성체 마우스에서 해마 미세아교세포의 분리 및 전체 세포 패치-클램프 기록

요약

본 프로토콜은 성체 마우스에서 1차 해마 미세아교세포를 분리 및 정제하는 방법을 설명한 다음, 이러한 급성으로 분리된 세포에서 전체 세포 패치 클램프 기록을 수행하기 위한 지침을 설명합니다.

초록

미세아교세포(Microglia)는 중추신경계(CNS)의 항상성을 유지하기 위해 뉴런과 상호 작용하는 뇌에 상주하는 면역 세포입니다. 연구에 따르면 미세아교세포 표면은 미세아교세포 활성화를 조절하는 칼륨 채널을 발현하는 반면, 이러한 칼륨 채널의 이상은 신경 질환으로 이어질 수 있습니다. 현재 미세아교세포의 전세포 패치 클램프 기록은 급성 고립된 미세아교세포에 대한 전기생리학적 평가를 수행하는 데 어려움이 있기 때문에 태아 또는 신생아 마우스의 배양된 1차 미세아교세포에서 대부분 수행됩니다. 이 연구는 성체 마우스에서 해마 미세아교세포를 분리하고 분리된 세포에서 전체 세포 패치 클램프 기록을 수행하기 위한 따르기 쉬운 프로토콜을 소개합니다. 간단히 말해서, 참수 후 마우스에서 뇌를 제거하고, 해마를 양측으로 절개하고, 성체 마우스 뇌 해리 키트를 사용하여 미세아교세포를 분리했습니다. 그런 다음 미세아교세포를 MACS(magnetic-activated cell sorting) 방법을 사용하여 정제하고 커버슬립에 파종했습니다. 성공적인 미세아교세포 분리는 항-CD11 및 항-IBA1 항체를 사용한 면역형광 염색에 의해 확인되었습니다. 커버 슬립을 기록실에 넣고 급성으로 분리된 미세아교세포의 전체 세포 칼륨 전류를 전압 클램프 조건에서 기록했습니다.

서문

원시 난황낭의 골수성 전구 세포에서 유래한 미세아교세포는 중추신경계에 상주하며 전체 신경 세포의 약 10%에서 15%를 차지합니다 ^1,2. 기능적으로, 국소 환경을 감시하고, 면역 방어 기능을 수행하고, 뉴런에 영양을 공급하고 지원하는 것 외에도 ^3,4, 미세아교세포는 뉴런과 직접 접촉하여 뉴런 표면 수용체와 해당 리간드 결합을 조절할 수 있으며, 사이토카인 분비를 통해 뉴런과 간접적으로 상호 작용할 수 있습니다⁵. 시험관 내 및 생체 내 연구는 미세아교세포가 다양한 유형의 칼륨 채널을 발현한다는 것을 입증했으며, 이는 음성 막 전위⁶ 유지에 기여하고 미세아교세포 활성화를 조절합니다. 다양한 뇌 질환에서 비정상적인 미세아교세포 칼륨 채널이 관찰되었다는 점을 감안할 때⁷, 연구자들은 이러한 칼륨 채널을 표적으로 하는 잠재적 약물을 식별하고 미세아교세포 기능을 조절하기 위한 전략을 개발하는 것이 중요합니다.

미세아교세포에 대한 전통적인 소화 및 정제 방법은 종종 뇌 전체를 사용하는데, 이는 서로 다른 뇌 영역에 걸친 미세아교세포의 이질성을 간과합니다⁸. 혈청 함유 배지의 시험관 내 해리 및 장기 배양은 미세아교세포를 활성 상태⁹로 두는데, 이는 생리학적 특성과 실제 상태를 정확하게 반영하지 못할 수 있습니다.

또한, 외향 정류기 칼륨 전류는 1차 배양된 신생아 미세아교세포와 세포주에서 기록되었지만¹⁰, 태아 또는 신생아 마우스 뇌 조직의 장기 배양 데이터는 성숙한 미세아교세포의 데이터와 다를 수 있습니다. 본 프로토콜은 미세아교세포를 급성으로 분리하고 성체 마우스 뇌 조직을 사용하여 미세아교세포의 칼륨 전류에 대한 전체 세포 기록을 즉시 수행하는 것을 목표로 합니다.

생화학적 및 칼륨 채널 특성은 작은 조직 11,12,13,14,15에서 미세아교세포의 분리 및 정제에 적합한 방법을 사용하여 검사되었습니다. 따라서 이 프로토콜은 연구자가 생리학적 및 질병 조건에서 미세아교세포의 생화학적 및 기능적 특성을 규명할 수 있는 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 해마와 칼륨 채널을 예로 사용하지만, 다른 뇌 영역과 채널/세포 전기생리학적 특성에 대한 연구에도 적용할 수 있습니다.

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프로토콜

모든 실험은 화남사범대학교 생명과학 동물관리 및 이용위원회의 승인을 받았으며 적절한 동물복지 기준이 유지되었습니다(윤리적 승인: SCNU-SLS-2023-048). 이 연구에는 수컷 또는 암컷 3-5개월 된 C57BL/6J 마우스가 사용되었습니다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 솔루션 준비

1. 160mM의 KF, 10mM의 HEPES, 10mM의 EGTA 및 2mM의 MgCl₂를 포함하는 50mL의 세포 내 용액을 준비합니다. 1M의 KOH 용액으로 pH를 7.2로 조정하고 D-수크로오스^13,16으로 삼투압을 300mOsm으로 조정합니다. -20 °C에서 보관하십시오.
2. PBS에 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)과 2mM의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유한 50mL의 MACS(magnetic-activated cell sorting) 완충액을 준비합니다.
3. 폴리-L-라이신(PLL)을 물에 1:1000 희석하여 준비합니다.
   알림: 커버슬립은 실험 전날 PLL로 코팅해야 합니다. 코팅된 슬립을 37°C에서 밤새 배양합니다. 둘째 날에 PLL을 재활용하고 코팅된 슬립을 37°C에서 건조시킵니다.

2. 뇌 조직으로부터 단세포 현탁액의 준비

1. 2.5% 클로랄 수화물(0.15 mL/10 g, i.p.)로 마우스를 마취합니다. (기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 생쥐에서 발가락을 꼬집거나 피부를 꼬집음으로써 각막 반사와 통증 반사가 사라지는 것은 깊은 마취를 확인시켜줍니다. 동물들을 해부 테이블에 누운 상태로 놓고 팔다리를 고정합니다.
   1. 흉부를 노출시키고 심장¹⁷ 을 얼음처럼 차가운 멸균 PBS로 관류하여 혈관 내 순환 혈액 세포를 제거합니다. 머리를 잡고 가위로 뇌 정중선을 따라 피부를 잘라 두개골을 드러냅니다.
   2. 두개골 뒤쪽을 양측으로 자르고 작은 가위로 눈구멍 사이를 자릅니다. 시상 봉합선을 따라 두개골을 자르고 핀셋으로 두개골을 제거합니다. 핀셋으로 뇌 조직을 빠르게 추출하십시오¹⁷.
2. 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 10cm 배양 접시에 뇌 조직을 넣습니다. 핀셋으로 대뇌 피질을 양측으로 절개하고 해마 조직을 분리한 다음 더 작은 조각으로 자릅니다. 조각을 15mL 원심분리 튜브에 옮깁니다.
   참고: 대뇌 피질의 양측 박리는 뇌의 양쪽 반구에 있는 해마 조직의 초승달 모양을 보여줍니다.
3. 얼음처럼 차가운 행크 평형 염 용액(HBSS) 2mL와 300× g 의 원심분리기에 해마 조직의 작은 조각을 3분(실온에서) 재현탁한 다음 HBSS를 버립니다.
4. 해마 조직 조각이 들어 있는 15mL 원심분리 튜브에 1950μL의 효소 혼합물 1을 추가합니다. 원심분리기 튜브를 37°C 수조에서 5분 동안 계속 흔듭니다.
   참고: 효소 혼합물 1은 37°C로 예열된 50μL의 효소 P와 1900μL 버퍼 Y의 조합입니다(시판되는 키트의 일부로 존재, 재료 표 참조).
5. 수조에서 원심분리기 튜브를 제거합니다. 갓 준비한 효소 혼합물 2 30μL를 15mL 원심분리 튜브에 추가합니다. 1mL 피펫 팁으로 조직 조각을 위아래로 20회 피펫팅하고 37°C에서 연속 진탕하면서 5분 동안 수조에서 배양합니다.
   참고: 효소 혼합물 2는 20μL의 완충액 Y와 10μL의 효소 A의 조합입니다. 위의 두 가지 소화 단계는 뇌 조직을 세포 현탁액으로 전환합니다. 총 소화 시간은 15분을 초과해서는 안 됩니다.
6. 원심분리기 튜브를 제거하고 큰 조직 조각이 남지 않을 때까지 1mL 피펫으로 현탁액을 위아래로 여러 번 피펫팅합니다.
7. 70μm 세포 스크리닝 필터를 통해 세포 현탁액을 여과하고 깨끗한 50mL 원심분리 튜브에 여과액을 수집합니다.
   참고: 이 단계는 소화되지 않은 큰 조직 조각을 제거합니다.
8. 여과액을 새 15mL 원심분리기 튜브에 옮기고 4°C, 300×g에서 10 분 동안 원 심분리기합니다. 1mL 피펫으로 상등액을 버립니다.
9. 15mL HBSS로 위아래로 20회 피펫팅하여 세포 현탁액을 세척하고 4°C, 300× g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고
   세포 펠렛을 MACS 완충액 1mL에 재현탁합니다.
   참고: 이 단계는 후속 실험에 사용되는 단일 세포 현탁액을 제공합니다.

3. 미세아교세포의 급성 분리

1. 1mL의 단일 세포 현탁액을 2mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 4°C, 300× g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오.
2. 단일 세포 펠릿을 90μL의 MACS 완충액에 재현탁합니다. 10 μL의 CD11b/c 마이크로비드를 첨가하고 수평 쉐이커에서 4 °C에서 15분 동안 현탁액을 배양합니다.
3. 정렬 컬럼을 적절한 MACS 분리기의 자기장에 놓고 500μL의 MACS 버퍼로 컬럼을 두 번 적십니다.
4. MACS 완충액 1mL를 튜브에 직접 첨가하고 4°C, 300× g 에서 3분 동안 원심분리하여 단일 세포 현탁액을 세척합니다. 상층액을 완전히 흡인합니다.
5. 세포 펠릿을 500μL의 MACS 완충액에 재현탁합니다.
6. 재현탁된 세포 현탁액을 1mL 피펫을 사용하여 자기장의 분류 컬럼으로 옮깁니다. 플로우 스루를 폐기합니다. 컬럼이 자기장에 남아 있는 동안 500μL의 MACS 버퍼로 컬럼을 세 번 세척합니다.
   참고: 플로우 스루에는 레이블이 지정되지 않은 셀이 포함되어 있습니다. 컬럼은 자기장에서 제거하지 않고 세척해야 합니다.
7. 자기장에서 분류 열을 제거합니다. 컬럼에 1mL MACS 버퍼를 추가하고 피스톤으로 천천히 밀어 넣습니다. 플로우 스루를 수집합니다.
   참고: 플로우 스루에는 라벨링된 세포(즉, 미세아교세포)가 포함됩니다. 미세아교세포의 순도를 개선하기 위해 새로운 분류 열(선택 사항)로 프로세스를 반복할 수 있습니다.
8. 선택한 세포를 PLL로 코팅된 커버슬립이 포함된 24웰 플레이트에 파종합니다. 200μL의 배양 배지를 추가하고 95% O₂, 5% CO₂ 및 60%-80% 습도의 37°C 인큐베이터에서 20분 동안 배양합니다. 이 단계를 통해 미세아교세포가 후속 전세포 패치 클램프 및 면역형광 실험을 위해 커버슬립에 부착할 수 있습니다.

4. 면역형광

1. 플레이트 웰에서 배양 배지를 흡입하고 셰이커에서 0.1M PBS로 세포를 세 번 헹굽니다.
2. PBS를 버리고 실온(RT)에서 20분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA)로 커버슬립의 미세아교세포를 고정합니다.
3. 정착액을 제거하고 0.1M PBS로 커버 슬립을 세 번 헹굽니다.
4. PBS를 버리고 Shaker의 RT에서 1시간 동안 PBS에 0.2% Triton X-100 및 5% BSA를 함유한 200μL의 차단 버퍼로 세포를 투과화합니다.
5. 차단 완충액과 anti-IBA1 및 anti-CD11b 1^{차 항체 18} 로 미세아교세포를 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
6. 다음 날, 1차 항체를 제거하고 셰이커에서 PBS RT로 커버 슬립을 세 번 헹굽니다.
7. RT에서 2시간 동안 형광단 결합 2차 항체를 포함하는 차단 버퍼로 미세아교세포를 배양합니다.배양의 마지막 15분 동안 DAPI 염료를 추가합니다.
8. 2차 항체를 제거하고 PBS로 커버 슬립을 세 번 헹굽니다. 이미징을 위해 현미경 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다.

5. 미세아교세포(microglia)에서 칼륨 전류의 전체 세포 패치 클램프 기록

1. 세포 내 용액을 해동하여 얼음 위에 보관하십시오.
2. 수직 풀러¹⁷을 사용하여 얇은 벽의 붕규산 유리 모세관에서 패치 피펫(전극)을 당깁니다.
   알림: 전극 저항은 10MΩ 미만이어야 합니다.
3. 커버슬립을 기록 챔버로 옮기고 160mM의 NaCl, 4.5mM의 KCl, 2mM의 CaCl₂, 1mM의 MgCl₂ 및 10mM의 HEPES를 포함하는 세포 외 용액을 추가합니다. 사용하기 전에^13,16을 사용하기 전에 1M NaOH 용액으로 pH를 7.2로 조정하고 D-자당으로 삼투압을 300mOsm으로 조정하십시오.
4. 40x 대물렌즈를 사용하여 물 현미경 아래에서 구형 미세아교세포를 찾습니다.
5. 전극에 세포 내 용액을 채우고 증폭기 헤드 스테이지에 부착합니다.tage 전기생리학 설정의 다음 양압을 가합니다. 4x 대물렌즈로 전환하고 전극을 찾습니다.
   1. 전극을 수조 용액에 내리고 ampliifier를 vol로tage-clamp 수 조 모드에서 멤브레인 테스트를 수행합니다. 다시 40x 대물렌즈로 전환하고 전극 팁을 미세아교세포에 더 가깝게 이동합니다.
      알림: 전극 팁이 미세아교세포에 매우 가까우면 저항이 약간 증가해야 합니다.
   2. 세포를 유지하기 위해 작은 음압을 가합니다. 저항이 100MΩ에 도달하면 멤브레인 테스트에서 수조 에서 패치 모드로 전환하십시오. 저항이 300MΩ에 도달하면 음압을 해제하십시오.
   3. 저항이 전극과 미세아교세포 사이에 기가옴 씰(즉, >1GΩ)의 형성을 나타내는 경우 멤브레인 테스트에서 패치 에서 셀 모드로 전환합니다.
6. 소량의 흡입을 가하고 전기 충격을 시작하여 멤브레인을 파열시킵니다. 큰 용량성 과도 현상의 출현은 성공적인 멤브레인 파열을 나타냅니다.
7. 볼륨으로 전환tage-clamp 모드를 선택하고 녹음 프로그램을 엽니다. 200ms 동안 칼륨 전류를 기록합니다. 전위를 테스트하려면 1Hz에서 -120mV에서 +40mV까지 20mV 단위로 전압 단계를 적용합니다.
8. 적절한 소프트웨어를 사용하여 얻은 데이터를 오프라인으로 분석합니다.

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결과

간단히 말해서, 이 과정에는 성체 쥐의 뇌에서 해마 미세아교세포를 분리한 다음 이러한 세포를 전체 세포 패치 클램프 기록하는 것이 포함됩니다(그림 1). 이 절차는 3-5개월 된 C57BL/6J 성체 쥐의 해마를 해부하는 것으로 시작됩니다. 구체적으로 말하자면, 관류 후 뇌 전체를 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 배양 접시에 넣습니다(

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토론

태아 또는 신생아 마우스에서 배양된 미세아교세포는 성인 미세아교세포를 연구하기에 분명히 적합하지 않습니다. 추가적으로, 상이한 뇌 영역에 걸친 미세아교세포의 이질성을 감안할 때²¹, 전체 뇌에서 분리된 미세아교세포는 특정 뇌 구조에서 미세아교세포의 특성을 정확하게 나타내지 않을 수 있다. 이 프로토콜은 이러한 세포의 전기적 특성을 평?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Corning	353003
15 mL Falcon tubes	BD	352096
24-well plates	BD	353047
35 mm Petri dish	Corning	353001	-
50 mL Falcon tubes	BD	352070
70 μm cell screening	Miltenyi	130-095-823	To remove cell clumps before cell sorting
Adult Mouse Brain Dissociation Kit	Miltenyi	130- 107-677
Anti-CD11b Antibody	Bio-Rad	MCA74	Goat Anti-mouse IgG also available. For blocking endogenous immunoglobulins.
Anti-Iba 1 Antibody	SYSY	234308	Goat Anti-guinea pig IgG) also available. For blocking endogenous immunoglobulins.
Axon Digidata 1440A	USA
Axon MultiClamp 700B Amplifier	USA
BSA Albumin Fraction V	BioFrox	4240GR500	Serum
C57BL/6 mice	Guangdong Medical Laboratory Animal Center
CD11 b/c MicroBeads	Miltenyi	130-105-634
Chloral hydrate	Absin	abs47051394	Widely used as anesthesia in mice
Clampfit 10.6	USA
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 800
Culture medium	Fisher Scientific	C11995500BT	-
DAPI dye	Beyotime	C1002
Electrode puller	Narishige	PC-10
HBSS	Servicebio	G4203
Horizontal shaker	SCILOGEX	SLK-O3000-S
Image analysis software	Fiji
MACS Columns	Miltenyi	130-042-201
MACS Separators	Miltenyi	130-042-102
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	T353-500	Use fresh 4% solution in 1X PBS, pH 7.2-7.4.
Poly-L-lysine	Beyotime	C0313	Coverslip coating
Triton X-100	Sigma	X100