Демонстрация мембранного транспорта гистидина с использованием инвертированных мешков в козьем кишечнике: экспериментальный педагогический инструмент для студентов бакалавриата

Резюме

В этой статье мы рассказываем о недорогом и воспроизводимом методе, демонстрирующем мембранный транспорт гистидина в кишечнике козы. Этот процесс происходит за счет совместного транспортирования ионов гистидина и натрия под действием градиента натрия через мембрану энтероцитов. Этот метод использует педагогику эмпирического обучения для лучшего понимания движения растворенных веществ через биологические мембраны.

Аннотация

Гистидин является незаменимой аминокислотой, которая также является предшественником метаболитов, участвующих в иммунной системе, легочной вентиляции и сосудистом кровообращении. Абсорбция гистидина с пищей в значительной степени зависит от транспорта нейтральных аминокислот, связанного с натрием, транспортером нейтральных аминокислот Броуда (B⁰AT), присутствующим на апикальной мембране энтероцита. Здесь мы демонстрируем абсорбцию гистидина кишечными ворсинчатыми энтероцитами из просвета с использованием перевернутых мешочков тощей кишки козы. Тощищие мешочки, подвергшиеся воздействию различных концентраций натрия и гистидина, были проанализированы для определения концентрации гистидина внутри мешков в зависимости от времени. Результаты показывают активное всасывание гистидина. Увеличение концентрации соли приводило к более высокой абсорбции гистидина, что свидетельствует о симпорте абсорбции натрия и гистидина в инвертированных кишечных мешочках коз. Этот протокол может быть применен для визуализации подвижности аминокислот или других метаболитов в кишечнике с соответствующими модификациями. Мы предлагаем этот эксперимент в качестве экспериментального педагогического инструмента, который может помочь студентам бакалавриата понять концепцию мембранного транспорта.

Введение

Биологические клетки окружены мембранным липидным бислоем, который отделяет внутриклеточный цитозоль от внеклеточного содержимого. Мембрана служит полупроницаемым барьером, регулирующим движение растворенных веществ¹. На транспорт через биологические мембраны влияет коэффициент проницаемости растворенного вещества, который зависит от нескольких факторов, в том числе от концентрации и заряда растворенного вещества. В целом, растворенные вещества перемещаются через мембрану с помощью трех механизмов (рис. 1): пассивная диффузия, облегченная диффузия и активный транспорт². Простая диффузия — это процесс, при котором растворимые, незаряженные и неполярные растворенные вещества пропускают градиент своей концентрации вниз по полупроницаемой мембране (рис. 1A). Мембранные белки не участвуют в этом процессе, поскольку он включает в себя перемещение растворенных веществ из области с более высокой концентрацией в область с более низкой концентрацией. Скорость диффузии основана на законе Фика³. С другой стороны, облегченная диффузия представляет собой белок-зависимый транспорт, при котором мембрана позволяет только селективным растворенным веществам проходить по градиенту концентрации без затрат энергии (рис. 1B). Этот вид транспорта специфичен и отличается от простой диффузии проявлением кинетики насыщения.

Активный транспорт представляет собой белок-зависимый транспорт молекул против градиента их концентрации, т.е. из области более низкой концентрации в область более высокой концентрации с использованием АТФ или ионных градиентов (рис. 1В). Когда транспортер гидролизует АТФ, этот транспорт называется первичным активным транспортом (рис. 1C; левая панель). Другой формой активного транспорта является вторичный активный транспорт (рис. 1C; правая панель). При вторичном активном транспорте растворенные вещества перемещаются на основе электрохимического градиента. Это происходит, когда белок-транспортер связывает движение иона (обычно Na⁺) вниз по градиенту концентрации с движением другой молекулы или иона против градиента концентрации. Этот вид движения растворенного вещества может быть совместным транспортом (Symport), при котором растворенное вещество и ион движутся в одном направлении, или обменом (Antiport), в этом случае растворенное вещество и ион движутся в противоположных направлениях.

Пищевые аминокислоты и моносахариды из пищевых источников всасываются в тонком кишечнике. Тонкую кишку можно функционально разделить на три сегмента: двенадцатиперстную кишку, тощую кишку и подвздошную кишку (рис. 2). Всасывание растворенного вещества происходит по всему тонкому кишечнику, при этом максимальная абсорбция происходит в тощей кишке и на проксимальном конце подвздошной кишки. Кишечные энтероциты представляют собой поляризованные клетки, а плотные соединения, соединяющие две соседние клетки, создают два отдельных мембранных участка - базолатеральный и апикальный (рис. 2). Абсорбция люминальных растворенных веществ, образующихся в процессе пищеварения, происходит на участке апикальной мембраны⁴.

Транспорт гистидина в кишечных энтероцитах на апикальной мембране является примером вторичного активного симпорта, который зависит от натрия. На базолатеральном конце гистидин, поступающий в энтероцит, движется вниз по градиенту концентрации в печеночный портальный круг кровообращения. Внутриклеточные концентрации натрия в энтероците поддерживаются на уровне 12 ммоль/^л1, что ниже внеклеточных/люминальных концентраций, что обусловлено активным выкачиванием натрия из клетки Na⁺ К⁺АТФазой, расположенной на базолатеральной мембране (рис. 3). На апикальной мембране энтероцитов^{B 0}AT и натрий-нейтральный транспортер аминокислот (SNAT) 5 являются основными транспортерами, которые транспортируют не только гистидин, но и аминокислоты, такие как аспарагин и глутамин, в натрий-зависимом котранспорте ^5,6. Другой транспортный белок, называемый Large Amino Acid Transporter (LAT)1, присутствующий на базолатеральной мембране энтероцитов, транспортирует через мембрану крупные нейтральные аминокислоты, такие как лейцин, триптофан, тирозин и фенилаланин^.

С целью обучения концепции мембранного транспорта в сочетании с такими методами, как спектрофотометрия и рутинные биохимические анализы с помощью педагогики эмпирического обучения, крайне важно разработать методологии, которые могут не только продемонстрировать эту концепцию в простых для понимания терминах, но и обеспечить совместное обучение для студентов бакалавриата. В настоящее время у студентов есть ограниченные ресурсы для практического участия в изучении таких концепций биохимии. В этой статье мы представляем простой протокол для демонстрации транспорта гистидина через мембрану кишечника козы, который легко воспроизвести в студенческих лабораториях и который может быть адаптирован для оценки транспорта других метаболитов. Что еще более важно, метод использует недорогие материалы в студенческой лаборатории, тем самым обеспечивая экспериментальное обучение даже в самых простых лабораторных условиях.

протокол

Весь протокол со всеми этапами представлен в виде схематической диаграммы на рисунке 4. Метод адаптирован из предыдущего исследования с использованием кишечника крысы⁸. Эксперимент проводился в соответствии с институциональными рекомендациями. Образцы, использованные в этом исследовании, были приобретены у коммерческого поставщика.

ВНИМАНИЕ: Во время эксперимента надевайте перчатки.

1. Подготовка перевернутых тощищих мешочков

1. Предварительно обработайте и очистите козью тощую кишку.
   1. Приобретите внутренности только что принесенной в жертву здоровой козы у лицензированного продавца.
   2. Поместите внутренности в достаточное количество фосфатного буферного раствора (PBS), чтобы они были полностью погружены для очистки.
   3. Отделите тонкую кишку от толстой, и убедитесь, что наружная соединительная ткань удалена с помощью ножниц.
   4. Аккуратно промойте тонкую кишку 1x PBS с помощью шприца объемом 10 мл, обеспечивая удаление непереваренного пищевого материала для получения полого мешка тонкой кишки. Повторите этот процесс не менее трех раз для эффективной очистки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерного использования игл во время промывки. Применение силы может привести к проколу стенок кишечника и, таким образом, повредить кишечные энтероциты.
   5. Измерьте полную длину тонкой кишки с помощью линейки, чтобы получить три части: двенадцатиперстную кишку (1/4 тонкой кишки) и оставшуюся часть, равномерно разделенную на тощую и подвздошную кишку.
   6. Продолжите эксперимент, используя часть тощей кишки.
2. Подготовьте перевернутую тощую кишку.
   1. Очистите тощую кишку, удалив всю соединительную ткань с помощью лезвия.
   2. Разрежьте тощую кишку на порции длиной 12-15 см, промойте 1x PBS и поместите в чашку Петри, содержащую PBS.
   3. Переверните части тощей кишки с помощью стеклянного стержня, чтобы часть ворсинок была обнажена снаружи.
      ВНИМАНИЕ: Избегайте использования стеклянного стержня с острыми краями. При этом диаметр стеклянного стержня не должен быть больше диаметра мешочка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно визуализировать ворсинки под световым микроскопом (Рисунок 4).
   4. Аккуратно промойте перевернутые части тощей кишки 1x PBS.
   5. Проверьте наличие утечек с боков перевернутой тощей кишки.
   6. Вывернутые части тощей кишки разрежьте на мешочки длиной 5 см.
   7. Завяжите один конец шпагатом и повторно проверьте на наличие визуальных утечек на завязанном конце, заполнив мешочки PBS.
   8. Другой конец завяжите так, чтобы получился пустой перевернутый мешок с ворсинками на внешней поверхности.
   9. Повторно проверьте наличие внешних утечек, похлопав перевернутый мешок по фильтровальной бумаге.
3. Уравновесьте перевернутые мешочки в 1x PBS.
   1. Продолжайте эксперимент в тот же день или храните мешочки на ночь при температуре 1x PBS при температуре 4 °C.

2. Экспериментальная установка для транспорта гистидина

1. Соберите два комплекта из трех пробирок по 50 мл в соответствии с различными концентрациями хлорида натрия, как указано в таблице 1.
2. Опустите подготовленные кишечные мешочки в указанные пробирки на 30 мин и 60 мин для каждого из наборов.
3. По истечении назначенного времени слейте раствор внутрь мешочка в отдельную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и определите объем.
4. Аспирируйте жидкость внутри мешочка с помощью шприца объемом 2 мл. В качестве альтернативы развяжите один конец мешочка и соберите содержимое в свежую пробирку объемом 1,5 мл.
5. Анализ 0,1 мл собранных образцов для оценки гистидина и расчет концентрации по стандартному графику.

3. Оценка гистидина по реакции Паули

1. Подготовьте стандартную кривую для гистидина.
   1. Готовят растворы с различными концентрациями гистидина, как указано в таблице 2 , используя исходные растворы гистидина (5 мМ) и воды.
   2. Добавьте в каждую пробирку сульфаниловую кислоту (0,5 мл) и нитрат натрия (0,5 мл).
   3. Инкубируйте пробирки в течение 5 минут при комнатной температуре, затем добавьте по 1 мл карбоната натрия и этанола в каждую пробирку.
   4. Инкубируйте пробирки в течение 20 минут при комнатной температуре (~20 °C) и обратите внимание на поглощение на длине волны 490 нм.
   5. Постройте стандартную кривую зависимости абсорбции от концентрации гистидина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот тест на гистидин основан на свойстве гистидина образовывать диазосоединение (Рисунок 5).

Результаты

Экспериментальный процесс демонстрации кишечной подвижности гистидина путем абсорбции гистидина кишечными ворсинками в просвет вывернутых мешочков проиллюстрирован на рисунках 4, в таблице 1 и таблице 2. Были выполнены три независ?...

Обсуждение

Мембранный транспорт является одним из самых фундаментальных понятий, которые преподаются студентам бакалавриата по всем основным дисциплинам биологических наук, как фундаментальным, так и прикладным. Традиционно движение по мембранам визуализировалось с помощью ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	TARSONS	500020
10 mL Test Tubes	BOROSIL	9800U04
50 mL Sterile Falcon Tubes	TARSONS	546041
500 mL Beaker	BOROSIL	10044977
500 mL Conical Flask	BOROSIL	691467
D-Glucose	SRL	42738
Digital Spectrophotometer	SYSTRONICS	2710
Ethanol	EMSURE	1009831000
Finpipettes	THERMOFISHER	4642090
Glass Stirrer Rod	BOROSIL	9850107
L-Histidine	SRL	17849
NaCl	SRL	41721
Nitrile Gloves	KIMTECH	112-4847
Petri Dish	TARSONS	460090
Phosphate Buffered Saline (ph 7.4)	SRL	95131
Pipette Tips	ABDOS	P10102
Sodium Carbonate	SRL	89382
Sodium Nitrate	SRL	44618
Sodium Phosphate Dibasic (anhydrous)	SRL	53046
Sodium Phosphate Monobasic (anhydrous)	SRL	22249
Sulphanilic Acid	SRL	15354