Isolamento e registro de patch-clamp de células inteiras da microglia hipocampal de camundongos adultos

Resumo

O presente protocolo descreve como isolar e purificar a micróglia primária do hipocampo de camundongos adultos, seguido de instruções para a realização de gravações de patch-clamp de células inteiras nessas células agudamente isoladas.

Resumo

A microglia são células imunes residentes no cérebro que interagem com os neurônios para manter a homeostase do sistema nervoso central (SNC). Estudos mostram que a superfície microglial expressa canais de potássio que regulam a ativação microglial, enquanto anormalidades nesses canais de potássio podem levar a doenças neurais. Atualmente, os registros de microglia de células inteiras são realizados principalmente em microglia primária cultivada de camundongos fetais ou recém-nascidos devido a dificuldades na realização de avaliações eletrofisiológicas em microglia agudamente isolada. Este estudo apresenta um protocolo fácil de seguir para isolar a micróglia do hipocampo de camundongos adultos e realizar gravações de patch-clamp de células inteiras nas células isoladas. Resumidamente, o cérebro foi removido de um camundongo após a decapitação, o hipocampo foi dissecado bilateralmente e a micróglia foi isolada usando um kit de dissociação cerebral de camundongo adulto. A microglia foi então purificada usando um método de classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) e semeada em lamínulas. O isolamento microglial bem-sucedido foi confirmado por coloração imunofluorescente com anticorpos anti-CD11 e anti-Iba1. Uma lamínula foi colocada em uma câmara de registro e as correntes de potássio de toda a célula da micróglia agudamente isolada foram registradas em condições de pinça de voltagem.

Introdução

A microglia, que deriva de progenitores mielóides no saco vitelino primitivo, é residente no SNC e compreende cerca de 10% a 15% do total de células nervosas ^1,2. Funcionalmente, além de vigiar o ambiente local, desempenhar funções de defesa imunológica e fornecer nutrição e suporte para os neurônios ^3,4, a microglia também pode entrar em contato direto com os neurônios para regular os receptores de superfície neuronal e a ligação do ligante correspondente e interagir indiretamente com os neurônios por meio da secreção de citocinas⁵. Estudos in vitro e in vivo demonstraram que a microglia expressa vários tipos de canais de potássio, que contribuem para a manutenção do potencial negativo de membrana⁶ e regulam a ativação microglial. Dado que canais anormais de potássio microglial foram observados em várias doenças cerebrais⁷, é crucial que os pesquisadores identifiquem possíveis medicamentos que tenham como alvo esses canais de potássio e desenvolvam estratégias para regular a função microglial.

Os métodos tradicionais de digestão e purificação da micróglia geralmente usam todo o cérebro, o que ignora a heterogeneidade da micróglia em diferentes áreas do cérebro⁸. A dissociação in vitro e a cultura de longo prazo em meios contendo soro colocam a microglia em um estado ativo⁹, o que pode não refletir com precisão suas características fisiológicas e estado verdadeiro.

Além disso, embora as correntes de potássio retificadoras externas tenham sido registradas na micróglia primária de recém-nascidos cultivados e linhagens celulares¹⁰, os dados de culturas de longo prazo de tecido cerebral fetal ou de camundongo recém-nascido podem diferir daqueles da micróglia madura. O presente protocolo visa isolar agudamente a microglia e realizar imediatamente registros de células inteiras das correntes microgliais de potássio usando tecido cerebral de camundongo adulto.

As propriedades bioquímicas e dos canais de potássio foram examinadas usando um método adequado para o isolamento e purificação da microglia de pequenos tecidos 11,12,13,14,15. Portanto, este protocolo fornece orientação para os pesquisadores elucidarem as propriedades bioquímicas e funcionais da microglia em condições fisiológicas e de doença. Embora este protocolo use o hipocampo e os canais de potássio como exemplos, ele também pode ser aplicado ao estudo de outras áreas cerebrais e propriedades eletrofisiológicas de canais / células.

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Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais de Ciências da Vida da Universidade Normal do Sul da China, e os padrões apropriados de bem-estar animal foram mantidos (aprovação ética: SCNU-SLS-2023-048). Camundongos C57BL/6J machos ou fêmeas de 3-5 meses de idade foram usados para este estudo. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação das soluções

1. Prepare 50 mL de solução intracelular contendo 160 mM de KF, 10 mM de HEPES, 10 mM de EGTA e 2 mM de MgCl₂. Ajustar o pH a 7,2 com 1 M de solução de KOH e ajustar a pressão osmótica a 300 mOsm com D-sacarose^13,16. Conservar a -20 °C.
2. Prepare 50 mL de tampão de classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) contendo 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em PBS.
3. Preparar a poli-L-lisina (PLL) numa diluição de 1:1000 em água.
   NOTA: As lamínulas devem ser revestidas com PLL no dia anterior ao experimento. Incubar as lâminas revestidas a 37 °C durante a noite. Recicle o PLL no segundo dia e seque as tiras revestidas a 37 °C.

2. Preparação de suspensão unicelular a partir de tecido cerebral

1. Anestesiar os camundongos com 2,5% de hidrato de cloral (0,15 mL / 10 g, i.p.) (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). O desaparecimento do reflexo da córnea e do reflexo da dor por beliscar os dedos dos pés ou beliscar a pele em camundongos confirma a anestesia profunda. Coloque os animais em decúbito dorsal em uma mesa de dissecação e prenda seus membros.
   1. Exponha o tórax e perfunda o coração¹⁷ com PBS estéril gelado para remover as células sanguíneas circulantes intravasculares. Segure a cabeça e corte a pele ao longo da linha média do cérebro com uma tesoura para expor o crânio.
   2. Corte a parte posterior do crânio bilateralmente e entre as órbitas oculares com uma tesoura pequena. Corte o crânio ao longo da sutura sagital e remova o crânio com uma pinça. Extraia o tecido cerebral rapidamente com uma pinça¹⁷.
2. Coloque o tecido cerebral em placas de cultura de 10 cm contendo PBS gelado. Disseque o córtex cerebral bilateralmente com uma pinça, isole o tecido do hipocampo e corte-o em pedaços menores. Transfira as peças para um tubo de centrífuga de 15 mL.
   NOTA: A dissecção bilateral do córtex cerebral revela o crescente do tecido hipocampal em ambos os hemisférios do cérebro.
3. Ressuspenda os pequenos pedaços de tecido hipocampal em 2 mL de solução salina balanceada de Hank gelada (HBSS) e centrifugue a 300 × g por 3 min (à temperatura ambiente) e, em seguida, descarte o HBSS.
4. Adicione 1950 μL de mistura enzimática 1 ao tubo de centrífuga de 15 mL contendo os pedaços de tecido hipocampal. Agitar continuamente o tubo da centrífuga em banho-maria a 37 °C durante 5 min.
   NOTA: A mistura enzimática 1 é uma combinação de 50 μL de enzima P e 1900 μL de tampão Y, pré-aquecido a 37 ° C (presente como parte do kit disponível comercialmente, consulte a Tabela de Materiais).
5. Remova o tubo da centrífuga do banho-maria. Adicione 30 μL de mistura enzimática 2 recém-preparada ao tubo de centrífuga de 15 mL. Pipetar os fragmentos de tecido para cima e para baixo 20 vezes com uma ponta de pipeta de 1 mL e incubar em banho-maria por 5 min com agitação contínua a 37°C.
   NOTA: A mistura enzimática 2 é uma combinação de 20 μL de tampão Y e 10 μL de enzima A. As duas etapas de digestão acima convertem o tecido cerebral em uma suspensão celular. O tempo total de digestão não deve exceder 15 min.
6. Remova o tubo da centrífuga e pipete a suspensão para cima e para baixo várias vezes com uma pipeta de 1 mL até que não haja mais pedaços grandes de tecido.
7. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de triagem celular de 70 μm e recolher o filtrado num tubo de centrifugação limpo de 50 ml.
   NOTA: Esta etapa remove quaisquer pedaços grandes de tecido não digerido.
8. Transferir o filtrado para um novo tubo de centrifugação de 15 ml e centrifugar a 4 °C, 300 × g durante 10 min. Descarte o sobrenadante com uma pipeta de 1 mL.
9. Lave a suspensão celular pipetando para cima e para baixo 20 vezes com 15 mL de HBSS e centrifugue a 4 °C, 300 × g por 10 min. Rejeitar o sobrenadante e
   ressuspenda o pellet celular em 1 mL de tampão MACS.
   NOTA: Esta etapa fornece a suspensão de célula única usada em experimentos subsequentes.

3. Separação aguda da microglia

1. Transferir 1 ml da suspensão monocelular para um tubo de microcentrífuga de 2 ml e centrifugar a 4 °C, 300 × g durante 3 min. Descarte o sobrenadante.
2. Ressuspenda o pellet de célula única em 90 μL de tampão MACS. Adicionar 10 μL de microesferas de CD11b/c e incubar a suspensão a 4 °C durante 15 min num agitador horizontal.
3. Coloque a coluna de classificação no campo magnético de um separador MACS adequado e umedeça a coluna duas vezes com 500 μL de tampão MACS.
4. Lave a suspensão monocelular adicionando 1 ml de tampão MACS diretamente ao tubo e centrifugue a 4 °C, 300 × g durante 3 min. Aspirar completamente o sobrenadante.
5. Ressuspenda o pellet celular em 500 μL de tampão MACS.
6. Transferir a suspensão de células ressuspensas para a coluna de triagem no campo magnético utilizando uma pipeta de 1 ml. Descarte o fluxo. Lave a coluna três vezes com 500 μL de tampão MACS enquanto ela permanece no campo magnético.
   NOTA: O fluxo contém células não rotuladas. A coluna deve ser lavada sem removê-la do campo magnético.
7. Remova a coluna de classificação do campo magnético. Adicione 1 mL de tampão MACS à coluna e empurre-o lentamente com o pistão. Colete o fluxo.
   NOTA: O fluxo contém as células marcadas (ou seja, a microglia). Para melhorar a pureza da microglia, o processo pode ser repetido com uma nova coluna de classificação (opcional).
8. Semeie as células selecionadas em uma placa de 24 poços contendo uma lamínula revestida com PLL. Adicione 200 μL de meio de cultura e incube por 20 min em uma incubadora a 37 °C com 95% de O₂, 5% de CO₂ e 60% -80% de umidade. Esta etapa permite que a microglia se prenda à lamínula para experimentos subsequentes de patch clamp e imunofluorescência de células inteiras.

4. Imunofluorescência

1. Aspire o meio de cultura dos poços da placa e lave as células três vezes com 0,1 M PBS no agitador.
2. Descarte o PBS e fixe a microglia na lamínula com paraformaldeído (PFA) a 4% por 20 min em temperatura ambiente (TR).
3. Remova o fixador e enxágue a lamínula três vezes com 0,1 M PBS.
4. Descarte o PBS e permeabilize as células com 200 μL de tampão de bloqueio contendo 0,2% de Triton X-100 e 5% de BSA em PBS por 1 h em RT no agitador.
5. Incubar a micróglia com tampão de bloqueio mais anticorpos primários anti-Iba1 e anti-CD11b¹⁸ durante a noite a 4 °C.
6. No dia seguinte, remova os anticorpos primários e enxágue a lamínula três vezes com PBS em RT no shaker.
7. Incube a microglia com o tampão de bloqueio contendo anticorpos secundários acoplados a fluoróforo por 2 h em RT. Adicione corante DAPI nos últimos 15 minutos de incubação.
8. Remova os anticorpos secundários e lave a lamínula três vezes com PBS. Monte as lamínulas nas lâminas do microscópio para obter imagens.

5. Registro de patch-clamp de célula inteira de correntes de potássio na microglia

1. Descongele a solução intracelular e mantenha-a no gelo.
2. Puxe pipetas de remendo (eletrodos) de capilares de vidro borossilicato de paredes finas usando um extrator vertical¹⁷.
   NOTA: A resistência do eletrodo deve ser inferior a 10 MΩ.
3. Transfira uma lamínula para a câmara de registro e adicione a solução extracelular contendo 160 mM de NaCl, 4,5 mM de KCl, 2 mM de CaCl₂, 1 mM de MgCl₂ e 10 mM de HEPES. Ajustar o pH para 7,2 com solução de NaOH 1 M antes de utilizar^13,16 e ajustar a pressão osmótica para 300 mOsm com D-sacarose.
4. Localize a microglia esférica sob um microscópio aquático usando a objetiva de 40x.
5. Encha o eletrodo com solução intracelular, conecte-o ao estágio principal do amplificador da configuração de eletrofisiologia e aplique pressão positiva. Mude para a objetiva 4x e localize o eletrodo.
   1. Abaixe o eletrodo na solução de banho e ajuste o amplificador para voltage clamp modo para realizar o teste de membrana no modo de banho . Volte para a objetiva de 40x e aproxime a ponta do eletrodo da microglia.
      NOTA: Quando a ponta do eletrodo está muito próxima de uma célula microglial, a resistência deve aumentar ligeiramente.
   2. Aplique uma pequena pressão negativa para segurar a célula. Quando a resistência atingir 100 MΩ, mude do modo de banho para o modo de remendo no teste de membrana. Quando a resistência atingir 300 MΩ, libere a pressão negativa.
   3. Quando a resistência indicar a formação de uma vedação de gigaohm (ou seja, >1 GΩ) entre o eletrodo e a membrana microglial, mude do modo patch para o modo de célula no teste de membrana.
6. Aplique uma pequena quantidade de sucção e inicie um choque elétrico para romper a membrana. O aparecimento de grandes transientes capacitivos indica ruptura bem-sucedida da membrana.
7. Mude para o modo de grampo de tensão e abra o programa de gravação. Registre as correntes de potássio por 200 ms. Para testar potenciais, aplique etapas de tensão em incrementos de 20 mV de -120 mV a +40 mV a 1 Hz.
8. Analise os dados obtidos offline usando o software apropriado.

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Resultados

Resumidamente, o processo envolve o isolamento da micróglia hipocampal do cérebro de camundongos adultos, seguido pelo registro de patch-clamp de células inteiras dessas células (Figura 1). O procedimento começa com a dissecação do hipocampo de camundongos adultos C57BL / 6J de 3 a 5 meses de idade. Especificamente, todo o cérebro é removido após a perfusão e colocado em uma placa de cultura contendo PBS gelado (Figura 2A

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Discussão

A micróglia cultivada de camundongos fetais ou recém-nascidos é claramente inadequada para estudar a micróglia adulta. Além disso, dada a heterogeneidade da microglia em diferentes áreas do cérebro²¹, a microglia isolada de todo o cérebro pode não representar com precisão as características da microglia em uma estrutura cerebral específica. Este protocolo fornece um método para isolar a micróglia do hipocampo especificamente para avaliar as proprieda...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Corning	353003
15 mL Falcon tubes	BD	352096
24-well plates	BD	353047
35 mm Petri dish	Corning	353001	-
50 mL Falcon tubes	BD	352070
70 μm cell screening	Miltenyi	130-095-823	To remove cell clumps before cell sorting
Adult Mouse Brain Dissociation Kit	Miltenyi	130- 107-677
Anti-CD11b Antibody	Bio-Rad	MCA74	Goat Anti-mouse IgG also available. For blocking endogenous immunoglobulins.
Anti-Iba 1 Antibody	SYSY	234308	Goat Anti-guinea pig IgG) also available. For blocking endogenous immunoglobulins.
Axon Digidata 1440A	USA
Axon MultiClamp 700B Amplifier	USA
BSA Albumin Fraction V	BioFrox	4240GR500	Serum
C57BL/6 mice	Guangdong Medical Laboratory Animal Center
CD11 b/c MicroBeads	Miltenyi	130-105-634
Chloral hydrate	Absin	abs47051394	Widely used as anesthesia in mice
Clampfit 10.6	USA
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 800
Culture medium	Fisher Scientific	C11995500BT	-
DAPI dye	Beyotime	C1002
Electrode puller	Narishige	PC-10
HBSS	Servicebio	G4203
Horizontal shaker	SCILOGEX	SLK-O3000-S
Image analysis software	Fiji
MACS Columns	Miltenyi	130-042-201
MACS Separators	Miltenyi	130-042-102
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	T353-500	Use fresh 4% solution in 1X PBS, pH 7.2-7.4.
Poly-L-lysine	Beyotime	C0313	Coverslip coating
Triton X-100	Sigma	X100