בידוד ורישום Patch-Clamp של תא שלם של מיקרוגליה בהיפוקמפוס מעכברים בוגרים

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד לבודד ולטהר מיקרוגליה ראשונית בהיפוקמפוס מעכברים בוגרים, ואחריו הוראות לביצוע הקלטות טלאי-מהדק של תאים שלמים על תאים מבודדים אלה באופן חריף.

Abstract

מיקרוגליה הם תאים חיסוניים במוח שמקיימים אינטראקציה עם נוירונים כדי לשמור על ההומאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית (CNS). מחקרים מראים כי פני השטח של המיקרוגליה מבטאים תעלות אשלגן המווסתות את הפעלת המיקרוגליה, בעוד שחריגות בתעלות האשלגן הללו עלולות להוביל למחלות עצביות. נכון לעכשיו, רישומי טלאי-מהדק של תאים שלמים של מיקרוגליה מבוצעות בעיקר על מיקרוגליה ראשונית מתורבתת מעכברים עובריים או שזה עתה נולדו עקב קשיים בביצוע הערכות אלקטרופיזיולוגיות על מיקרוגליה מבודדת חריפה. מחקר זה מציג פרוטוקול קל לביצוע לבידוד מיקרוגליה בהיפוקמפוס מעכברים בוגרים וביצוע הקלטות של מהדק טלאי תאים שלמים על התאים המבודדים. בקצרה, המוח הוסר מעכבר לאחר עריפת ראש, ההיפוקמפוס נותח דו-צדדי, ומיקרוגליה בודדה באמצעות ערכת דיסוציאציה של מוח עכבר בוגר. לאחר מכן טוהרו המיקרוגליה בשיטת מיון תאים מופעל מגנטי (MACS) ונזרעו על כיסויים. בידוד מיקרוגליאלי מוצלח אושר על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית עם נוגדנים נגד CD11 ואנטי-Iba1. תלוש כיסוי הונח בתא הקלטה, וזרמי האשלגן של התא השלם של המיקרוגליה המבודדת באופן חריף נרשמו בתנאי מהדק מתח.

Introduction

מיקרוגליה, שמקורם באבות מיאלואידים בשק החלמון הפרימיטיבי, שוכנים במערכת העצבים המרכזית ומהווים כ-10% עד 15% מכלל תאי העצב ^1,2. מבחינה תפקודית, בנוסף למעקב אחר הסביבה המקומית, ביצוע פונקציות הגנה חיסונית ומתן תזונה ותמיכה לנוירונים ^3,4, מיקרוגליה יכולה גם ליצור קשר ישיר עם נוירונים כדי לווסת קולטני פני השטח העצביים וקשירת ליגנד מתאימה, ובעקיפין לקיים אינטראקציה עם נוירונים באמצעות הפרשת ציטוקינים⁵. מחקרים במבחנה וב-vivo הראו כי מיקרוגליה מבטאת סוגים שונים של תעלות אשלגן, התורמות לשמירה על פוטנציאל הממברנה השלילי⁶ ומווסתות את הפעלת המיקרוגליה. בהתחשב בכך שתעלות אשלגן מיקרוגליאליות חריגות נצפו במחלות מוח שונות⁷, חיוני לחוקרים לזהות תרופות פוטנציאליות המכוונות לתעלות אשלגן אלה ולפתח אסטרטגיות לוויסות תפקוד המיקרוגליה.

שיטות עיכול וטיהור מסורתיות למיקרוגליה משתמשות לעתים קרובות במוח כולו, המתעלם מההטרוגניות של מיקרוגליה על פני אזורי מוח שונים⁸. דיסוציאציה במבחנה ותרבית ארוכת טווח במדיה המכילה סרום ממקמים את המיקרוגליה במצב פעיל⁹, שאולי לא משקף במדויק את המאפיינים הפיזיולוגיים שלהם ואת מצבם האמיתי.

בנוסף, בעוד שזרמי אשלגן מיישרים כלפי חוץ תועדו במיקרוגליה ראשונית של יילודים ובקווי תאים¹⁰, נתונים מתרביות ארוכות טווח של רקמת מוח של עכבר עוברי או יילוד עשויים להיות שונים מאלה של מיקרוגליה בוגרת. הפרוטוקול הנוכחי נועד לבודד באופן חריף מיקרוגליה ולבצע באופן מיידי הקלטות של תאים שלמים של זרמי אשלגן מיקרוגליאלי באמצעות רקמת מוח של עכבר בוגר.

תכונות ביוכימיות ותעלות אשלגן נבדקו בשיטה המתאימה לבידוד וטיהור מיקרוגליה מרקמות קטנות 11,12,13,14,15. לכן, פרוטוקול זה מספק הנחיות לחוקרים להבהיר את התכונות הביוכימיות והתפקודיות של מיקרוגליה בתנאים פיזיולוגיים ומחלות. למרות שפרוטוקול זה משתמש בתעלות ההיפוקמפוס והאשלגן כדוגמאות, ניתן ליישם אותו גם לחקר אזורי מוח אחרים ותכונות אלקטרופיזיולוגיות של ערוץ/תא.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים במדעי החיים של אוניברסיטת דרום סין הרגילה, ונשמרו סטנדרטים מתאימים של רווחת בעלי חיים (אישור אתי: SCNU-SLS-2023-048). זכר או נקבה עכברי C57BL/6J בני 3-5 חודשים שימשו למחקר זה. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת פתרונות

1. הכן 50 מ"ל של תמיסה תוך-תאית המכילה 160 מ"מ של KF, 10 מ"מ של HEPES, 10 מ"מ של EGTA ו-2 מ"מ של MgCl₂. התאם את ה-pH ל-7.2 עם 1 M של תמיסת KOH, והתאם את הלחץ האוסמוטי ל-300 mOsm עם D-סוכרוז^13,16. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
2. הכן 50 מ"ל של מאגר מיון תאים מופעל מגנטי (MACS) המכיל 0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA) ו-2 מ"מ של חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) ב-PBS.
3. הכן פולי-L-ליזין (PLL) בדילול של 1:1000 במים.
   הערה: יש לצבוע את הכיסויים ב-PLL יום לפני הניסוי. דגרו על ההחלקות המצופות ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. מחזר PLL ביום השני וייבש את החלקות המצופות ב-37 מעלות צלזיוס.

2. הכנת תרחיף חד-תאי מרקמת המוח

1. להרדים את העכברים עם 2.5% כלורל הידרט (0.15 מ"ל/10 גרם, i.p.) (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). היעלמות רפלקס הקרנית ורפלקס הכאב על ידי צביטה של אצבעות הרגליים או צביטה של העור בעכברים מאשרים הרדמה עמוקה. הניחו את בעלי החיים שוכבים על שולחן ניתוח והצמידו את גפיהם.
   1. חשפו את בית החזה וחדרו את הלב¹⁷ עם PBS סטרילי קר כקרח כדי להסיר תאי דם במחזור הדם התוך-וסקולרי. החזיקו את הראש וחתכו את העור לאורך קו האמצע של המוח בעזרת מספריים כדי לחשוף את הגולגולת.
   2. חותכים את החלק האחורי של הגולגולת דו צדדית ובין ארובות העיניים בעזרת מספריים קטנים. חותכים את הגולגולת לאורך התפר הסגיטלי ומסירים את הגולגולת בעזרת פינצטה. חלץ את רקמת המוח במהירות בעזרת פינצטה¹⁷.
2. מניחים את רקמת המוח בכלי תרבית בגודל 10 ס"מ המכילים PBS קר כקרח. נתחו את קליפת המוח באופן דו-צדדי בעזרת פינצטה, בודדו את רקמת ההיפוקמפוס וחתכו אותה לחתיכות קטנות יותר. מעבירים את החלקים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
   הערה: דיסקציה דו-צדדית של קליפת המוח חושפת את סהר רקמת ההיפוקמפוס בשתי ההמיספרות של המוח.
3. השעו מחדש את החתיכות הקטנות של רקמת ההיפוקמפוס ב-2 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) וצנטריפוגה בטמפרטורה של 300 × גרם למשך 3 דקות (בטמפרטורת החדר), ואז השליכו את ה-HBSS.
4. הוסף 1950 מיקרוליטר של תערובת אנזימים 1 לצינור הצנטריפוגה של 15 מ"ל המכיל את חלקי רקמת ההיפוקמפוס. יש לנער את צינור הצנטריפוגה ברציפות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   הערה: תערובת אנזים 1 היא שילוב של 50 מיקרוליטר של אנזים P ומאגר Y של 1900 מיקרוליטר שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס (קיים כחלק מהערכה הזמינה מסחרית, ראה טבלת חומרים).
5. הסר את צינור הצנטריפוגה מאמבט המים. הוסף 30 מיקרוליטר של תערובת אנזימים טרייה שהוכנה 2 לצינור הצנטריפוגה של 15 מ"ל. פיפטה הרקמה מתפרקת למעלה ולמטה 20 פעמים עם קצה פיפטה של 1 מ"ל, ודוגרת באמבט מים למשך 5 דקות עם ניעור מתמשך ב-37 מעלות צלזיוס.
   הערה: תערובת אנזימים 2 היא שילוב של 20 מיקרוליטר של בופר Y ו-10 מיקרוליטר של אנזים A. שני שלבי העיכול לעיל הופכים את רקמת המוח לתרחיף תאי. זמן העיכול הכולל לא יעלה על 15 דקות.
6. הסר את צינור הצנטריפוגה ופיפטה את המתלה למעלה ולמטה מספר פעמים בעזרת פיפטה של 1 מ"ל עד שלא יישארו חתיכות רקמה גדולות.
7. סנן את מתלה התא דרך מסנן סינון תאים של 70 מיקרומטר ואסוף את המסנן בצינור צנטריפוגה נקי של 50 מ"ל.
   הערה: שלב זה מסיר חתיכות גדולות של רקמה לא מעוכלת.
8. מעבירים את המסנן לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 300 × גרם למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט עם פיפטה של 1 מ"ל.
9. שטפו את מתלה התא על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 20 פעמים עם 15 מ"ל HBSS, וצנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס, 300 × גרם למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט ו
   השעו מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של מאגר MACS.
   הערה: שלב זה מספק את המתלה החד-תאי המשמש בניסויים הבאים.

3. הפרדה חריפה של מיקרוגליה

1. העבירו 1 מ"ל מהמתלה החד-תאי לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל וצנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס, 300 × גרם למשך 3 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
2. השעו מחדש את הגלולה החד-תאית ב-90 מיקרוליטר של מאגר MACS. הוסף 10 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים CD11b/c ודגר את המתלה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות על שייקר אופקי.
3. הנח את עמודת המיון בשדה המגנטי של מפריד MACS מתאים והרטיב את העמודה פעמיים עם 500 מיקרוליטר של מאגר MACS.
4. שטפו את המתלה החד-תאי על ידי הוספת 1 מ"ל של מאגר MACS ישירות לצינור ולצנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס, 300 × גרם למשך 3 דקות. שאפו את הסופרנטנט לחלוטין.
5. השעו מחדש את גלולת התא ב-500 מיקרוליטר של מאגר MACS.
6. העבר את מתלה התא התלוי לעמודת המיון בשדה המגנטי באמצעות פיפטה של 1 מ"ל. השליכו את הזרימה. שטפו את העמודה שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר של מאגר MACS בזמן שהיא נשארת בשדה המגנטי.
   הערה: הזרימה מכילה תאים ללא תווית. יש לשטוף את העמוד מבלי להוציא אותו מהשדה המגנטי.
7. הסר את עמודת המיון מהשדה המגנטי. הוסף מאגר MACS של 1 מ"ל לעמודה ודחף אותו לאט לאט עם הבוכנה. אסוף את הזרימה.
   הערה: הזרימה מכילה את התאים המסומנים (כלומר, המיקרוגליה). כדי לשפר את טוהר המיקרוגליה, ניתן לחזור על התהליך באמצעות עמודת מיון חדשה (לא חובה).
8. זרע את התאים שנבחרו לצלחת של 24 בארות המכילה כיסוי מצופה PLL. הוסף 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית ודגירה למשך 20 דקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 95% O₂, 5% CO₂ ו-60%-80% לחות. שלב זה מאפשר למיקרוגליה להיצמד לכיסוי לניסויים הבאים של מהדק טלאי תא שלם ואימונופלואורסצנטי.

4. אימונופלואורסצנציה

1. שאפו את מדיום התרבות מבארות הצלחת ושטפו את התאים שלוש פעמים עם 0.1 M PBS על השייקר.
2. השליכו את ה-PBS וקבעו את המיקרוגליה על הכיסוי עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
3. הסר את הקיבוע ושטוף את החלקת הכיסוי שלוש פעמים עם 0.1 M PBS.
4. השליכו את ה-PBS וחודרו את התאים עם 200 מיקרוליטר של מאגר חוסם המכיל 0.2% טריטון X-100 ו-5% BSA ב-PBS למשך שעה אחת ב-RT על השייקר.
5. דגרו על המיקרוגליה עם חיץ חוסם בתוספת נוגדנים ראשוניים נגד Iba1 ואנטי-CD11b¹⁸ למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
6. למחרת, הסר את הנוגדנים העיקריים ושטוף את פתק הכיסוי שלוש פעמים עם PBS ב-RT על השייקר.
7. דגרו את המיקרוגליה עם המאגר החוסם המכיל נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור למשך שעתיים ב-RT. הוסיפו צבע DAPI למשך 15 הדקות האחרונות של הדגירה.
8. הסר את הנוגדנים המשניים ושטוף את תלוש הכיסוי שלוש פעמים עם PBS. הרכיבו את החלקות הכיסוי על שקופיות מיקרוסקופ להדמיה.

5. הקלטת תיקון-מהדק תא שלם של זרמי אשלגן במיקרוגליה

1. הפשירו את התמיסה התוך-תאית ושמרו אותה על קרח.
2. משוך פיפטות תיקון (אלקטרודות) מנימי זכוכית בורוסיליקט בעלי קירות דקים באמצעות מושך אנכי¹⁷.
   הערה: התנגדות האלקטרודה צריכה להיות פחות מ-10 MΩ.
3. העבירו כיסוי לתא ההקלטה והוסיפו את התמיסה החוץ-תאית המכילה 160 מ"מ של NaCl, 4.5 מ"מ של KCl, 2 מ"מ של CaCl₂, 1 מ"מ של MgCl₂ ו-10 מ"מ של HEPES. התאם את ה-pH ל-7.2 עם תמיסת 1 M NaOH לפני השימוש^ב-13,16, והתאם את הלחץ האוסמוטי ל-300 mOsm עם D-סוכרוז.
4. אתר את המיקרוגליה הכדורית מתחת למיקרוסקופ מים באמצעות המטרה 40x.
5. מלאו את האלקטרודה בתמיסה תוך-תאית, חברו אותה למגבר שלב הראש של מערך האלקטרופיזיולוגיה והפעילו לחץ חיובי. עבור למטרה 4x ואתר את האלקטרודה.
   1. הורד את האלקטרודה לתמיסת האמבטיה והגדר את המגבר למצב מהדק מתח כדי לבצע את בדיקת הממברנה במצב אמבטיה . חזור למטרה של פי 40 וקירב את קצה האלקטרודה למיקרוגליה.
      הערה: כאשר קצה האלקטרודה קרוב מאוד לתא מיקרוגליה, ההתנגדות צריכה לעלות מעט.
   2. הפעל לחץ שלילי זעיר כדי להחזיק את התא. כאשר ההתנגדות מגיעה ל -100 MΩ, עבור ממצב אמבטיה לתיקון במבחן הממברנה. כאשר ההתנגדות מגיעה ל -300 MΩ, שחרר את הלחץ השלילי.
   3. כאשר ההתנגדות מצביעה על היווצרות אטם ג'יגה-אוהם (כלומר, >1 GΩ) בין האלקטרודה לקרום המיקרוגליה, עבור ממצב תיקון לתא בבדיקת הממברנה.
6. החל כמות קטנה של יניקה ויזום התחשמלות כדי לקרוע את הממברנה. הופעתם של ארעיים קיבוליים גדולים מעידה על קרע מוצלח בקרום.
7. עבור למתח-clamp מצב ופתח את תוכנית ההקלטה. רשום זרמי אשלגן למשך 200 אלפיות השנייה. כדי לבדוק פוטנציאלים, החל שלבי מתח במרווחים של 20 mV מ-120 mV עד +40 mV ב-1 הרץ.
8. נתח את הנתונים שהתקבלו במצב לא מקוון באמצעות תוכנה מתאימה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בקצרה, התהליך כולל בידוד של מיקרוגליה בהיפוקמפוס ממוח העכבר הבוגר ואחריו רישום של תאים אלה על ידי תאים שלמים (איור 1). ההליך מתחיל בניתוח ההיפוקמפוס של עכברים בוגרים בני 3 עד 5 חודשים C57BL/6J. באופן ספציפי, המוח כולו מוסר אחרי הזלוף ומונח בצלחת תרבית שמכילה PBS ק...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מיקרוגליה מתורבתת מעכברים עובריים או שזה עתה נולדו אינה מתאימה בבירור לחקר מיקרוגליה בוגרים. בנוסף, בהתחשב בהטרוגניות של מיקרוגליה על פני אזורי מוח שונים²¹, מיקרוגליה המבודדת מכל המוח עשויה שלא לייצג במדויק את המאפיינים של מיקרוגליה במבנה מוח ספציפי. פרוטו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Corning	353003
15 mL Falcon tubes	BD	352096
24-well plates	BD	353047
35 mm Petri dish	Corning	353001	-
50 mL Falcon tubes	BD	352070
70 μm cell screening	Miltenyi	130-095-823	To remove cell clumps before cell sorting
Adult Mouse Brain Dissociation Kit	Miltenyi	130- 107-677
Anti-CD11b Antibody	Bio-Rad	MCA74	Goat Anti-mouse IgG also available. For blocking endogenous immunoglobulins.
Anti-Iba 1 Antibody	SYSY	234308	Goat Anti-guinea pig IgG) also available. For blocking endogenous immunoglobulins.
Axon Digidata 1440A	USA
Axon MultiClamp 700B Amplifier	USA
BSA Albumin Fraction V	BioFrox	4240GR500	Serum
C57BL/6 mice	Guangdong Medical Laboratory Animal Center
CD11 b/c MicroBeads	Miltenyi	130-105-634
Chloral hydrate	Absin	abs47051394	Widely used as anesthesia in mice
Clampfit 10.6	USA
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 800
Culture medium	Fisher Scientific	C11995500BT	-
DAPI dye	Beyotime	C1002
Electrode puller	Narishige	PC-10
HBSS	Servicebio	G4203
Horizontal shaker	SCILOGEX	SLK-O3000-S
Image analysis software	Fiji
MACS Columns	Miltenyi	130-042-201
MACS Separators	Miltenyi	130-042-102
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	T353-500	Use fresh 4% solution in 1X PBS, pH 7.2-7.4.
Poly-L-lysine	Beyotime	C0313	Coverslip coating
Triton X-100	Sigma	X100