Dimostrazione del trasporto di membrana dell'istidina utilizzando sacche intestinali invertite di capra: uno strumento pedagogico esperienziale per studenti universitari

Riepilogo

Qui, riportiamo un metodo economico e riproducibile che dimostra il trasporto di membrana dell'istidina nell'intestino di una capra. Questo processo avviene attraverso il co-trasporto di istidina e ioni sodio abilitati dal gradiente di sodio attraverso la membrana degli enterociti. Questo metodo sfrutta la pedagogia dell'apprendimento esperienziale per comprendere meglio il movimento dei soluti attraverso le membrane biologiche.

Abstract

L'istidina è un aminoacido essenziale che è anche un precursore dei metaboliti implicati nel sistema immunitario, nella ventilazione polmonare e nella circolazione vascolare. L'assorbimento dell'istidina alimentare si basa in gran parte sul trasporto di aminoacidi neutri accoppiati al sodio da parte del trasportatore di aminoacidi neutri Broad (B⁰AT) presente sulla membrana apicale dell'enterocita. Qui, dimostriamo l'assorbimento dell'istidina da parte degli enterociti dei villi intestinali dal lume utilizzando le sacche invertite digiunali di capra. Le sacche digiunali esposte a concentrazioni variabili di sodio e istidina sono state analizzate per determinare la concentrazione di istidina all'interno delle sacche in funzione del tempo. I risultati mostrano un assorbimento attivo dell'istidina. L'aumento della concentrazione di sale ha comportato un maggiore assorbimento dell'istidina, suggerendo un simportone dell'assorbimento di sodio e istidina nelle sacche intestinali invertite di capra. Questo protocollo può essere applicato per visualizzare la mobilità intestinale di aminoacidi o altri metaboliti con le opportune modifiche. Proponiamo questo esperimento come strumento pedagogico esperienziale che può aiutare gli studenti universitari a comprendere il concetto di trasporto a membrana.

Introduzione

Le cellule biologiche sono circondate da un doppio strato lipidico di membrana che separa il citosol intracellulare dal contenuto extracellulare. La membrana funge da barriera semipermeabile che regola il movimento dei soluti¹. Il trasporto attraverso le membrane biologiche è influenzato dal coefficiente di permeabilità di un soluto, che dipende da diversi fattori, tra cui la concentrazione e la carica del soluto. In generale, i soluti si muovono attraverso la membrana utilizzando tre meccanismi (Figura 1): diffusione passiva, diffusione facilitata e trasporto attivo². La diffusione semplice è il processo mediante il quale soluti solubili, non caricati e non polari passano lungo il loro gradiente di concentrazione attraverso una membrana semipermeabile (Figura 1A). Le proteine di membrana non aiutano in questo processo poiché comporta il movimento dei soluti da una regione di concentrazione più alta a una regione di concentrazione più bassa. Il tasso di diffusione si basa sulla legge di Fick³. D'altra parte, la diffusione facilitata è un trasporto proteino-dipendente in cui la membrana consente solo ai soluti selettivi di passare lungo un gradiente di concentrazione senza il dispendio di energia (Figura 1B). Questo tipo di trasporto è specifico e differisce dalla semplice diffusione nell'esibire una cinetica di saturazione.

Il trasporto attivo è un trasporto proteino-dipendente di molecole rispetto al loro gradiente di concentrazione, cioè dalla regione di concentrazione più bassa a una regione di concentrazione più alta con l'uso di gradienti di ATP o ioni (Figura 1C). Quando il trasportatore idrolizza l'ATP, il trasporto è definito trasporto attivo primario (Figura 1C; pannello di sinistra). Un'altra forma di trasporto attivo è il trasporto attivo secondario (Figura 1C; pannello di destra). Nel trasporto attivo secondario, i soluti vengono spostati in base a un gradiente elettrochimico. Si verifica quando una proteina trasportatrice accoppia il movimento di uno ione (tipicamente Na⁺) lungo il suo gradiente di concentrazione con il movimento di un'altra molecola o di uno ione contro il suo gradiente di concentrazione. Questo tipo di movimento del soluto può essere un co-trasporto (Symport) in cui sia il soluto che lo ione si muovono nella stessa direzione o uno scambio (Antiport), nel qual caso il soluto e lo ione si muovono in direzioni opposte.

Gli aminoacidi alimentari e i monosaccaridi provenienti da fonti alimentari vengono assorbiti nell'intestino tenue. L'intestino tenue può essere diviso funzionalmente in tre segmenti: duodeno, digiuno e ileo (Figura 2). L'assorbimento del soluto avviene in tutto l'intestino tenue, con il massimo assorbimento che si verifica al digiuno e all'estremità prossimale dell'ileo. Gli enterociti intestinali sono cellule polarizzate e le giunzioni strette che collegano due cellule adiacenti creano due siti di membrana distinti: il sito della membrana basolaterale e quello apicale (Figura 2). L'assorbimento dei soluti luminali generati dalla digestione avviene sul sito⁴ della membrana apicale.

Il trasporto dell'istidina negli enterociti intestinali alla membrana apicale è un esempio di un simporto attivo secondario che è sodio-dipendente. All'estremità basolaterale, l'istidina che entra nell'enterocita si sposta lungo il gradiente di concentrazione nella circolazione portale epatica. Le concentrazioni intracellulari di sodio all'interno dell'enterocita sono mantenute a 12 mmoli/L¹, che è inferiore alle concentrazioni extracellulari/luminali, a causa del pompaggio attivo di sodio fuori dalla cellula da parte della Na⁺ K⁺ATPasi situata sulla membrana basolaterale (Figura 3). A livello della membrana apicale degli enterociti, l'AT B⁰e il trasportatore di amminoacidi neutri di sodio (SNAT) 5 sono i principali trasportatori che trasportano non solo l'istidina ma anche gli aminoacidi come l'asparagina e la glutammina in un cotrasporto sodio-dipendente ^5,6. Un'altra proteina di trasporto chiamata Large Amino Acid Transporter (LAT)1 presente sulla membrana basolaterale degli enterociti trasporta grandi amminoacidi neutri come leucina, triptofano, tirosina e fenilalanina attraverso la membrana⁷.

Con l'obiettivo di insegnare il concetto di trasporto a membrana integrato con tecniche come la spettrofotometria e i saggi biochimici di routine attraverso la pedagogia dell'apprendimento esperienziale, è imperativo sviluppare metodologie che possano non solo dimostrare il concetto in termini di facile comprensione, ma anche consentire l'apprendimento partecipativo per gli studenti universitari. Attualmente, ci sono risorse limitate a disposizione degli studenti per l'impegno pratico nell'apprendimento di tali concetti di biochimica. Qui, riportiamo un semplice protocollo per dimostrare il trasporto dell'istidina attraverso la membrana intestinale della capra che è facile da riprodurre nei laboratori universitari e può essere adattato per valutare il trasporto anche di altri metaboliti. Ancora più importante, il metodo utilizza materiali poco costosi in un laboratorio universitario, consentendo così l'apprendimento esperienziale anche nel più semplice dei laboratori.

Protocollo

L'intero protocollo con tutti i passaggi è rappresentato come un diagramma schematico nella Figura 4. Il metodo è adattato da uno studio precedente che utilizzava intestini di ratto⁸. L'esperimento è stato eseguito nel rispetto delle linee guida istituzionali. I campioni utilizzati in questo studio sono stati acquistati da un fornitore commerciale.

ATTENZIONE: Indossare i guanti durante questo esperimento.

1. Preparazione delle sacche di digiuno invertite

1. Pretrattare e pulire il digiuno di capra.
   1. Procurati le interiora di una capra sana appena sacrificata da un venditore autorizzato.
   2. Metti le interiora in una quantità sufficiente di soluzione salina tampone fosfato (PBS) in modo che siano completamente immerse per la pulizia.
   3. Separa l'intestino tenue dall'intestino crasso e assicurati che il tessuto connettivo esterno venga rimosso usando le forbici.
   4. Sciacquare delicatamente l'intestino tenue con 1x PBS utilizzando una siringa da 10 ml, assicurando la rimozione del materiale alimentare non digerito per ottenere una sacca cava di intestino tenue. Ripetere questo processo almeno tre volte per una pulizia efficace.
      NOTA: Evitare di usare una forza eccessiva o aghi durante il lavaggio. L'uso della forza può provocare la perforazione delle pareti intestinali e quindi danneggiare gli enterociti intestinali.
   5. Misurare l'intera lunghezza dell'intestino tenue usando un righello per ottenere le tre parti: Duodeno (1/^{4 dell'intestino} tenue) e il resto diviso uniformemente in digiuno e ileo.
   6. Procedi con l'esperimento utilizzando la parte Jejunum.
2. Prepara il digiuno invertito.
   1. Pulire la parte digiuno rimuovendo tutto il tessuto connettivo con una lama.
   2. Tagliare il digiuno in porzioni lunghe 12-15 cm, lavarlo con 1x PBS e metterlo in una capsula di Petri contenente PBS.
   3. Capovolgere le porzioni di digiuno usando una bacchetta di vetro per consentire l'esposizione della parte dei villi all'esterno.
      ATTENZIONE: Evitare l'uso di un'asta di vetro con spigoli vivi. Inoltre, il diametro dell'asta di vetro non deve essere maggiore del diametro della sacca.
      NOTA: A questo punto, è possibile visualizzare i villi al microscopio ottico (Figura 4).
   4. Sciacquare delicatamente le parti invertite del digiuno con 1x PBS.
   5. Verificare la presenza di eventuali perdite dai lati del digiuno rovesciato.
   6. Tagliare le parti invertite del digiuno in sacche lunghe 5 cm.
   7. Legare un'estremità con lo spago e ricontrollare la presenza di perdite visive all'estremità legata riempiendo le sacche con PBS.
   8. Legare l'altra estremità in modo da creare una sacca rovesciata vuota con villi sulla superficie esterna.
   9. Ricontrollare la presenza di perdite esterne picchiettando la sacca rovesciata sulla carta da filtro.
3. Equilibra le sacche invertite in 1x PBS.
   1. Procedere con l'esperimento lo stesso giorno o conservare le sacche per una notte in 1x PBS a 4 °C.

2. Configurazione sperimentale per il trasporto dell'istidina

1. Assemblare due set di tre provette da 50 mL in base alle diverse concentrazioni di cloruro di sodio, come indicato nella Tabella 1.
2. Immergere le sacche intestinali preparate nelle provette specificate per 30 minuti e 60 minuti per ciascuna delle serie.
3. Trascorso il tempo stabilito, svuotare la soluzione all'interno della sacca in una provetta da microcentrifuga separata da 1,5 ml e determinare il volume.
4. Aspirare il liquido all'interno della sacca utilizzando una siringa da 2 mL. In alternativa, slegare un'estremità del sacco e raccogliere il contenuto in una provetta fresca da 1,5 ml.
5. Analizzare 0,1 mL dei campioni raccolti per la stima dell'istidina e calcolare la concentrazione utilizzando il grafico standard.

3. Stima dell'istidina utilizzando la reazione di Pauly

1. Preparare una curva standard per l'istidina.
   1. Preparare soluzioni con concentrazioni variabili di istidina come indicato nella Tabella 2 utilizzando soluzioni madre di istidina (5 mM) e acqua.
   2. Aggiungere acido sulfanilico (0,5 mL) e nitrato di sodio (0,5 mL) a ciascuna provetta.
   3. Incubare le provette per 5 minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungere 1 mL di carbonato di sodio ed etanolo a ciascuna provetta.
   4. Incubare le provette per 20 minuti a temperatura ambiente (~20 °C) e notare l'assorbanza alla lunghezza d'onda di 490 nm.
   5. Tracciare una curva standard dell'assorbanza rispetto alla concentrazione di istidina.
      NOTA: Questo test per l'istidina si basa sulla proprietà dell'istidina di formare un composto diazoico (Figura 5).

Risultati

Il flusso di lavoro sperimentale per dimostrare la mobilità intestinale dell'istidina attraverso l'assorbimento dell'istidina da parte dei villi intestinali nel lume delle sacche invertite è illustrato nella Figura 4, Tabella 1 e Tabella 2. Sono state eseguite tre configurazioni sperimentali indipendenti e i dati rappresentativi sono presentati nella Figura 6.

Nelle...

Discussione

Il trasporto a membrana è uno dei concetti fondamentali insegnati agli studenti universitari di tutte le principali discipline delle scienze biologiche, di base o applicate. Tradizionalmente, il movimento attraverso le membrane è stato visualizzato utilizzando metaboliti marcati con isotopi radioattivi. Tuttavia, questi metodi sono estremamente pericolosi e non fattibili per l'insegnamento o l'apprendimento. Sebbene l'apprendimento esperienziale sia la migliore tecnica pedagogica per c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	TARSONS	500020
10 mL Test Tubes	BOROSIL	9800U04
50 mL Sterile Falcon Tubes	TARSONS	546041
500 mL Beaker	BOROSIL	10044977
500 mL Conical Flask	BOROSIL	691467
D-Glucose	SRL	42738
Digital Spectrophotometer	SYSTRONICS	2710
Ethanol	EMSURE	1009831000
Finpipettes	THERMOFISHER	4642090
Glass Stirrer Rod	BOROSIL	9850107
L-Histidine	SRL	17849
NaCl	SRL	41721
Nitrile Gloves	KIMTECH	112-4847
Petri Dish	TARSONS	460090
Phosphate Buffered Saline (ph 7.4)	SRL	95131
Pipette Tips	ABDOS	P10102
Sodium Carbonate	SRL	89382
Sodium Nitrate	SRL	44618
Sodium Phosphate Dibasic (anhydrous)	SRL	53046
Sodium Phosphate Monobasic (anhydrous)	SRL	22249
Sulphanilic Acid	SRL	15354