הדגמה של שינוע קרום היסטידין באמצעות שקי מעיים הפוכים: כלי פדגוגי חווייתי לסטודנטים לתואר ראשון

Summary

כאן, אנו מדווחים על שיטה זולה וניתנת לשחזור המדגימה את הובלת הממברנה של היסטידין במעי עיזים. תהליך זה מתרחש על ידי הובלה משותפת של יוני היסטידין ונתרן המתאפשרת על ידי שיפוע הנתרן על פני קרום האנטרוציטים. שיטה זו מנצלת פדגוגיה של למידה חווייתית כדי להבין טוב יותר את תנועת המומסים על פני קרומים ביולוגיים.

Abstract

היסטידין היא חומצת אמינו חיונית שהיא גם קודמן למטבוליטים המעורבים במערכת החיסון, אוורור ריאות ומחזור הדם. ספיגת היסטידין תזונתי מסתמכת במידה רבה על הובלת חומצות אמינו נייטרליות מצומדות נתרן על ידי טרנספורטר חומצות אמינו נייטרלי רחב (B⁰AT) הקיים על הממברנה האפיקלית של האנטרוציטים. כאן, אנו מדגימים את ספיגת היסטידין על ידי enterocytes villus המעי מן לומן באמצעות שקי עז jejunal הפוך. שקי הג'ג'ונל שנחשפו לריכוזים משתנים של נתרן והיסטדין נבדקו כדי לקבוע את ריכוז ההיסטידין בתוך השקים כפונקציה של זמן. התוצאות מראות ספיגה פעילה של היסטידין. העלאת ריכוז המלח הביאה לספיגה גבוהה יותר של היסטידין, מה שמרמז על סימפורט של ספיגת נתרן והיסטדין בשקי מעיים הפוכים של עיזים. פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם כדי לדמיין את ניידות המעי של חומצות אמינו או מטבוליטים אחרים עם שינויים מתאימים. אנו מציעים ניסוי זה ככלי פדגוגי חווייתי שיכול לסייע לסטודנטים לתואר ראשון להבין את הרעיון של העברת ממברנה.

Introduction

תאים ביולוגיים מוקפים בשכבה דו-שכבתית של שומנים בקרום המפרידה בין הציטוזול התוך-תאי לבין התוכן החוץ-תאי. הממברנה משמשת כמחסום חדיר למחצה המווסת את תנועת המומסים¹. הובלה על פני ממברנות ביולוגיות מושפעת ממקדם החדירות של המומס, התלוי במספר גורמים, כולל ריכוז ומטען המומס. באופן כללי, מומסים נעים דרך הממברנה באמצעות שלושה מנגנונים (איור 1): דיפוזיה פסיבית, דיפוזיה מקלה והובלה אקטיבית². דיפוזיה פשוטה היא התהליך שבו מומסים מסיסים, לא טעונים ולא קוטביים מעבירים את שיפוע הריכוז שלהם דרך קרום חדיר למחצה (איור 1A). חלבוני ממברנה אינם מסייעים בתהליך זה מכיוון שהוא כרוך בתנועה של מומסים מאזור של ריכוז גבוה יותר לאזור של ריכוז נמוך יותר. קצב הדיפוזיה מבוסס על חוק פיק³. מצד שני, דיפוזיה מקלה היא העברה תלוית חלבון, שבה הממברנה מאפשרת רק למומסים סלקטיביים לעבור לאורך שיפוע ריכוז ללא הוצאת אנרגיה (איור 1B). סוג זה של תחבורה הוא ספציפי ושונה מדיפוזיה פשוטה בהצגת קינטיקה רוויה.

העברה פעילה היא העברה תלוית חלבון של מולקולות כנגד שיפוע הריכוז שלהן, כלומר מאזור של ריכוז נמוך יותר לאזור של ריכוז גבוה יותר באמצעות שימוש בשיפועי ATP או יונים (איור 1C). כאשר הטרנספורטר מבצע הידרוליזה של ATP, ההובלה נקראת העברה פעילה ראשונית (איור 1C; פאנל שמאלי). צורה נוספת של תחבורה פעילה היא העברה פעילה משנית (איור 1C; פאנל ימני). בהובלה פעילה משנית, מומסים מועברים על בסיס שיפוע אלקטרוכימי. היא מתרחשת כאשר חלבון טרנספורטר מקשר את תנועתו של יון (בדרך כלל Na⁺) במורד שיפוע הריכוז שלו עם תנועה של מולקולה אחרת או יון כנגד שיפוע הריכוז שלו. סוג זה של תנועת מומסים יכול להיות הובלה משותפת (Symport) שבה גם המומס וגם היון נעים באותו כיוון או חילופי דברים (Antiport), ובמקרה זה המומס והיון נעים בכיוונים מנוגדים.

חומצות האמינו התזונתיות והחד-סוכרים ממקורות המזון נספגים במעי הדק. ניתן לחלק את המעי הדק באופן פונקציונלי לשלושה מקטעים: תריסריון, ג'ג'ונום ואילאום (איור 2). ספיגת המומס מתרחשת בכל המעי הדק, כאשר ספיגה מקסימלית מתרחשת בג'ג'ונום ובקצה הפרוקסימלי של האילאום. האנטרוציטים של המעי הם תאים מקוטבים, והצמתים הצפופים המחברים בין שני תאים סמוכים יוצרים שני אתרי ממברנה נפרדים – אתר הבזולטרלי ואתר הממברנה האפיקלית (איור 2). ספיגת מומסים לומינליים הנוצרים על ידי העיכול מתרחשת באתר הממברנה האפיקלית⁴.

הובלת היסטידין באנטרוציטים של המעי בקרום האפי היא דוגמה לסיפורט פעיל משני שהוא תלוי נתרן. בקצה הבזולטרלי, ההיסטידין הנכנס לאנטרוציטים נע במורד שיפוע הריכוז לתוך מחזור הדם של שער הכבד. הריכוזים התוך-תאיים של נתרן בתוך האנטרוציטים נשמרים על 12 mmoles/L¹, שהם נמוכים יותר מהריכוזים החוץ-תאיים/לומינליים, עקב שאיבה פעילה של נתרן מחוץ לתא על-ידי Na⁺ K⁺ATPase הממוקם על הממברנה הבזולטרלית (איור 3). בקרום האפי של אנטרוציטים, B⁰AT וטרנספורטר חומצות אמינו נייטרליות נתרן (SNAT) 5 הם המובילים העיקריים שלא רק מובילים היסטידין אלא גם חומצות אמינו כגון אספרגין וגלוטמין בהובלה משותפת תלוית נתרן ^5,6. חלבון תעבורה נוסף הנקרא Large Amino acid Transporter (LAT)1 הנמצא בקרום הבזולטרלי של אנטרוציטים מעביר חומצות אמינו ניטרליות גדולות כגון לאוצין, טריפטופן, טירוזין ופנילאלנין על פני הממברנה⁷.

במטרה ללמד את הרעיון של הובלת ממברנות בשילוב עם טכניקות כגון ספקטרופוטומטריה ומבחני ביוכימיה שגרתיים באמצעות פדגוגיה של למידה חווייתית, חובה לפתח מתודולוגיות שיכולות לא רק להדגים את הרעיון במונחים קלים להבנה, אלא גם לאפשר למידה השתתפותית לסטודנטים לתואר ראשון. נכון לעכשיו, ישנם משאבים מוגבלים הזמינים לתלמידים למעורבות מעשית ללמוד מושגים כאלה של ביוכימיה. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול פשוט להדגמת הובלת היסטידין על פני קרום מעי עיזים שקל לשכפל במעבדות לתואר ראשון וניתן להתאים אותו גם להערכת הובלה של מטבוליטים אחרים. חשוב מכך, השיטה משתמשת בחומרים זולים במעבדה לתואר ראשון, ובכך מאפשרת למידה חווייתית גם בסביבה המעבדתית הפשוטה ביותר.

Protocol

הפרוטוקול כולו עם כל השלבים מתואר כדיאגרמה סכמטית באיור 4. השיטה מותאמת ממחקר קודם שבוצע בקרב מעי חולדות⁸. הניסוי בוצע בהתאם להנחיות המוסדיות. הדגימות ששימשו במחקר זה נרכשו מספק מסחרי.

אזהרה: יש ללבוש כפפות במהלך ניסוי זה.

1. הכנת שקי ג'ג'ונום הפוכים

1. טפלו מראש ונקו ג'ג'ונום עזים.
   1. רכשו את עקבותיה של עז בריאה שזה עתה הוקרבה מספק מורשה.
   2. הניחו את השבילים בכמות מספקת של מלח חיץ פוספט 1x (PBS) כך שהם יהיו שקועים לחלוטין לצורך ניקוי.
   3. יש להפריד בין המעי הדק למעי הגס, ולוודא שרקמת החיבור החיצונית מוסרת באמצעות מספריים.
   4. שטפו בעדינות את המעי הדק עם 1x PBS באמצעות מזרק 10 מ"ל, הבטחת הסרת חומר מזון מעוכל כדי לקבל שקית חלולה של המעי הדק. חזור על תהליך זה לפחות שלוש פעמים לניקוי יעיל.
      הערה: הימנע משימוש בכוח או מחטים מוגזמים בזמן השטיפה. השימוש בכוח עלול לגרום לניקוב דפנות המעי ובכך לפגוע באנטרוציטים של המעי.
   5. מדדו את אורכו המלא של המעי הדק באמצעות סרגל כדי לקבל את שלושת החלקים: תריסריון (1/4^מהמעי הדק) והשאר מתפצלים באופן שווה לג'ג'ונום ואילאום.
   6. המשך עם הניסוי באמצעות החלק Jejunum.
2. הכינו ג'ג'ונום הפוך.
   1. נקו את החלק הג'ג'ונום על ידי הסרת כל רקמת החיבור באמצעות להב.
   2. חותכים את הג'ג'ונום למנות באורך 12-15 ס"מ, שוטפים עם PBS 1x ומניחים בכלי פטרי המכיל PBS.
   3. הפכו את חלקי הג'ג'ונום בעזרת מוט זכוכית כדי לאפשר לחלק הווילי להיחשף מבחוץ.
      אזהרה: הימנעו משימוש במוט זכוכית עם קצוות חדים. יתר על כן, קוטר מוט הזכוכית לא צריך להיות גדול מקוטר השק.
      הערה: בשלב זה אפשר לדמיין את הווילי תחת מיקרוסקופ אור (איור 4).
   4. שטפו בעדינות את מנות הג'ג'ונום ההפוכות עם 1x PBS.
   5. בדוק אם יש נזילות מצידי הג'ג'ונום ההפוך.
   6. חותכים את חלקי הג'ג'ונום ההפוכים לשקיות באורך 5 ס"מ.
   7. קשרו קצה אחד בחוט ובדקו שוב אם יש דליפות חזותיות בקצה הקשור על ידי מילוי השקים ב-PBS.
   8. קשרו את הקצה השני ליצירת שק הפוך ריק עם וילי על המשטח החיצוני.
   9. בדוק שוב אם יש דליפות חיצוניות על ידי טפיחה על השק ההפוך על נייר סינון.
3. אזנו את השקים ההפוכים ב-1x PBS.
   1. המשך עם הניסוי באותו יום או לאחסן את השקים לילה ב 1x PBS ב 4 ° C.

2. מערך ניסיוני להובלת היסטידין

1. הרכיבו שתי קבוצות של שלוש צינוריות של 50 מ"ל לפי ריכוזים שונים של נתרן כלורי כמפורט בטבלה 1.
2. טבלו את שקי המעי המוכנים בצינורות שצוינו למשך 30 דקות ו -60 דקות עבור כל אחת מהסטים.
3. לאחר הזמן המיועד, רוקן את התמיסה בתוך השק בצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד של 1.5 מ"ל וקבע את הנפח.
4. שואפים את הנוזל בתוך השק באמצעות מזרק 2 מ"ל. לחלופין, התירו קצה אחד של השק ואספו את התכולה בצינור טרי של 1.5 מ"ל.
5. בדוק 0.1 מ"ל של הדגימות שנאספו להערכת היסטידין וחשב את הריכוז באמצעות הגרף הסטנדרטי.

3. הערכת היסטידין באמצעות תגובתו של פאולי

1. הכינו עקומה סטנדרטית להיסטידין.
   1. הכינו תמיסות עם ריכוזים משתנים של היסטידין כפי שמצוין בטבלה 2 באמצעות תמיסות מלאי של היסטידין (5 מילימול) ומים.
   2. הוסף חומצה סולפנילית (0.5 מ"ל) ונתרן חנקתי (0.5 מ"ל) לכל צינור.
   3. לדגור על הצינורות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל כל אחד של נתרן פחמתי אתנול לכל צינור.
   4. דגרו על הצינורות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (~ 20 מעלות צלזיוס) ושימו לב לספיגה באורך גל 490 ננומטר.
   5. התווה עקומה סטנדרטית של ספיגה לעומת ריכוז היסטידין.
      הערה: בדיקה זו להיסטידין מבוססת על התכונה של היסטידין ליצירת תרכובת דיאזו (איור 5).

תוצאות

תהליך העבודה הניסיוני להדגמת ניידות מעיים של היסטידין באמצעות ספיגה של היסטידין על-ידי וילי מעיים לתוך לומן של השקים ההפוכים מודגם באיור 4, טבלה 1 וטבלה 2. בוצעו שלושה מערכי ניסוי בלתי תלויים, ונתונים מייצגים מוצגים באיור 6

Discussion

הובלת ממברנות היא אחד המושגים הבסיסיים ביותר הנלמדים לסטודנטים לתואר ראשון מכל תחומי מדעי הביולוגיה העיקריים, בסיסיים או יישומיים. באופן מסורתי, תנועה על פני ממברנות הודגמה באמצעות מטבוליטים המסומנים באיזוטופים רדיואקטיביים. עם זאת, שיטות אלה מסוכנות ביותר ואינן ישימ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	TARSONS	500020
10 mL Test Tubes	BOROSIL	9800U04
50 mL Sterile Falcon Tubes	TARSONS	546041
500 mL Beaker	BOROSIL	10044977
500 mL Conical Flask	BOROSIL	691467
D-Glucose	SRL	42738
Digital Spectrophotometer	SYSTRONICS	2710
Ethanol	EMSURE	1009831000
Finpipettes	THERMOFISHER	4642090
Glass Stirrer Rod	BOROSIL	9850107
L-Histidine	SRL	17849
NaCl	SRL	41721
Nitrile Gloves	KIMTECH	112-4847
Petri Dish	TARSONS	460090
Phosphate Buffered Saline (ph 7.4)	SRL	95131
Pipette Tips	ABDOS	P10102
Sodium Carbonate	SRL	89382
Sodium Nitrate	SRL	44618
Sodium Phosphate Dibasic (anhydrous)	SRL	53046
Sodium Phosphate Monobasic (anhydrous)	SRL	22249
Sulphanilic Acid	SRL	15354