bottlesOD= 60 mm x Height= 140 mm; glass/polypropylene
Fly vialsOD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Graph-pad Prism softwarehttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ImageJ softwarehttps://imagej.net/downloads
Timer
Video camera with video recording set upCamcorder or a mobile phone camera will work
For Fly Aspirator:
CottonAbsorbent, autoclaved
ParafilmSigma-aldrich #P7793
Pipette tips200 µL or 1000 µL, choose depeding on outer diameter of the silicone tube
Silicone/rubber tubelength= 30-50 cm. The tube should be odorless
Composition of Fly food:
Ingredients (amount for 1 L of food)
Agar (8 g)SRL # 19661 (CAS : 9002-18-0)
Cornflour (80 g)Organic, locally procured
D-Glucose (20 g)SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
Propionic acid (4 g)SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
Sucrose (40 g)SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
Tego (Methyl para hydroxy benzoate) (1.25 g)SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
Yeast Powder (10 g)HIMEDIA # RM027
Fly lines used in the experiments in this study:
Wild type (Canton S or CS)BDSC # 64349
w1118BDSC # 3605
w[1118]; Fmr1[Δ50M]/TM6B, Tb[+]BDSC # 6930
w[*]; Fmr1[Δ113M]/TM6B, Tb[1]BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)BDSC # 50742
LN1-GAL4NP1227, NP consortium, Japan
row-shRNABDSC # 25971

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