JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящем протоколе описывается, как изолировать и очищать первичную микроглию гиппокампа у взрослых мышей, а также даются инструкции по проведению записи патч-зажима целых клеток на этих остро изолированных клетках.

Аннотация

Микроглия — это резидентные иммунные клетки в головном мозге, которые взаимодействуют с нейронами для поддержания гомеостаза центральной нервной системы (ЦНС). Исследования показывают, что поверхность микроглии экспрессирует калиевые каналы, которые регулируют активацию микроглии, в то время как аномалии в этих калиевых каналах могут привести к нервным заболеваниям. В настоящее время запись микроглии с помощью целых клеток в основном выполняется на культивируемой первичной микроглии плода или новорожденных мышей из-за трудностей в проведении электрофизиологических оценок остро изолированной микроглии. В этом исследовании представлен простой в использовании протокол для выделения микроглии гиппокампа от взрослых мышей и выполнения записей целых клеток на изолированных клетках. Вкратце, мозг был удален у мыши после обезглавливания, гиппокамп был рассечен с обеих сторон, а микроглия была изолирована с помощью набора для диссоциации мозга взрослой мыши. Затем микроглии очищали с помощью метода магнитно-активируемой сортировки клеток (MACS) и высевали на покровные стекла. Успешное выделение микроглии было подтверждено иммунофлуоресцентным окрашиванием антителами к CD11 и анти-Iba1. Покровное стекло помещали в регистрирующую камеру, и целые клеточные калийные токи остро изолированной микроглии регистрировались в условиях напряжения-зажима.

Введение

Микроглии, которые происходят от миелоидных предшественников в примитивном желточном мешке, являются резидентами ЦНС и составляют от 10% до 15% от общего числанервных клеток1,2. Функционально, в дополнение к наблюдению за окружающей средой, выполнению функций иммунной защиты и обеспечению питания и поддержки нейронов 3,4, микроглия также может напрямую контактировать с нейронами для регулирования рецепторов нейронной поверхности и связывания соответствующих лигандов, а также косвенно взаимодействовать с нейронами через секрецию цитокинов5. Исследования in vitro и in vivo показали, что микроглия экспрессирует различные типы калиевых каналов, которые способствуют поддержанию отрицательного мембранногопотенциала6 и регулируют активацию микроглии. Учитывая, что аномальные калиевые каналы микроглии наблюдаются при различных заболеваниях головного мозга7, для исследователей крайне важно определить потенциальные препараты, нацеленные на эти калиевые каналы, и разработать стратегии для регулирования функции микроглии.

Традиционные методы пищеварения и очистки от микроглии часто задействуют весь мозг, что упускает из виду гетерогенность микроглии в различных областях мозга8. Диссоциация in vitro и длительное культивирование в сывороткосодержащих средах переводят микроглию вактивное состояние9, которое может неточно отражать их физиологические характеристики и истинное состояние.

Кроме того, в то время как внешние выпрямляющие токи калия были зарегистрированы в первичной культивируемой микроглии новорожденных и клеточных линиях10, данные долгосрочных культур ткани мозга плода или новорожденной мыши могут отличаться от таковых у зрелой микроглии. Данный протокол направлен на острую изоляцию микроглии и немедленное выполнение полноклеточной регистрации токов калия в микроглии с использованием ткани мозга взрослой мыши.

Биохимические свойства и свойства калиевых каналов исследовали с помощью метода, пригодного для выделения и очистки микроглии из мелких тканей 11,12,13,14,15. Таким образом, данный протокол предоставляет исследователям рекомендации по выяснению биохимических и функциональных свойств микроглии в физиологических и патологических условиях. Хотя в этом протоколе в качестве примеров используются гиппокамп и калиевые каналы, он также может быть применен для изучения других областей мозга и электрофизиологических свойств каналов/клеток.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в области наук о жизни Южно-Китайского педагогического университета, и были соблюдены соответствующие стандарты благополучия животных (этическое одобрение: SCNU-SLS-2023-048). Для исследования были использованы самцы или самки 3-5-месячных мышей C57BL/6J. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Приготовление растворов

  1. Приготовьте 50 мл внутриклеточного раствора, содержащего 160 мМ KF, 10 мМ HEPES, 10 мМ EGTA и 2 мМ MgCl2. Отрегулируйте pH до 7,2 с помощью 1 М раствора KOH, а осмотическое давление отрегулируйте до 300 мОм с D-сахарозой13,16. Хранить при температуре -20 °C.
  2. Приготовьте 50 мл магнитно-активируемого буфера для сортировки клеток (MACS), содержащего 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в PBS.
  3. Приготовьте поли-L-лизин (ФАПЧ) в разведении 1:1000 в воде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Покровные стекла должны быть покрыты ФАПЧ за день до эксперимента. Инкубируйте слипы с покрытием при температуре 37 °C в течение ночи. Утилизируйте ФАПЧ на второй день и высушите шликеры с покрытием при температуре 37 °C.

2. Приготовление одноклеточной суспензии из ткани мозга

  1. Обезболите мышей 2,5% хлоралгидратом (0,15 мл/10 г, в/в) (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Исчезновение роговичного рефлекса и болевого рефлекса при защемлении пальцев ног или защемлении кожи у мышей подтверждает глубокая анестезия. Положите животных лежа на спину на препарирующий стол и приколите их конечности.
    1. Обнажите грудную клетку и перфузируйте сердце17 с помощью ледяного стерильного PBS для удаления внутрисосудистых циркулирующих клеток крови. Возьмитесь за голову и разрежьте ножницами кожу по средней линии мозга, чтобы обнажить череп.
    2. Разрежьте заднюю часть черепа с двух сторон и между глазницами маленькими ножницами. Разрежьте череп по сагиттальному шву и удалите череп пинцетом. Быстрое извлечение мозговой ткани с помощью пинцета17.
  2. Поместите мозговую ткань в 10-сантиметровые питательные чашки, содержащие ледяной PBS. Рассеките кору головного мозга с двух сторон с помощью пинцета, изолируйте ткань гиппокампа и разрежьте ее на более мелкие кусочки. Переложите кусочки в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Двусторонняя диссекция коры головного мозга выявляет серп ткани гиппокампа в обоих полушариях мозга.
  3. Ресуспендируйте небольшие кусочки ткани гиппокампа в 2 мл ледяного сбалансированного раствора соли Хэнка (HBSS) и центрифугируйте при 300 × г в течение 3 минут (при комнатной температуре), затем выбросьте HBSS.
  4. Добавьте 1950 мкл смеси ферментов 1 в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую кусочки ткани гиппокампа. Непрерывно встряхивайте центрифужную трубку на водяной бане при температуре 37 °C в течение 5 минут.
    Смесь ферментов 1 представляет собой комбинацию 50 мкл фермента P и 1900 мкл буфера Y, предварительно нагретых до 37 °C (входит в состав коммерчески доступного набора, см. Таблицу материалов).
  5. Снимите пробирку центрифуги с водяной бани. Добавьте 30 мкл свежеприготовленной ферментной смеси 2 в 15 мл центрифужной пробирки. Пипеткой 20 раз вверх и вниз с помощью наконечника пипетки объемом 1 мл и инкубируйте на водяной бане в течение 5 минут при непрерывном встряхивании при температуре 37°C.
    Смесь ферментов 2 представляет собой комбинацию 20 мкл буфера Y и 10 мкл фермента А. Вышеупомянутые два этапа пищеварения превращают мозговую ткань в клеточную суспензию. Общее время разложения не должно превышать 15 минут.
  6. Извлеките пробирку центрифуги и несколько раз введите пипетку вверх и вниз с помощью пипетки объемом 1 мл до тех пор, пока не останутся крупные кусочки ткани.
  7. Отфильтруйте клеточную суспензию через фильтр для фильтрации клеток 70 μм и соберите фильтрат в чистую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе удаляются большие куски непереваренной ткани.
  8. Переложите фильтрат в новую центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при температуре 4 °C, 300 × г в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1 мл.
  9. Промойте клеточную суспензию пипетированием вверх и вниз 20 раз 15 мл HBSS и центрифугируйте при 4 °C, 300 × г в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и
    ресуспендировать клеточную таблетку в 1 мл буфера MACS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе обеспечивается получение суспензии одиночных клеток, используемой в последующих экспериментах.

3. Острое отделение микроглии

  1. Перелейте 1 мл суспензии одиночных клеток в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл и центрифугируйте при 4 °C, 300 × г в течение 3 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
  2. Ресуспендируйте одноклеточную гранулу в 90 мкл буфера MACS. Добавьте 10 мкл микрогранул CD11b/c и инкубируйте суспензию при 4 °C в течение 15 мин на горизонтальном шейкере.
  3. Поместите сортировочную колонну в магнитное поле подходящего сепаратора MACS и дважды увлажните колонку 500 μL буфера MACS.
  4. Промойте одноклеточную суспензию, добавив 1 мл буфера MACS непосредственно в пробирку, и центрифугируйте при 4 °C, 300 × г в течение 3 минут. Полностью аспирируйте надосадочную жидкость.
  5. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 500 мкл буфера MACS.
  6. Перенесите ресуспендированную суспензию клеток в сортировочную колонну в магнитном поле с помощью пипетки объемом 1 мл. Откажитесь от проточного потока. Трижды промойте колонку 500 мкл буфера MACS, пока он остается в магнитном поле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сквозной канал содержит непомеченные ячейки. Колонку следует промывать, не удаляя ее из магнитного поля.
  7. Извлеките сортировочную колонну из магнитного поля. Добавьте в колонку 1 мл буфера MACS и медленно протолкните его поршнем. Соберите протекание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проточный канал содержит меченые клетки (т.е. микроглию). Чтобы улучшить чистоту микроглии, процесс можно повторить с новой сортировочной колонной (опционально).
  8. Засейте выбранные клетки в 24-луночный планшет, содержащий покровное стекло, покрытое ФАПЧ. Добавьте 200 μл питательной среды и инкубируйте в течение 20 минут в инкубаторе при температуре 37 °C с 95%O2, 5%CO2 и влажностью 60%-80%. Этот этап позволяет микроглии прикрепиться к покровному стеклу для последующих экспериментов с цельноклеточным патч-хомпом и иммунофлуоресценцией.

4. Иммунофлюоресценция

  1. Отсадите питательную среду из лунок планшета и трижды промойте клетки 0,1 М PBS на шейкере.
  2. Выбросьте PBS и зафиксируйте микроглию на покровном листе 4% параформальдегидом (PFA) на 20 минут при комнатной температуре (RT).
  3. Снимите фиксатор и трижды промойте крышку крышки 0,1 М PBS.
  4. Отбросьте PBS и пропитайте клетки 200 μL блокирующим буфером, содержащим 0,2% Triton X-100 и 5% BSA в PBS в течение 1 ч при RT на шейкере.
  5. Инкубируйте микроглию с блокирующим буфером плюс первичные антитела против Iba1 и CD11b18 в течение ночи при 4 °C.
  6. На следующий день удалите первичные антитела и трижды промойте крышку с PBS at RT на шейкере.
  7. Инкубировать микроглию с блокирующим буфером, содержащим вторичные антитела, связанные с флуорофорами, в течение 2 ч при РТ. Добавить краситель DAPI на последние 15 мин инкубации.
  8. Удалите вторичные антитела и трижды промойте крышку PBS. Закрепите защитные стекла на предметных стеклах микроскопа для визуализации.

5. Запись токов калия в микроглии с помощью целого клеточного патч-клэмпа

  1. Разморозьте внутриклеточный раствор и держите его на льду.
  2. Вытягивают патч-пипетки (электроды) из тонкостенных капилляров из боросиликатного стекла с помощью вертикального съемника17.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сопротивление электродов должно быть менее 10 МОм.
  3. Перенесите покровную крышку в записывающую камеру и добавьте внеклеточный раствор, содержащий 160 мМ NaCl, 4,5 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2 и 10 мМ HEPES. Отрегулируйте pH до 7,2 с помощью 1 М раствора NaOH перед использованием13,16, а осмотическое давление отрегулируйте до 300 мОм с помощью D-сахарозы.
  4. Найдите сферическую микроглию под водяным микроскопом с помощью объектива 40x.
  5. Заполните электрод внутриклеточным раствором, прикрепите его к усилительному каскаду электрофизиологической установки и надавите положительным давлением. Переключитесь на объектив 4x и найдите электрод.
    1. Опустите электрод в раствор ванны и установите усилитель в режим зажима напряжения, чтобы выполнить испытание мембраны в режиме ванны . Переключитесь обратно на объектив 40x и переместите наконечник электрода ближе к микроглии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда кончик электрода находится очень близко к микроглиальной клетке, сопротивление должно немного увеличиться.
    2. Приложите крошечное отрицательное давление, чтобы удержать ячейку. Когда сопротивление достигнет 100 МОм, переключитесь из режима ванны в режим патча в мембранном тесте. Когда сопротивление достигнет 300 МОм, сбросьте отрицательное давление.
    3. Когда сопротивление указывает на образование гигаомного уплотнения (т. е. >1 ГОм) между электродом и микроглиальной мембраной, переключитесь с патчового на клеточный режим в мембранном тесте.
  6. Нанесите небольшое количество отсасывания и инициируйте удар электрическим током, чтобы разорвать мембрану. Появление больших емкостных переходных процессов свидетельствует об успешном разрыве мембраны.
  7. Переключитесь в режим напряжения-зажима и откройте программу записи. Запишите калийные токи в течение 200 мс. Для проверки потенциалов подайте ступенчатое напряжение с шагом 20 мВ от -120 мВ до +40 мВ при частоте 1 Гц.
  8. Анализируйте полученные данные в автономном режиме с помощью соответствующего программного обеспечения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Вкратце, процесс включает в себя выделение микроглии гиппокампа из мозга взрослой мыши с последующей записью этих клеток с помощью целых клеток (рис. 1). Процедура начинается с вскрытия гиппокампа взрослых мышей C57BL/6J в возрасте от 3 до 5 месяцев. В частно...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Культивируемая микроглия от плодных или новорожденных мышей явно непригодна для изучения микроглии взрослого человека. Кроме того, учитывая гетерогенность микроглии вразличных областях мозга, микроглия, выделенная из всего мозга, может неточно предста...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (32170950, 32371065), Фонда естественных наук провинции Гуандун, NoNo 2023A1515010899 и 2021A1515010804.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Petri dishCorning353003
15 mL Falcon tubesBD352096
24-well platesBD353047
35 mm Petri dishCorning353001-
50 mL Falcon tubesBD352070
70 μm cell screeningMiltenyi130-095-823To remove cell clumps before cell sorting
Adult Mouse Brain Dissociation KitMiltenyi130- 107-677
Anti-CD11b AntibodyBio-RadMCA74Goat Anti-mouse IgG also available. For blocking endogenous immunoglobulins.
Anti-Iba 1 AntibodySYSY234308Goat Anti-guinea pig IgG) also available. For blocking endogenous immunoglobulins.
Axon Digidata 1440AUSA
Axon MultiClamp 700B AmplifierUSA
BSA Albumin Fraction VBioFrox4240GR500Serum
C57BL/6 mice Guangdong Medical Laboratory Animal Center
CD11 b/c MicroBeadsMiltenyi130-105-634
Chloral hydrateAbsinabs47051394Widely used as anesthesia in mice
Clampfit 10.6USA
Confocal MicroscopeZeiss LSM 800
Culture mediumFisher ScientificC11995500BT-
DAPI dyeBeyotimeC1002
Electrode pullerNarishigePC-10
HBSSServicebioG4203
Horizontal shakerSCILOGEXSLK-O3000-S
Image analysis softwareFiji
MACS ColumnsMiltenyi130-042-201
MACS SeparatorsMiltenyi130-042-102
ParaformaldehydeFisher ScientificT353-500Use fresh 4% solution in 1X PBS, pH 7.2-7.4. 
Poly-L-lysineBeyotime C0313Coverslip coating
Triton X-100SigmaX100

Ссылки

  1. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8 (11), e1000527(2010).
  3. Voet, S., Prinz, M., Van Loo, G. Microglia in central nervous system inflammation and multiple sclerosis pathology. Trends Mol Med. 25 (2), 112-123 (2019).
  4. Salter, M. W., Beggs, S. Sublime microglia: Expanding roles for the guardians of the CNS. Cell. 158 (1), 15-24 (2014).
  5. Wohleb, E. S. Neuron-microglia interactions in mental health disorders: For better, and for worse. Front Immunol. 7, 544(2016).
  6. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratskya, A. Physiology of microglia. Physiol Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
  7. Sarkar, S. Microglial ion channels: Key players in non-cell autonomous neurodegeneration. Neurobiol Dis. 174, 105861(2022).
  8. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: Active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
  9. Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium. J Vis Exp. 133, e57122(2018).
  10. Lyons, S. A., et al. Distinct physiologic properties of microglia and blood-borne cells in rat brain slices after permanent middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 20 (11), 1537-1549 (2000).
  11. Li, Q., Lan, X., Han, X., Wang, J. Expression of tmem119/SALL1 and CCR2/CD69 in FACS-sorted microglia- and monocyte/macrophage-enriched cell populations after intracerebral hemorrhage. Front Cell Neurosci. 12, 520(2018).
  12. Sarkar, S., et al. Kv1.3 modulates neuroinflammation and neurodegeneration in Parkinson's disease. J Clin Invest. 130 (8), 4195-4212 (2020).
  13. Maezawa, I., et al. Kv1.3 inhibition as a potential microglia-targeted therapy for Alzheimer's disease: Preclinical proof of concept. Brain. 141 (2), 596-612 (2018).
  14. Delbridge, A. R. D., et al. Organotypic brain slice culture microglia exhibit molecular similarity to acutely isolated adult microglia and provide a platform to study neuroinflammation. Front Cell Neurosci. 14, 592005(2020).
  15. Volden, T. A., Reyelts, C. D., Hoke, T. A., Arikkath, J., Bonasera, S. J. Validation of flow cytometry and magnetic bead-based methods to enrich cns single cell suspensions for quiescent microglia. J Neuroimmune Pharmacol. 10 (4), 65-665 (2015).
  16. Wulff, H., et al. The voltage-gated kv1.3 k(+) channel in effector memory t cells as new target for ms. J Clin Invest. 111 (11), 1703-1713 (2003).
  17. Tan, S., et al. Biocytin-labeling in whole-cell recording: Electrophysiological and morphological properties of pyramidal neurons in CYLD-deficient mice. Molecules. 28 (10), 4092(2023).
  18. Manitz, M. P., et al. Flow cytometric characterization of microglia in the offspring of polyi:C treated mice. Brain Res. 1636, 172-182 (2016).
  19. Xu, Y. N., et al. A modified protocol of mouse hippocampal primary microglia culture by using manual dissociation, magnetic activated cell sorting and tic medium. Sheng Li Xue Bao. 71 (6), 883-893 (2019).
  20. Zelenka, L., et al. Novel protocol for the isolation of highly purified neonatal murine microglia and astrocytes. J Neurosci Methods. 366, 109420(2022).
  21. Keren-Shaul, H., et al. A unique microglia type associated with restricting development of alzheimer's disease. Cell. 169 (7), 1276-1290.e17 (2017).
  22. Yang, B., et al. Various cell populations within the mononuclear fraction of bone marrow contribute to the beneficial effects of autologous bone marrow cell therapy in a rodent stroke model. Transl Stroke Res. 7 (4), 322-330 (2016).
  23. Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
  24. Ramesha, S., Rayaprolu, S., Rangaraju, S. Flow cytometry approach to characterize phagocytic properties of acutely-isolated adult microglia and brain macrophages in vitro. J Vis Exp. 160, e61467(2020).
  25. Mccarthy, K. D., De Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  26. Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

MACSCD11Iba1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены