成体マウスからの海馬ミクログリアの単離と全細胞パッチクランプ記録

要約

本プロトコルは、成体マウスから初代海馬ミクログリアを単離し精製する方法を説明し、続いて、これらの急性に単離された細胞の全細胞パッチクランプ記録を実施するための指示が続きます。

要約

ミクログリアは、脳内に常在する免疫細胞で、ニューロンと相互作用して中枢神経系(CNS)の恒常性を維持しています。研究によると、ミクログリアの表面にはミクログリアの活性化を調節するカリウムチャネルが発現していますが、これらのカリウムチャネルの異常は神経疾患につながる可能性があります。現在、ミクログリアの全細胞パッチクランプ記録は、急性に分離されたミクログリアの電気生理学的評価を行うことが困難であるため、主に胎児または新生仔マウスの培養初代ミクログリアで行われています。この研究では、成体マウスから海馬ミクログリアを単離し、単離された細胞に対して全細胞パッチクランプ記録を実施するためのわかりやすいプロトコルを紹介します。簡単に言うと、脳を斬首後にマウスから取り出し、海馬を両側に解剖し、成体マウスの脳解離キットを用いてミクログリアを単離した。次に、ミクログリアを磁気活性化セルソーティング(MACS)法を使用して精製し、カバースリップに播種しました。ミクログリアの単離の成功は、抗CD11抗体および抗Iba1抗体による免疫蛍光染色によって確認されました。カバースリップを記録チャンバーに入れ、急性に分離されたミクログリアの全細胞カリウム電流を電圧クランプ条件下で記録しました。

概要

原始卵黄嚢の骨髄系前駆細胞に由来するミクログリアは、中枢神経系に存在し、全神経細胞の約10%から15%を占めている^1,2。機能的には、局所環境の監視、免疫防御機能の発揮、ニューロン^への栄養とサポートの提供^{に加えて、ミ}クログリアはニューロンに直接接触してニューロン表面受容体と対応するリガンド結合を調節し、サイト^カインの分泌を介してニューロンと間接的に相互作用することもできる5。in vitroおよびin vivoでの研究により、ミクログリアはさまざまな種類のカリウムチャネルを発現し、これが負の膜電位^の維持に寄与し6、ミクログリアの活性化を調節することが実証されています。さまざまな^脳疾患で異常なミクログリアカリウムチャネルが観察されていることを考えると7、研究者はこれらのカリウムチャネルを標的とする可能性のある薬剤を特定し、ミクログリア機能を調節する戦略を開発することが重要です。

ミクログリアの従来の消化および精製方法は、多くの場合、脳全体を使用しますが、これは異なる脳領域にわたるミクログリアの不均一性を見落としています⁸。血清含有培地での in vitro 解離および長期培養は、ミクログリアを^{活性状態9}に置くが、これはミクログリアの生理学的特性および真の状態を正確に反映していない可能性がある。

さらに、初代培養された新生児ミクログリアおよび細胞株¹⁰では、外向き整流カリウム電流が記録されていますが、胎児または新生仔マウスの脳組織の長期培養からのデータは、成熟ミクログリアのデータと異なる場合があります。本プロトコルは、ミクログリアを急性に分離し、成体マウス脳組織を用いてミクログリアカリウム電流の全細胞記録を直ちに行うことを目的としています。

生化学的およびカリウムチャネル特性を、小組織11,12,13,14,15からのミクログリアの単離および精製に適した方法を用いて調べた。したがって、このプロトコルは、研究者が生理学的および疾患条件下でのミクログリアの生化学的および機能的特性を解明するためのガイダンスを提供します。このプロトコルでは、海馬チャネルとカリウムチャネルを例として使用しますが、他の脳領域やチャネル/細胞の電気生理学的特性の研究にも適用できます。

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プロトコル

すべての実験は、華南師範大学の生命科学動物管理および使用委員会によって承認され、動物福祉の適切な基準が維持されました(倫理承認:SCNU-SLS-2023-048)。この研究では、生後3〜5か月の雄または雌のC57BL / 6Jマウスを使用しました。使用した試薬や機器の詳細は 、資料表に記載されています。

1. 溶液の調製

1. 160 mMのKF、10 mMのHEPES、10 mMのEGTAおよび2 mMのMgCl₂を含む50 mLの細胞内溶液を調製します。1 MのKOH溶液でpHを7.2に調整し、D-スクロース^13,16で浸透圧を300 mOsmに調整します。-20°Cで保存してください。
2. 0.5% ウシ血清アルブミン(BSA)と 2 mM のエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む PBS 中に 50 mL の磁気活性化セルソーティング(MACS)バッファーを調製します。
3. ポリ-L-リジン(PLL)を水で1:1000に希釈して調製します。
   注:カバーガラスは実験の前日にPLLでコーティングする必要があります。コーティングされたスリップを37°Cで一晩インキュベートします。2日目にPLLをリサイクルし、コーティングされたスリップを37°Cで乾燥させます。

2. 脳組織からの単一細胞懸濁液の調製

1. マウスに2.5%クロラール水和物(0.15 mL/10 g、i.p.)(制度的に承認されたプロトコルに従う)。マウスのつま先をつまんだり皮膚をつまんだりすることによる角膜反射と疼痛反射の消失は、深い麻酔を確認します。動物を仰向けで解剖台に置き、手足を固定します。
   1. 胸部を露出させ、心臓¹⁷ に氷冷滅菌PBSを灌流して、血管内循環血液細胞を除去します。頭を持ち、ハサミで脳の正中線に沿って皮膚を切り、頭蓋骨を露出させます。
   2. 頭蓋骨の後部を両側に切り、小さなはさみで眼窩の間を切ります。矢状縫合糸に沿って頭蓋骨を切断し、ピンセットで頭蓋骨を取り除きます。ピンセット¹⁷で脳組織をすばやく抽出します。
2. 氷冷PBSが入った10cmの培養皿に脳組織を入れます。ピンセットで大脳皮質を両側に解剖し、海馬組織を分離し、細かく切開します。ピースを15 mLの遠心分離チューブに移します。
   注:大脳皮質の両側解剖は、脳の両半球の海馬組織の三日月を明らかにします。
3. 海馬組織の小片を氷冷したハンク平衡塩溶液(HBSS)2mLに再懸濁し、300 × g で3分間(室温)遠心分離してから、HBSSを廃棄します。
4. 1950 μLの酵素混合物1を、海馬組織片が入った15 mLの遠心チューブに加えます。遠心分離管を37°Cの水浴中で5分間連続して振とうします。
   注:酵素混合物1は、50 μLの酵素Pと1900 μLのバッファーYを37°Cに予熱したものです(市販のキットの一部として存在し、 材料の表を参照)。
5. 遠心分離管をウォーターバスから取り外します。調製したばかりの酵素混合物230 μLを15 mLの遠心チューブに加えます。1 mLのピペットチップで組織片を20回上下にピペットで動かし、37°Cで連続振とうしながら水浴中で5分間インキュベートします。
   注:酵素混合物2は、20μLのバッファーYと10μLの酵素Aの組み合わせです。上記の2つの消化ステップは、脳組織を細胞懸濁液に変換します。総消化時間は15分を超えてはなりません。
6. 遠心分離チューブを取り外し、大きな組織片が残らなくなるまで、1 mLピペットで懸濁液を複数回上下にピペットで動かします。
7. 70 μmの細胞スクリーニングフィルターで細胞懸濁液をろ過し、濾液を清潔な50 mL遠心分離チューブに集めます。
   注:このステップでは、未消化の組織の大きな部分をすべて取り除きます。
8. 濾液を新しい15 mL遠心チューブに移し、4°C、300 × g で10分間遠心分離します。上清を1mLのピペットで捨てます。
9. 15 mL HBSSで20回ピペッティングして細胞懸濁液を洗浄し、4°C、300 × g で10分間遠心分離します。上澄みを捨てて、
   細胞ペレットをMACSバッファー1mLに再懸濁します。
   注:このステップは、その後の実験で使用されるシングルセル懸濁液を提供します。

3. ミクログリアの急性分離

1. 1 mLのシングルセル懸濁液を2 mLの微量遠心チューブに移し、4°C、300 × g で3分間遠心分離します。上清を捨てます。
2. シングルセルペレットを90 μLのMACSバッファーに再懸濁します。CD11b/cマイクロビーズ10μLを添加し、懸濁液を4°Cで水平シェーカーで15分間インキュベートします。
3. ソーティングカラムを適切なMACSセパレーターの磁場に置き、500μLのMACSバッファーでカラムを2回湿らせます。
4. 1 mLのMACSバッファーをチューブに直接加えてシングルセル懸濁液を洗浄し、4°C、300 × g で3分間遠心分離します。上清を完全に吸引します。
5. 細胞ペレットを500 μLのMACSバッファーに再懸濁します。
6. 再懸濁した細胞懸濁液を磁場中でソーティングカラムに移し、1mLピペットを使用します。フロースルーを破棄します。カラムを磁場中に留まっている間に、500 μLのMACSバッファーで3回洗浄します。
   注:フロースルーにはラベルのないセルが含まれています。カラムは磁場から取り除かずに洗浄する必要があります。
7. ソーティング列を磁場から取り外します。1 mLのMACSバッファーをカラムに加え、ピストンでゆっくりと押し込みます。フロースルーを収集します。
   注:フロースルーには、標識された細胞(すなわち、ミクログリア)が含まれます。ミクログリアの純度を向上させるために、新しいソーティングカラム(オプション)を使用してこのプロセスを繰り返すことができます。
8. 選択した細胞を、PLLでコーティングされたカバースリップを含む24ウェルプレートに播種します。200 μLの培地を加え、95% O₂、5% CO₂、湿度60-80%の37°Cインキュベーターで20分間インキュベートします。このステップにより、ミクログリアをカバーガラスに付着させ、その後の全細胞パッチクランプおよび免疫蛍光実験を行うことができます。

4. 免疫蛍光

1. プレートウェルから培地を吸引し、シェーカーで0.1 M PBSで細胞を3回すすぎます。
2. PBSを廃棄し、ミクログリアを4%パラホルムアルデヒド(PFA)でカバーガラスに室温(RT)で20分間固定します。
3. 固定剤をはがし、カバースリップを0.1M PBSで3回すすぎます。
4. PBSを廃棄し、0.2% Triton X-100およびPBS中の5% BSAを含む200 μLのブロッキングバッファーで細胞を透過処理し、シェーカー上のRTで1時間。
5. ミクログリアをブロッキングバッファーと抗Iba1および抗CD11b一次抗体¹⁸ と共に4°Cで一晩インキュベートします。
6. 翌日、一次抗体を取り出し、シェーカーのRTでカバースリップをPBSで3回すすぎます。
7. 蛍光色素共役二次抗体を含むブロッキングバッファーとミクログリアを室温で2時間インキュベートし、インキュベーションの最後の15分間にDAPI色素を添加します。
8. 二次抗体を取り出し、カバースリップをPBSで3回すすぎます。カバースリップを顕微鏡スライドに取り付けてイメージングします。

5. ミクログリアにおけるカリウム電流の全細胞パッチクランプ記録

1. 細胞内溶液を解凍し、氷の上に保ちます。
2. 垂直プー^ラー17を使用して、薄肉のホウケイ酸ガラスキャピラリーからパッチピペット(電極)を引き抜きます。
   注:電極抵抗は10MΩ未満である必要があります。
3. カバースリップを記録チャンバーに移し、160 mMのNaCl、4.5 mMのKCl、2 mMのCaCl₂、1 mMのMgCl₂、および10 mMのHEPESを含む細胞外溶液を添加します。使用前に1 M NaOH溶液でpHを7.2に調整し、^13,16を使用し、浸透圧をD-スクロースで300 mOsmに調整します。
4. 40倍対物レンズを使用して、水顕微鏡で球状ミクログリアを見つけます。
5. 電極に細胞内溶液を充填し、電気生理学セットアップのアンプヘッドステージに取り付けて、正圧を加えます。4倍対物レンズに切り替えて、電極の位置を確認します。
   1. 電極を浴溶液に下げ、アンプを電圧クランプモードに設定して、 浴 モードで膜試験を実行します。40倍対物レンズに戻し、電極の先端をミクログリアに近づけます。
      注:電極の先端がミクログリア細胞に非常に近い場合、抵抗はわずかに増加するはずです。
   2. セルを保持するために小さな負圧を加えます。抵抗が100MΩに達したら、メンブレンテストで バス モードから パッチ モードに切り替えます。抵抗が300MΩに達したら、負圧を解放します。
   3. 抵抗が電極とミクログリア膜との間にギガオームシール(つまり、>1GΩ)の形成を示している場合は、メンブレンテストで パッチ モードから セル モードに切り替えます。
6. 少量の吸引を加え、電気ショックを起こして膜を破裂させます。大きな容量性過渡現象の出現は、膜の破裂が成功したことを示しています。
7. 電圧に切り替えますamp モードにして、録音プログラムを開きます。カリウム電流を200ミリ秒記録します。電位をテストするには、1 Hz で -120 mV から +40 mV まで 20 mV 刻みで電圧ステップを印加します。
8. 取得したデータを適切なソフトウェアを使用してオフラインで分析します。

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結果

簡単に言うと、このプロセスには、成体マウスの脳からの海馬ミクログリアの単離と、それに続くこれらの細胞の全細胞パッチクランプ記録が含まれます(図1)。この手順は、生後3〜5か月のC57BL / 6J成体マウスの海馬を解剖することから始まります。具体的には、灌流後に脳全体を取り出し、氷冷したPBSを含む培養皿に入れます(?...

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ディスカッション

胎児または新生児マウスから培養されたミクログリアは、成体ミクログリアの研究には明らかに適していません。さらに、異なる脳領域にわたるミクログリアの不均一性を考慮する^と、全脳から分離されたミクログリアは、特定の脳構造におけるミクログリアの特性を正確に表していない可能性がある。このプロトコルは、海馬ミクログリアを単離...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Corning	353003
15 mL Falcon tubes	BD	352096
24-well plates	BD	353047
35 mm Petri dish	Corning	353001	-
50 mL Falcon tubes	BD	352070
70 μm cell screening	Miltenyi	130-095-823	To remove cell clumps before cell sorting
Adult Mouse Brain Dissociation Kit	Miltenyi	130- 107-677
Anti-CD11b Antibody	Bio-Rad	MCA74	Goat Anti-mouse IgG also available. For blocking endogenous immunoglobulins.
Anti-Iba 1 Antibody	SYSY	234308	Goat Anti-guinea pig IgG) also available. For blocking endogenous immunoglobulins.
Axon Digidata 1440A	USA
Axon MultiClamp 700B Amplifier	USA
BSA Albumin Fraction V	BioFrox	4240GR500	Serum
C57BL/6 mice	Guangdong Medical Laboratory Animal Center
CD11 b/c MicroBeads	Miltenyi	130-105-634
Chloral hydrate	Absin	abs47051394	Widely used as anesthesia in mice
Clampfit 10.6	USA
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 800
Culture medium	Fisher Scientific	C11995500BT	-
DAPI dye	Beyotime	C1002
Electrode puller	Narishige	PC-10
HBSS	Servicebio	G4203
Horizontal shaker	SCILOGEX	SLK-O3000-S
Image analysis software	Fiji
MACS Columns	Miltenyi	130-042-201
MACS Separators	Miltenyi	130-042-102
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	T353-500	Use fresh 4% solution in 1X PBS, pH 7.2-7.4.
Poly-L-lysine	Beyotime	C0313	Coverslip coating
Triton X-100	Sigma	X100