Demonstration des Membrantransports von Histidin unter Verwendung von invertierten Beuteln aus dem Ziegendarm: Ein erfahrungspädagogisches Werkzeug für Studenten

Zusammenfassung

In dieser Arbeit berichten wir über eine kostengünstige und reproduzierbare Methode, die den Membrantransport von Histidin in einem Ziegendarm demonstriert. Dieser Prozess erfolgt durch den Co-Transport von Histidin- und Natriumionen, die durch den Natriumgradienten durch die Enterozytenmembran ermöglicht werden. Diese Methode nutzt die erfahrungsbasierte Lernpädagogik, um die Bewegung gelöster Stoffe durch biologische Membranen besser zu verstehen.

Zusammenfassung

Histidin ist eine essentielle Aminosäure, die auch eine Vorstufe für Metaboliten ist, die am Immunsystem, der Lungenventilation und der Gefäßzirkulation beteiligt sind. Die Resorption von Histidin aus der Nahrung beruht weitgehend auf dem Natrium-gekoppelten neutralen Aminosäuretransport durch den breiten neutralen Aminosäuretransporter (B⁰AT), der auf der apikalen Membran des Enterozyten vorhanden ist. Hier zeigen wir die Resorption von Histidin durch die Darmzottenzotten aus dem Lumen mit Hilfe von Ziegenjejunal-Umkehrsäcken. Die Jejunalsäcke, die unterschiedlichen Konzentrationen von Natrium und Histidin ausgesetzt waren, wurden untersucht, um die Konzentration von Histidin in den Säcken als Funktion der Zeit zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigen eine aktive Histidinresorption. Eine Erhöhung der Salzkonzentration führte zu einer höheren Resorption von Histidin, was auf ein Symport der Natrium- und Histidinabsorption in invertierten Ziegendarmsäcken hindeutet. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um die intestinale Mobilität von Aminosäuren oder anderen Metaboliten mit entsprechenden Modifikationen sichtbar zu machen. Wir schlagen dieses Experiment als erfahrungspädagogisches Werkzeug vor, das Studenten im Grundstudium helfen kann, das Konzept des Membrantransports zu verstehen.

Einleitung

Biologische Zellen sind von einer Membran-Lipid-Doppelschicht umgeben, die das intrazelluläre Zytosol vom extrazellulären Inhalt trennt. Die Membran dient als semipermeable Barriere, die die Bewegung der gelösten Stoffe¹ reguliert. Der Transport durch biologische Membranen wird durch den Permeabilitätskoeffizienten eines gelösten Stoffes beeinflusst, der von mehreren Faktoren abhängt, einschließlich der Konzentration und Ladung des gelösten Stoffes. Im Allgemeinen bewegen sich gelöste Stoffe durch die Membran mit drei Mechanismen (Abbildung 1): Passive Diffusion, erleichterte Diffusion und aktiver Transport². Einfache Diffusion ist der Prozess, bei dem lösliche, ungeladene und unpolare gelöste Stoffe ihren Konzentrationsgradienten durch eine semipermeable Membran passieren (Abbildung 1A). Membranproteine unterstützen diesen Prozess nicht, da er die Bewegung von gelösten Stoffen von einem Bereich höherer Konzentration in einen Bereich mit niedrigerer Konzentration beinhaltet. Die Diffusionsrate basiert auf dem Fickschen Gesetz³. Auf der anderen Seite ist die erleichterte Diffusion ein proteinabhängiger Transport, bei dem die Membran nur selektive gelöste Stoffe ohne Energieaufwand entlang eines Konzentrationsgradienten passieren lässt (Abbildung 1B). Diese Art des Transports ist spezifisch und unterscheidet sich von der einfachen Diffusion durch die Sättigungskinetik.

Aktiver Transport ist ein proteinabhängiger Transport von Molekülen gegen ihren Konzentrationsgradienten, d.h. vom Bereich niedrigerer Konzentration in einen Bereich höherer Konzentration unter Verwendung von ATP- oder Ionengradienten (Abbildung 1C). Wenn der Transporter ATP hydrolysiert, wird der Transport als primärer aktiver Transport bezeichnet (Abbildung 1C; linkes Bild). Eine andere Form des aktiven Transports ist der sekundäre aktive Transport (Abbildung 1C; rechtes Bild). Beim sekundären aktiven Transport werden gelöste Stoffe auf der Grundlage eines elektrochemischen Gradienten bewegt. Sie findet statt, wenn ein Transporterprotein die Bewegung eines Ions (typischerweise Na⁺) entlang seines Konzentrationsgradienten mit der Bewegung eines anderen Moleküls oder eines Ions gegen seinen Konzentrationsgradienten koppelt. Diese Art der Bewegung des gelösten Stoffes kann ein Mittransport (Symport) sein, bei dem sich sowohl der gelöste Stoff als auch das Ion in die gleiche Richtung bewegen, oder ein Austausch (Antiport), in welchem Fall sich der gelöste Stoff und das Ion in entgegengesetzte Richtungen bewegen.

Die Aminosäuren und Monosaccharide aus der Nahrung werden im Dünndarm aufgenommen. Der Dünndarm kann funktionell in drei Segmente unterteilt werden: Duodenum, Jejunum und Ileum (Abbildung 2). Die Resorption des gelösten Stoffes erfolgt im gesamten Dünndarm, wobei die maximale Resorption am Jejunum und am proximalen Ende des Ileums erfolgt. Die intestinalen Enterozyten sind polarisierte Zellen, und die Tight Junctions, die zwei benachbarte Zellen verbinden, bilden zwei unterschiedliche Membranstellen - die basolaterale und die apikale Membranstelle (Abbildung 2). Die Resorption von luminalen gelösten Stoffen, die durch den Aufschluss erzeugt werden, erfolgt an der apikalen Membranstelle⁴.

Der Histidintransport in den intestinalen Enterozyten an der apikalen Membran ist ein Beispiel für einen sekundären aktiven Symport, der natriumabhängig ist. Am basolateralen Ende bewegt sich das Histidin, das in den Enterozyten eintritt, über den Konzentrationsgradienten in den hepatischen Pfortaderkreislauf. Die intrazellulären Natriumkonzentrationen in den Enterozyten werden bei 12 mmole/L¹ gehalten, was niedriger ist als die extrazellulären/luminalen Konzentrationen, was auf das aktive Pumpen von Natrium aus der Zelle durch Na⁺ K⁺ATPase auf der basolateralen Membran zurückzuführen ist (Abbildung 3). An der apikalen Membran von Enterozyten sind das B⁰AT und der natriumneutrale Aminosäuretransporter (SNAT) 5 die Haupttransporter, die nicht nur Histidin, sondern auch Aminosäuren wie Asparagin und Glutamin in einem natriumabhängigen Cotransport transportieren ^5,6. Ein weiteres Transportprotein namens Large Amino Acid Transporter (LAT)1, das an der basolateralen Membran von Enterozyten vorhanden ist, transportiert große neutrale Aminosäuren wie Leucin, Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin über die Membran⁷.

Mit dem Ziel, das Konzept des Membrantransports in Kombination mit Techniken wie Spektrophotometrie und routinemäßigen biochemischen Assays durch erfahrungsorientierte Lernpädagogik zu lehren, ist es unerlässlich, Methoden zu entwickeln, die nicht nur das Konzept in leicht verständlichen Begriffen demonstrieren, sondern auch partizipatives Lernen für Studenten im Grundstudium ermöglichen. Derzeit stehen den Studierenden nur begrenzte Ressourcen für das praktische Engagement zum Erlernen solcher Konzepte der Biochemie zur Verfügung. Hier berichten wir über ein einfaches Protokoll zum Nachweis des Histidintransports durch die Darmmembran von Ziegen, das in Laboratorien leicht zu reproduzieren ist und auch für die Bewertung des Transports anderer Metaboliten angepasst werden kann. Noch wichtiger ist, dass bei der Methode kostengünstige Materialien in einem Labor für Studenten verwendet werden, wodurch erfahrungsorientiertes Lernen selbst in den einfachsten Laborumgebungen ermöglicht wird.

Protokoll

Das gesamte Protokoll mit allen Schritten ist in Abbildung 4 schematisch dargestellt. Die Methode ist eine Adaption einer früheren Studie mit Rattentärmen⁸. Das Experiment wurde in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchgeführt. Die in dieser Studie verwendeten Proben wurden von einem kommerziellen Anbieter beschafft.

ACHTUNG: Tragen Sie während dieses Experiments Handschuhe.

1. Zubereitung von umgekehrten Jejunumsäcken

1. Ziegenjejunum vorbehandeln und reinigen.
   1. Besorge dir die Eingeweide einer frisch geopferten, gesunden Ziege von einem lizenzierten Händler.
   2. Legen Sie die Eingeweide in ausreichend 1x Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS), so dass sie zur Reinigung vollständig eingetaucht sind.
   3. Trennen Sie den Dünndarm vom Dickdarm und achten Sie darauf, dass das äußere Bindegewebe mit einer Schere entfernt wird.
   4. Spülen Sie den Dünndarm vorsichtig mit 1x PBS mit einer 10-ml-Spritze und stellen Sie sicher, dass unverdautes Nahrungsmaterial entfernt wird, um einen hohlen Dünndarmbeutel zu erhalten. Wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens dreimal, um eine effektive Reinigung zu erzielen.
      HINWEIS: Vermeiden Sie beim Spülen den Einsatz von übermäßiger Kraft oder Nadeln. Durch die Anwendung von Gewalt kann es zum Durchstechen der Darmwände kommen und somit die Darmenterozyten geschädigt werden.
   5. Messen Sie die gesamte Länge des Dünndarms mit einem Lineal, um die drei Teile zu erhalten: Zwölffingerdarm (1/^{4 des} Dünndarms) und den Rest gleichmäßig aufgeteilt in Jejunum und Ileum.
   6. Fahren Sie mit dem Experiment mit dem Jejunum-Teil fort.
2. Bereiten Sie invertiertes Jejunum vor.
   1. Reinigen Sie den Jejunumteil, indem Sie das gesamte Bindegewebe mit einer Klinge entfernen.
   2. Das Jejunum in 12-15 cm lange Portionen schneiden, mit 1x PBS waschen und in eine PBS-haltige Petrischale geben.
   3. Drehen Sie die Jejunumteile mit einem Glasstab um, damit der Zottenteil nach außen freigelegt werden kann.
      ACHTUNG: Vermeiden Sie die Verwendung eines Glasstabes mit scharfen Kanten. Außerdem sollte der Durchmesser des Glasstabes nicht größer sein als der Durchmesser des Sacks.
      HINWEIS: An dieser Stelle kann man die Zotten unter einem Lichtmikroskop sichtbar machen (Abbildung 4).
   4. Spülen Sie die umgedrehten Jejunum-Portionen vorsichtig mit 1x PBS aus.
   5. Überprüfe, ob die Seiten des umgekehrten Jejunums undicht sind.
   6. Die umgedrehten Jejunum-Portionen in 5 cm lange Beutel schneiden.
   7. Binden Sie ein Ende mit Bindfaden zusammen und prüfen Sie erneut auf sichtbare Undichtigkeiten am gebundenen Ende, indem Sie die Säcke mit PBS füllen.
   8. Binden Sie das andere Ende zusammen, um einen leeren umgekehrten Sack mit Zotten auf der Außenfläche zu erhalten.
   9. Überprüfen Sie erneut auf externe Undichtigkeiten, indem Sie den umgekehrten Sack auf das Filterpapier klopfen.
3. Äquilibrieren Sie die umgekehrten Säcke in 1x PBS.
   1. Setzen Sie das Experiment am selben Tag fort oder lagern Sie die Säcke über Nacht in 1x PBS bei 4 °C.

2. Versuchsaufbau für den Histidintransport

1. Zwei Sätze von drei 50-ml-Röhrchen werden entsprechend den in Tabelle 1 angegebenen unterschiedlichen Konzentrationen von Natriumchlorid zusammengebaut.
2. Tauchen Sie die vorbereiteten Darmsäckchen für 30 min und 60 min für jedes der Sets in die angegebenen Röhrchen.
3. Entleeren Sie nach der angegebenen Zeit die Lösung im Sack in ein separates 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und bestimmen Sie das Volumen.
4. Aspirieren Sie die Flüssigkeit im Beutel mit einer 2-ml-Spritze. Alternativ können Sie ein Ende des Sacks lösen und den Inhalt in einem frischen 1,5-ml-Röhrchen auffangen.
5. Untersuchen Sie 0,1 mL der gesammelten Proben für die Histidinschätzung und berechnen Sie die Konzentration anhand des Standarddiagramms.

3. Schätzung von Histidin anhand der Pauly-Reaktion

1. Bereiten Sie eine Standardkurve für Histidin vor.
   1. Lösungen mit unterschiedlichen Histidinkonzentrationen, wie in Tabelle 2 angegeben, unter Verwendung von Stammlösungen von Histidin (5 mM) und Wasser herstellen.
   2. Sulfanilsäure (0,5 ml) und Natriumnitrat (0,5 ml) in jedes Röhrchen geben.
   3. Inkubieren Sie die Röhrchen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur und geben Sie dann jeweils 1 ml Natriumcarbonat und Ethanol in jedes Röhrchen.
   4. Inkubieren Sie die Röhrchen 20 min lang bei Raumtemperatur (~20 °C) und notieren Sie die Extinktion bei einer Wellenlänge von 490 nm.
   5. Zeichnen Sie eine Standardkurve der Absorption im Vergleich zur Histidinkonzentration.
      HINWEIS: Dieser Test auf Histidin basiert auf der Eigenschaft von Histidin, eine Diazoverbindung zu bilden (Abbildung 5).

Ergebnisse

Der experimentelle Arbeitsablauf zum Nachweis der intestinalen Mobilität von Histidin durch Absorption von Histidin durch Darmzotten in das Lumen der Umkehrsäcke ist in Abbildung 4, Tabelle 1 und Tabelle 2 dargestellt. Es wurden drei unabhängige Versuchsanordnungen durchgeführt, und repräsentative Daten sind in Abbildung 6 dargestellt.

Unter den gegebenen experim...

Diskussion

Der Membrantransport ist eines der grundlegendsten Konzepte, das Studenten aller wichtigen Disziplinen der Biowissenschaften gelehrt wird, ob grundlegend oder angewandt. Traditionell wurde die Bewegung durch Membranen mit Hilfe von Metaboliten visualisiert, die mit radioaktiven Isotopen markiert waren. Diese Methoden sind jedoch äußerst gefährlich und für das Lehren oder Lernen nicht praktikabel. Während erfahrungsbasiertes Lernen die beste pädagogische Technik ist, um solch komple...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	TARSONS	500020
10 mL Test Tubes	BOROSIL	9800U04
50 mL Sterile Falcon Tubes	TARSONS	546041
500 mL Beaker	BOROSIL	10044977
500 mL Conical Flask	BOROSIL	691467
D-Glucose	SRL	42738
Digital Spectrophotometer	SYSTRONICS	2710
Ethanol	EMSURE	1009831000
Finpipettes	THERMOFISHER	4642090
Glass Stirrer Rod	BOROSIL	9850107
L-Histidine	SRL	17849
NaCl	SRL	41721
Nitrile Gloves	KIMTECH	112-4847
Petri Dish	TARSONS	460090
Phosphate Buffered Saline (ph 7.4)	SRL	95131
Pipette Tips	ABDOS	P10102
Sodium Carbonate	SRL	89382
Sodium Nitrate	SRL	44618
Sodium Phosphate Dibasic (anhydrous)	SRL	53046
Sodium Phosphate Monobasic (anhydrous)	SRL	22249
Sulphanilic Acid	SRL	15354