ヤギ腸逆嚢を用いたヒスチジンの膜輸送のデモンストレーション:学部生のための体験型教育ツール

要約

ここでは、ヤギの腸内でのヒスチジンの膜輸送を実証する安価で再現性の高い方法を報告します。このプロセスは、ナトリウム勾配によって可能になるヒスチジンイオンとナトリウムイオンを腸細胞膜全体に共輸送することによって発生します。この方法は、体験学習教育学を利用して、生体膜を横切る溶質の動きをよりよく理解します。

要約

ヒスチジンは必須アミノ酸であり、免疫系、肺換気、血管循環に関与する代謝産物の前駆体でもあります。食事性ヒスチジンの吸収は、腸細胞の頂端膜上に存在するブロード中性アミノ酸トランスポーター(B⁰AT)によるナトリウム共役中性アミノ酸輸送に大きく依存します。.ここでは、ヤギ空腸逆嚢を使用して、内腔からの腸絨毛腸細胞によるヒスチジンの吸収を示します。さまざまな濃度のナトリウムとヒスチジンに曝露された空腸嚢をアッセイして、時間の関数として嚢内のヒスチジンの濃度を決定しました。結果は活発なヒスチジン吸収を示しています。塩の濃度を上げると、ヒスチジンの吸収が高くなり、ヤギの腸管逆嚢におけるナトリウムとヒスチジンの吸収が共鳴していることが示唆されました。このプロトコールは、適切な修飾を施したアミノ酸または他の代謝産物の腸内移動性を視覚化するために適用することができます。この実験は、学部生が膜輸送の概念を理解するのに役立つ体験型教育ツールとして提案します。

概要

生体細胞は、細胞内サイトゾルを細胞外含有量から分離する膜脂質二重層に囲まれています。膜は、溶質¹の動きを調節する半透性の障壁として機能します。生体膜を横切る輸送は、溶質の濃度や電荷など、いくつかの要因に依存する溶質の透過係数の影響を受けます。一般に、溶質は、受動的拡散、促進拡散、および能動的輸送²の3つのメカニズムを使用して膜内を移動します(図1)。単純拡散とは、可溶性、非電荷、および非極性の溶質が、半透膜を介して濃度勾配を下るプロセスです(図1A)。膜タンパク質は、高濃度の領域から低濃度の領域への溶質の移動を伴うため、このプロセスには役立ちません。拡散速度は、フィックの法則³に基づいています。一方、促進拡散はタンパク質依存性の輸送であり、メンブレンはエネルギーを消費することなく選択的な溶質のみが濃度勾配を通過することを可能にします(図1B)。この種の輸送は特異的であり、飽和速度論を示す点で単純な拡散とは異なります。

能動的輸送とは、ATPまたはイオン勾配を使用して、分子の濃度勾配に逆らって....

プロトコル

図 4では、プロトコル全体とすべてのステップを概略図として示しています。この方法は、ラットの腸8を用いた先行研究から得られた^{ものである。}実験は、機関のガイドラインに準拠して実施されました。この研究で使用されたサンプルは、商用ベンダーから調達されました。

注意:この実験中は手袋を着用してください。

1. 逆空腸嚢の調製

1. ヤギ空腸を前処理して清掃します。
   1. 生贄にされたばかりの健康なヤギの内臓を、認可されたベンダーから調達します。
   2. 内臓を十分な1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に入れて、洗浄のために完全に浸します。
   3. 小腸を大腸から分離し、はさみを使用して外部結合組織が除去されていることを確認します。
   4. 10mLシリンジを使用して1x PBSで小腸を穏やかに洗い流し、未消化の食物物質を確実に除去して小腸の中空袋を得る。このプロセスを少なくとも3回繰り返すと、効果的なクリーニングが可能になります。
      注意: 洗い流し中は、過度の力や針の使用を避けてください。力を加えると、腸壁に穴が開き、腸腸細胞が損傷する可能性があります。<....

結果

腸絨毛によるヒスチジンの逆嚢の内腔への吸収によるヒスチジンの腸内可動性を実証するための実験ワークフローを、 図4、 表1 および 表2に示す。3つの独立した実験セットアップを実行し、代表的なデータを 図6に示します。

与えられた実験条件下で、Paulyの反応を用いたヒ.......

ディスカッション

膜輸送は、基礎または応用を問わず、すべての主要な生物科学分野の学部生に教えられる最も基本的な概念の1つです。従来、膜を横切る移動は、放射性同位元素で標識された代謝物を使用して視覚化されてきました。ただし、これらの方法は非常に危険であり、教育や学習には適していません。体験学習は、このような複雑な概念を理解するための最良の教育手法?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	TARSONS	500020
10 mL Test Tubes	BOROSIL	9800U04
50 mL Sterile Falcon Tubes	TARSONS	546041
500 mL Beaker	BOROSIL	10044977
500 mL Conical Flask	BOROSIL	691467
D-Glucose	SRL	42738
Digital Spectrophotometer	SYSTRONICS	2710
Ethanol	EMSURE	1009831000
Finpipettes	THERMOFISHER	4642090
Glass Stirrer Rod	BOROSIL	9850107
L-Histidine	SRL	17849
NaCl	SRL	41721
Nitrile Gloves	KIMTECH	112-4847
Petri Dish	TARSONS	460090
Phosphate Buffered Saline (ph 7.4)	SRL	95131
Pipette Tips	ABDOS	P10102
Sodium Carbonate	SRL	89382
Sodium Nitrate	SRL	44618
Sodium Phosphate Dibasic (anhydrous)	SRL	53046
Sodium Phosphate Monobasic (anhydrous)	SRL	22249
Sulphanilic Acid	SRL	15354