Keçi Bağırsağı Ters Çevrilmiş Kesecikler Kullanılarak Histidinin Membran Taşınımının Gösterilmesi: Lisans Öğrencileri İçin Deneyimsel Bir Pedagojik Araç

Özet

Burada, bir keçi bağırsağında histidinin membran taşınmasını gösteren ucuz ve tekrarlanabilir bir yöntem sunulmaktadır. Bu işlem, enterosit zarı boyunca sodyum gradyanı tarafından sağlanan histidin ve sodyum iyonlarının birlikte taşınmasıyla gerçekleşir. Bu yöntem, biyolojik zarlar boyunca çözünen madde hareketini daha iyi anlamak için deneyimsel öğrenme pedagojisinden yararlanır.

Özet

Histidin, aynı zamanda bağışıklık sistemi, pulmoner ventilasyon ve vasküler dolaşımda rol oynayan metabolitlerin öncüsü olan esansiyel bir amino asittir. Diyetteki histidinin emilimi, büyük ölçüde, enterositin apikal zarında bulunan Geniş nötr amino asit taşıyıcısı^(B0AT) tarafından sodyuma bağlı nötr amino asit taşınmasına dayanır. Burada, histidinin bağırsak villus enterositleri tarafından lümenden emilimini keçi jejunal inverted keseleri kullanarak gösteriyoruz. Değişen konsantrasyonlarda sodyum ve histidine maruz kalan jejunal keseler, zamanın bir fonksiyonu olarak keselerin içindeki histidin konsantrasyonunu belirlemek için test edildi. Sonuçlar aktif histidin emilimini göstermektedir. Tuz konsantrasyonunun arttırılması, histidinin daha yüksek emilimine neden oldu, bu da keçi bağırsağı ters çevrilmiş keselerinde sodyum ve histidin emiliminin bir sempatik olduğunu düşündürdü. Bu protokol, amino asitlerin veya diğer metabolitlerin bağırsak hareketliliğini uygun modifikasyonlarla görselleştirmek için uygulanabilir. Bu deneyi, lisans öğrencilerinin membran taşınımı kavramını anlamalarına yardımcı olabilecek deneyimsel bir pedagojik araç olarak öneriyoruz.

Giriş

Biyolojik hücreler, hücre içi sitosollü hücre dışı içerikten ayıran bir zar lipid çift tabakası ile çevrilidir. Membran, çözünen maddelerin¹ hareketini düzenleyen yarı geçirgen bir bariyer görevi görür. Biyolojik zarlar boyunca taşıma, bir çözünen maddenin konsantrasyonu ve yükü dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlı olan bir çözünen maddenin geçirgenlik katsayısından etkilenir. Genel olarak, çözünen maddeler üç mekanizma kullanarak zar boyunca hareket eder (Şekil 1): Pasif difüzyon, kolaylaştırılmış difüzyon ve aktif taşıma². Basit difüzyon, çözünür, yüksüz ve polar olmayan çözünen maddelerin konsantrasyon gradyanlarını yarı geçirgen bir zardan aşağı indirdiği süreçtir (Şekil 1A). Membran proteinleri, çözünen maddelerin daha yüksek konsantrasyonlu bir bölgeden daha düşük konsantrasyonlu bir bölgeye hareketini içerdiğinden bu sürece yardımcı olmaz. Difüzyon hızı Fick Yasası^3'e dayanmaktadır. Öte yandan, kolaylaştırılmış difüzyon, zarın enerji harcaması olmadan yalnızca seçici çözünen maddelerin bir konsantrasyon gradyanı boyunca geçmesine izin verdiği proteine bağlı bir taşımadır (Şekil 1B). Bu tür bir taşıma spesifiktir ve doygunluk kinetiği sergilemede basit difüzyondan farklıdır.

Aktif taşıma, moleküllerin konsantrasyon gradyanlarına karşı, yani ATP veya iyon gradyanları kullanılarak daha düşük konsantrasyon bölgesinden daha yüksek konsantrasyonlu bir bölgeye proteine bağlı bir taşınmasıdır (Şekil 1C). Taşıyıcı ATP'yi hidrolize ettiğinde, taşıma birincil aktif taşıma olarak adlandırılır (Şekil 1C; sol panel). Aktif taşımanın başka bir şekli ikincil aktif taşımadır (Şekil 1C; sağ panel). İkincil aktif taşımada, çözünen maddeler bir elektrokimyasal gradyana dayalı olarak hareket ettirilir. Bir taşıyıcı protein, bir iyonun (tipik olarak Na⁺) konsantrasyon gradyanından aşağı hareketini başka bir molekülün veya bir iyonun konsantrasyon gradyanına karşı hareketi ile birleştirdiğinde gerçekleşir. Bu tür bir çözünen madde hareketi, hem çözünen hem de iyonun aynı yönde hareket ettiği bir ortak taşıma (Symport) veya bir değişim (Antiport) olabilir, bu durumda çözünen ve iyon zıt yönlerde hareket eder.

Gıda kaynaklarından alınan diyet amino asitleri ve monosakkaritler ince bağırsakta emilir. İnce barsak fonksiyonel olarak Duodenum, Jejunum ve İleum olmak üzere üç segmente ayrılabilir (Şekil 2). Çözünen maddenin emilimi ince bağırsak boyunca gerçekleşir ve maksimum emilim jejunumda ve ileumun proksimal ucunda meydana gelir. Bağırsak enterositleri polarize hücrelerdir ve iki bitişik hücreyi birbirine bağlayan sıkı bağlantılar, bazolateral ve apikal membran bölgesi olmak üzere iki ayrı zar bölgesi oluşturur (Şekil 2). Sindirim tarafından üretilen luminal çözünen maddelerin emilimi, apikal membran bölgesinde⁴ meydana gelir.

Apikal membrandaki bağırsak enterositlerinde histidin taşınması, sodyuma bağımlı ikincil bir aktif semptom örneğidir. Bazolateral uçta, enterosit içine giren histidin, konsantrasyon gradyanından hepatik portal dolaşımına doğru hareket eder. Enterosit içindeki hücre içi sodyum konsantrasyonları, bazolateral membran üzerinde bulunan Na⁺ K⁺ATPaz tarafından sodyumun hücre dışına aktif olarak pompalanması nedeniyle hücre dışı/luminal konsantrasyonlardan daha düşük olan 12 mmole/L^1'de tutulur (Şekil 3). Enterositlerin apikal zarında, B⁰AT ve sodyum nötr amino asit taşıyıcı (SNAT) 5, sadece histidini değil, aynı zamanda asparagin ve glutamin gibi amino asitleri de sodyuma bağımlı bir birlikte taşımada taşıyan ana taşıyıcılardır ^5,6. Enterositlerin bazolateral zarında bulunan Büyük Amino asit Taşıyıcı (LAT)1 adı verilen başka bir taşıma proteini, lösin, triptofan, tirozin ve fenilalanin gibi büyük nötr amino asitleri zar⁷ boyunca taşır.

Deneyimsel öğrenme pedagojisi yoluyla spektrofotometri ve rutin biyokimyasal tahliller gibi tekniklerle entegre edilmiş membran taşınımı kavramının öğretilmesi amacıyla, kavramı sadece anlaşılması kolay terimlerle göstermekle kalmayıp aynı zamanda lisans öğrencileri için katılımcı öğrenmeyi de mümkün kılan metodolojilerin geliştirilmesi zorunludur. Şu anda, öğrencilerin bu tür biyokimya kavramlarını öğrenmek için uygulamalı katılım için sınırlı kaynaklar bulunmaktadır. Burada, lisans laboratuvarlarında çoğaltılması kolay olan ve diğer metabolitlerin taşınmasını değerlendirmek için de uyarlanabilen, keçi bağırsak zarı boyunca Histidin taşınmasını göstermek için basit bir protokol sunuyoruz. Daha da önemlisi, yöntem bir lisans laboratuvarında ucuz materyaller kullanır ve böylece en basit laboratuvar ortamlarında bile deneyimsel öğrenmeyi mümkün kılar.

Protokol

Tüm adımlarla birlikte protokolün tamamı, Şekil 4'te şematik bir diyagram olarak gösterilmiştir. Yöntem, sıçan bağırsakları⁸ kullanılarak yapılan önceki bir çalışmadan uyarlanmıştır. Deney, kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan örnekler ticari bir satıcıdan temin edilmiştir.

DİKKAT: Bu deney sırasında eldiven giyin.

1. Ters Jejunum keselerinin hazırlanması

1. Keçi jejunumunu ön işlemden geçirin ve temizleyin.
   1. Taze kurban edilmiş sağlıklı bir keçinin bağırsaklarını lisanslı bir satıcıdan temin edin.
   2. Bağırsakları, temizlik için tamamen daldırılacak şekilde yeterli miktarda 1x fosfat tampon tuzlu suya (PBS) yerleştirin.
   3. İnce bağırsağı kalın bağırsaktan ayırın ve dış bağ dokusunun makas kullanılarak çıkarıldığından emin olun.
   4. İnce bağırsağı 10 mL'lik bir şırınga kullanarak 1x PBS ile nazikçe yıkayın ve içi boş bir ince bağırsak torbası elde etmek için sindirilmemiş gıda maddesinin çıkarılmasını sağlayın. Etkili temizlik için bu işlemi en az üç kez tekrarlayın.
      NOT: Yıkama sırasında aşırı güç veya iğne kullanmaktan kaçının. Kuvvet kullanımı bağırsak duvarlarının delinmesine neden olabilir ve böylece bağırsak enterositlerine zarar verebilir.
   5. Üç parçayı elde etmek için bir cetvel kullanarak ince bağırsağın tam uzunluğunu ölçün: Duodenum (ince bağırsağın 1/^4'ü) ve geri kalanı Jejunum ve Ileum'a eşit olarak bölünür.
   6. Jejunum bölümünü kullanarak deneye devam edin.
2. Ters Jejunum hazırlayın.
   1. Bir bıçak kullanarak tüm bağ dokusunu çıkararak jejunum kısmını temizleyin.
   2. Jejunumu 12-15 cm uzunluğunda porsiyonlar halinde kesin, 1x PBS ile yıkayın ve PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin.
   3. Villus kısmının dışarıdan açığa çıkmasını sağlamak için bir cam çubuk kullanarak jejunum kısımlarını ters çevirin.
      DİKKAT: Keskin kenarlı bir cam çubuk kullanmaktan kaçının. Ayrıca, cam çubuğun çapı kesenin çapından daha büyük olmamalıdır.
      NOT: Bu noktada, villus ışık mikroskobu altında görüntülenebilir (Şekil 4).
   4. Ters çevrilmiş jejunum kısımlarını 1x PBS ile nazikçe yıkayın.
   5. Ters çevrilmiş jejunumun yanlarından herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
   6. Ters jejunum kısımlarını 5 cm uzunluğunda keseler halinde kesin.
   7. Bir ucunu sicim ile bağlayın ve keseleri PBS ile doldurarak bağlı uçta görsel sızıntı olup olmadığını tekrar kontrol edin.
   8. Dış yüzeyinde villus bulunan boş bir ters çevrilmiş kese oluşturmak için diğer ucunu bağlayın.
   9. Ters çevrilmiş keseyi filtre kağıdına vurarak harici sızıntıları tekrar kontrol edin.
3. Ters çevrilmiş keseleri 1x PBS'de dengeleyin.
   1. Deneye aynı gün devam edin veya keseleri gece boyunca 4 °C'de 1x PBS'de saklayın.

2. Histidin taşınımı için deney düzeneği

1. Tablo 1'de verildiği gibi farklı sodyum klorür konsantrasyonlarına göre üç adet 50 mL'lik tüpten oluşan iki seti birleştirin.
2. Hazırlanan bağırsak keselerini setlerin her biri için 30 dakika ve 60 dakika boyunca belirtilen tüplere batırın.
3. Belirlenen süreden sonra, kese içindeki çözeltiyi ayrı bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde boşaltın ve hacmi belirleyin.
4. 2 mL'lik bir şırınga kullanarak kese içindeki sıvıyı aspire edin. Alternatif olarak, kesenin bir ucunu çözün ve içeriği 1,5 mL'lik yeni bir tüpte toplayın.
5. Histidin tahmini için toplanan örneklerin 0.1 mL'sini analiz edin ve standart grafiği kullanarak konsantrasyonu hesaplayın.

3. Pauly'nin reaksiyonunu kullanarak histidin tahmini

1. Histidin için standart bir eğri hazırlayın.
   1. Tablo 2'de belirtildiği gibi, histidin (5 mM) ve su stok çözeltileri kullanarak değişen konsantrasyonlarda histidin içeren çözeltiler hazırlayın.
   2. Her tüpe sülfanilik asit (0,5 mL) ve sodyum nitrat (0,5 mL) ekleyin.
   3. Tüpleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin, ardından her tüpe 1 mL sodyum karbonat ve etanol ekleyin.
   4. Tüpleri oda sıcaklığında (~ 20 ° C) 20 dakika inkübe edin ve 490 nm dalga boyunda absorbansa dikkat edin.
   5. Histidin konsantrasyonuna karşı standart bir absorbans eğrisi çizin.
      NOT: Histidin için yapılan bu test, histidinin bir diazo bileşiği oluşturma özelliğine dayanmaktadır (Şekil 5).

Sonuçlar

Histidinin bağırsak villusları tarafından ters çevrilmiş keselerin lümenine emilmesi yoluyla histidinin bağırsak hareketliliğini göstermek için deneysel iş akışı Şekil 4, Tablo 1 ve Tablo 2'de gösterilmektedir. Üç bağımsız deney düzeneği gerçekleştirildi ve temsili veriler Şekil 6'da sunuldu.

Verilen deneysel koşullar altında, Pauly'nin r...

Tartışmalar

Membran taşınımı, temel veya uygulamalı tüm büyük biyolojik bilim disiplinlerinin lisans öğrencilerine öğretilen en temel kavramlardan biridir. Geleneksel olarak, zarlar arasındaki hareket, radyoaktif izotoplarla etiketlenmiş metabolitler kullanılarak görselleştirilmiştir. Ancak, bu yöntemler son derece tehlikelidir ve öğretme veya öğrenme için uygun değildir. Deneyimsel öğrenme, bu tür karmaşık kavramları anlamak için en iyi pedagojik teknik olsa da, alty...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	TARSONS	500020
10 mL Test Tubes	BOROSIL	9800U04
50 mL Sterile Falcon Tubes	TARSONS	546041
500 mL Beaker	BOROSIL	10044977
500 mL Conical Flask	BOROSIL	691467
D-Glucose	SRL	42738
Digital Spectrophotometer	SYSTRONICS	2710
Ethanol	EMSURE	1009831000
Finpipettes	THERMOFISHER	4642090
Glass Stirrer Rod	BOROSIL	9850107
L-Histidine	SRL	17849
NaCl	SRL	41721
Nitrile Gloves	KIMTECH	112-4847
Petri Dish	TARSONS	460090
Phosphate Buffered Saline (ph 7.4)	SRL	95131
Pipette Tips	ABDOS	P10102
Sodium Carbonate	SRL	89382
Sodium Nitrate	SRL	44618
Sodium Phosphate Dibasic (anhydrous)	SRL	53046
Sodium Phosphate Monobasic (anhydrous)	SRL	22249
Sulphanilic Acid	SRL	15354