자폐 스펙트럼 장애의 초파리 모델에서 행동 평가를 위한 패러다임

요약

자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 사회적 및 의사소통 행동의 장애 및 반복적 행동의 출현과 관련이 있습니다. 초파리 모델에서 ASD 유전자와 행동 결핍 사이의 상관 관계를 연구하기 위해 이 논문에서는 사회적 간격, 공격성, 구애, 그루밍 및 습관화 행동을 분석하기 위한 5가지 행동 패러다임을 설명합니다.

초록

자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 사회적 상호 작용 및 의사 소통 능력의 결핍, 제한적이거나 반복적인 행동 증가, 경우에 따라 학습 장애 및 운동 장애를 포함한 일반적인 행동 증상을 가진 이질적인 신경 발달 장애 그룹을 포함합니다. 초파리(Drosophila )는 수많은 인간 질병을 모델링하는 데 있어 타의 추종을 불허하는 모델 유기체 역할을 해왔습니다. 많은 유전자가 ASD와 관련이 있음에 따라, 초파리는 이 장애와 관련이 있는 것으로 추정되는 유전자를 검사할 수 있는 강력하고 효율적인 방법으로 부상했습니다. 다양한 기능적 역할을 가진 수백 개의 유전자가 ASD와 관련되어 있기 때문에 ASD의 단일 유전적 파리 모델은 실현 불가능합니다. 대신, 개별 유전적 돌연변이, 유전자 녹다운 또는 ASD 관련 유전자의 파리 상동체에 대한 과발현 기반 연구는 이러한 유전자 산물의 기저에 있는 분자 경로에 대한 통찰력을 얻기 위한 일반적인 수단입니다. Drosophila 에서는 특정 행동 구성 요소의 결함을 쉽게 읽을 수 있는 다양한 행동 기술을 사용할 수 있습니다. 파리의 사회적 공간 분석과 공격성 및 구애 분석은 사회적 상호 작용 또는 의사 소통의 결함을 평가하는 데 유용한 것으로 나타났습니다. 파리의 그루밍 행동은 반복적인 행동을 잘 읽을 수 있습니다. 습관화 분석은 파리에서 습관화 학습 능력을 추정하는 데 사용되며, 이는 일부 ASD 환자에서 영향을 받는 것으로 밝혀졌습니다. 이러한 행동 패러다임의 조합은 파리의 인간 ASD와 유사한 질병 상태를 철저히 평가하는 데 활용될 수 있습니다. Fmr1 돌연변이 파리를 사용하여 인간의 Fragile-X 증후군을 요약하고 파리 뉴런의 POGZ-homolog row knockdown을 사용하여 사회적 간격, 공격성, 구애 행동, 그루밍 행동 및 습관화에서 정량화 가능한 결함을 보여주었습니다. 이러한 행동 패러다임은 파리 모델에서 ASD 및 기타 신경 발달 장애에 대한 연구에 널리 사용될 수 있다는 가정과 함께 가장 간단하고 직접적인 형태로 입증되었습니다.

서문

자폐 스펙트럼 장애(Autism Spectrum Disorder, ASD)는 이질적인 신경 장애 그룹을 포함합니다. 여기에는 사회적 의사소통 및 사회적 상호 작용의 다맥락적이고 지속적인 결핍과 제한적이고 반복적인 행동 및 활동 패턴과 관심의 존재를 특징으로 하는 다양한 복잡한 신경 발달 장애가 포함됩니다¹. 세계보건기구(WHO)에 따르면 전 세계적으로 아동 100명 중 1명이 ASD 진단을 받고 있으며, 남성과 여성의 비율은 4.2입니다². 이 병은 생후 2년이나 3년째에 뚜렷하게 나타난다. ASD 아동은 사회-정서적 호혜성, 비언어적 의사소통 및 관계 기술에 대한 관심이 부족합니다. 그들은 정형화된 운동 운동, 융통성 없고 의례적인 일상 추종, 제한된 관심사에 대한 강렬한 집중과 같은 반복적인 행동을 보입니다. ASD 아동은 촉각, 후각, 소리, 미각에 대한 반응이 높은 반면, 통증과 온도 반응은 상대적으로 낮습니다¹. 이 장애의 침투율은 ASD를 앓고 있는 환자마다 다르기 때문에 변동성이 증가합니다.

현재 ASD의 임상적 진단은 모든 형태의 ASD를 포괄하는 확증적인 바이오마커 기반 또는 일반적인 유전자 검사가 ....

프로토콜

이 프로토콜에 사용된 모든 재료 및 시약과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 공격성 분석

1. 침략 분석 분야 준비
   1. 표준 24웰 플레이트(그림 1A)를 사용하여 플레이트의 각 웰을 플라이 공격을 위한 단일 '아레나'(그림 1B)로 사용합니다. 각 우물의 절반을 일반 플라이 푸드로 채우고 밤새 말리십시오.
      참고: 선택적으로, 남성의 공격성을 보장하기 위해 효모 페이스트 점 또는 목이 잘린 여성과 같이 공격성의 초점이 경기장에 포함될 수 있습니다.
   2. 약 3-4개의 웰 표면을 덮을 수 있을 만큼 투명한 플라스틱/아크릴 시트를 사용하십시오. 시트에 구멍을 뚫어 개별 파리를 웰에 삽입하기 위해 직경 ~ 2.5mm 의 작은 구멍을 만듭니다.
2. 플라이 흡입기 준비
   1. 30-50cm 길이의 고무/실리콘 튜브를 사용합니다(그림 1C1).
   2. 200 μL(또는 1,000 μL) 피펫 팁을 사용하여 좁은 팁에서 ~1c....

토론

초파리(Drosophila )는 파리와 인간 질병 유전자 사이의 유전자 염기서열 보존이 높기 때문에 인간 신경 질환 연구를 위한 훌륭한 모델 유기체로 사용된다⁹. 수많은 강력한 행동 패러다임은 인간의 질병을 요약하는 돌연변이에서 나타나는 표현형을 연구하기 위한 매력적인 모델입니다. 수백 개의 유전자가 자폐 스펙트럼 장애(ASD)와 관련이 있기 때문에 어떤 모델 유기체에도 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aggression arena:
Standard 24-well plate made of transparent polystyrene			12 cm x 8 cm x 2 cm. Diameter of a single well= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; depth = 1 cm
Transparent plastic/acrylic sheet			Alternative: a perforated lid of a cell culture plate
Social Space Assay:
Binder clips			19 mm
Glass sheets and acrylic sheets of customized sizes			Thickness = 5 mm
Courtship assay:
Nut and bolt with threading
Perspex sheets of customized shapes			i) Lid: A custom-made round transparent Perspex disk (2-3 mm thickness, 70 mm diameter) with one loading hole at the peripheral region and another screw hole at the center (diameter ~ 3 mm for each); ii) A second transparent thicker Perspex disk (3-4 mm thickness, 70 mm diameter), with 6-8 perforations of diameter 15 mm, equidistant from the center; iii) Base: Same as lid except without the loading hole
Grooming assay:
Diffused glass-covered LED panel			10–15-Watt ceiling mountable LED panel
Habituation and Y-maze assay
Climbing chambers			x2, Borosilicate glass
Adapter for connecting Y-maze with entry vial			Perspex, custom made, measurements in Figure 5A
Clear reagent bottles			Borosil #1500017
Gas washing stopper			Borosil #1761021
Glass vial			OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Odorant (Ethyl Butyrate)			Merck #E15701
Paraffin wax (liquid) light			SRL #18211
Roller clamps			Polymed #14098
Silicone tubes			OD = 0.6 cm, ID = 0.3 cm; roller clamps for flow control
Vacuum pump			Hana #HN-648 (Any aquarium pump with flow direction reversed manually)
Y-maze			Borosilicate glass
Y-shaped glass tube (borosilicate glass)			Custom made, measurements in Figure 5A
Common items:
Any software for video playback (eg.- VLC media player)			https://www.videolan.org/vlc/
Computer for video data analysis
Fly bottles			OD= 60 mm x Height= 140 mm; glass/polypropylene
Fly vials			OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Graph-pad Prism software			https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ImageJ software			https://imagej.net/downloads
Timer
Video camera with video recording set up			Camcorder or a mobile phone camera will work
For Fly Aspirator:
Cotton			Absorbent, autoclaved
Parafilm			Sigma-aldrich #P7793
Pipette tips			200 µL or 1000 µL, choose depeding on outer diameter of the silicone tube
Silicone/rubber tube			length= 30-50 cm. The tube should be odorless
Composition of Fly food:
Ingredients (amount for 1 L of food)
Agar (8 g)			SRL # 19661 (CAS : 9002-18-0)
Cornflour (80 g)			Organic, locally procured
D-Glucose (20 g)			SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
Propionic acid (4 g)			SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
Sucrose (40 g)			SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
Tego (Methyl para hydroxy benzoate) (1.25 g)			SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
Yeast Powder (10 g)			HIMEDIA # RM027
Fly lines used in the experiments in this study:
Wild type (Canton S or CS)			BDSC # 64349
w1118			BDSC # 3605
w[1118]; Fmr1[Δ50M]/TM6B, Tb[+]			BDSC # 6930
w[*]; Fmr1[Δ113M]/TM6B, Tb[1]			BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)			BDSC # 50742
LN1-GAL4			NP1227, NP consortium, Japan
row-shRNA			BDSC # 25971