Isolierung und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung von hippokampalen Mikroglia aus adulten Mäusen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie primäre hippocampusale Mikroglia von adulten Mäusen isoliert und gereinigt werden können, gefolgt von Anweisungen zur Durchführung von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen an diesen akut isolierten Zellen.

Zusammenfassung

Mikroglia sind residente Immunzellen im Gehirn, die mit Neuronen interagieren, um die Homöostase des Zentralnervensystems (ZNS) aufrechtzuerhalten. Studien zeigen, dass die Mikrogliaoberfläche Kaliumkanäle exprimiert, die die Aktivierung der Mikroglia regulieren, während Anomalien in diesen Kaliumkanälen zu neuronalen Erkrankungen führen können. Derzeit werden Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von Mikroglia hauptsächlich an kultivierten primären Mikroglia von fötalen oder neugeborenen Mäusen durchgeführt, da es schwierig ist, elektrophysiologische Bewertungen an akut isolierten Mikroglia durchzuführen. In dieser Studie wird ein leicht verständliches Protokoll für die Isolierung von hippokampalen Mikroglia aus adulten Mäusen und die Durchführung von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen an den isolierten Zellen eingeführt. Kurz gesagt, das Gehirn wurde einer Maus nach der Enthauptung entnommen, der Hippocampus wurde bilateral präpariert und Mikroglia wurden mit einem Dissoziationskit für das Gehirn von Erwachsenen isoliert. Die Mikroglia wurden dann mit einer magnetisch aktivierten Zellsortiermethode (MACS) aufgereinigt und auf Deckgläser ausgesät. Die erfolgreiche Isolierung von Mikroglia wurde durch Immunfluoreszenzfärbung mit anti-CD11- und anti-Iba1-Antikörpern bestätigt. Ein Deckglas wurde in eine Aufzeichnungskammer gelegt, und die Ganzzellkaliumströme der akut isolierten Mikroglia wurden unter Voltage-Clamp-Bedingungen aufgezeichnet.

Einleitung

Mikroglia, die von myeloischen Vorläuferzellen im primitiven Dottersack abstammen, sind im ZNS beheimatet und machen etwa 10 % bis 15 % der gesamten Nervenzellen aus ^1,2. Funktionell können Mikroglia nicht nur die lokale Umgebung überwachen, Immunabwehrfunktionen ausführen und^Neuronen ernähren und unterstützen ^3,4, sondern auch direkt mit Neuronen in Kontakt treten, um neuronale Oberflächenrezeptoren und die entsprechende Ligandenbindung zu regulieren, und indirekt über die Sekretion von Zytokinen interagieren⁵. Studien in vitro und in vivo haben gezeigt, dass Mikroglia verschiedene Arten von Kaliumkanälen exprimieren, die zur Aufrechterhaltung des negativen Membranpotentials^{beitragen 6} und die Aktivierung der Mikroglia regulieren. Angesichts der Tatsache, dass abnormale mikrogliale Kaliumkanäle bei verschiedenen Gehirnerkrankungen beobachtet wurden⁷, ist es für Forscher von entscheidender Bedeutung, potenzielle Medikamente zu identifizieren, die auf diese Kaliumkanäle abzielen, und Strategien zur Regulierung der Mikrogliafunktion zu entwickeln.

Traditionelle Verdauungs- und Reinigungsmethoden für Mikroglia verwenden oft das gesamte Gehirn, wodurch die Heterogenität der Mikroglia über verschiedene Gehirnbereiche hinweg übersehen^{wird 8}. In-vitro-Dissoziation und Langzeitkultur in serumhaltigen Medien versetzen Mikroglia in einen aktiven Zustand⁹, der ihre physiologischen Eigenschaften und ihren wahren Zustand möglicherweise nicht genau widerspiegelt.

Während nach außen gerichtete Gleichrichter-Kaliumströme in primär kultivierten Neugeborenen-Mikroglia und Zelllinien¹⁰ aufgezeichnet wurden, können sich die Daten aus Langzeitkulturen von fötalem oder neugeborenem Maus-Hirngewebe von denen reifer Mikroglia unterscheiden. Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, Mikroglia akut zu isolieren und sofort Ganzzellaufzeichnungen von mikroglialen Kaliumströmen unter Verwendung von adultem Maushirngewebe durchzuführen.

Die biochemischen Eigenschaften und Kaliumkanaleigenschaften wurden mit einer Methode untersucht, die für die Isolierung und Reinigung von Mikroglia aus kleinen Geweben geeignet ist 11,12,13,14,15. Daher bietet dieses Protokoll Forschern eine Anleitung, um die biochemischen und funktionellen Eigenschaften von Mikroglia unter physiologischen und Krankheitsbedingungen aufzuklären. Obwohl dieses Protokoll den Hippocampus und die Kaliumkanäle als Beispiele verwendet, kann es auch auf die Untersuchung anderer Gehirnbereiche und elektrophysiologischer Eigenschaften von Kanälen/Zellen angewendet werden.

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Protokoll

Alle Versuche wurden vom Life Science Animal Care and Use Committee der South China Normal University genehmigt und es wurden angemessene Tierschutzstandards eingehalten (ethische Genehmigung: SCNU-SLS-2023-048). Für diese Studie wurden männliche oder weibliche 3-5 Monate alte C57BL/6J-Mäuse verwendet. Die Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung von Lösungen

1. Bereiten Sie 50 ml intrazelluläre Lösung vor, die 160 mM KF, 10 mM HEPES, 10 mM EGTA und 2 mM MgCl₂ enthält. Den pH-Wert mit 1 M KOH-Lösung auf 7,2 einstellen und den osmotischen Druck mit D-Saccharose^13,16 auf 300 mOsm einstellen. Bei -20 °C lagern.
2. Bereiten Sie 50 ml MACS-Puffer (magnetic-activated cell sorting) mit 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in PBS vor.
3. Poly-L-Lysin (PLL) in einer Verdünnung von 1:1000 in Wasser herstellen.
   HINWEIS: Deckgläser sollten am Tag vor dem Experiment mit PLL beschichtet werden. Inkubieren Sie die beschichteten Schlicker über Nacht bei 37 °C. Recyceln Sie PLL am zweiten Tag und trocknen Sie die beschichteten Slips bei 37 °C.

2. Herstellung einer einzelligen Suspension aus Hirngewebe

1. Betäuben Sie die Mäuse mit 2,5% Chloralhydrat (0,15 mL/10 g, i.p.) (nach institutionell anerkannten Protokollen). Das Verschwinden des Hornhautreflexes und des Schmerzreflexes durch Einklemmen der Zehen oder Einklemmen der Haut bei Mäusen bestätigt eine tiefe Anästhesie. Legen Sie die Tiere in Rückenlage auf einen Seziertisch und stecken Sie ihre Gliedmaßen fest.
   1. Die Brust wird freigelegt und das Herz¹⁷ wird mit eiskaltem, sterilem PBS durchblutet, um intravaskuläre zirkulierende Blutzellen zu entfernen. Halten Sie den Kopf fest und schneiden Sie die Haut entlang der Gehirnmittellinie mit einer Schere ein, um den Schädel freizulegen.
   2. Schneiden Sie den hinteren Teil des Schädels beidseitig und zwischen den Augenhöhlen mit einer kleinen Schere ein. Schneide den Schädel entlang der sagittalen Naht ab und entferne den Schädel mit einer Pinzette. Entnehmen Sie das Hirngewebe schnell mit einer Pinzette¹⁷.
2. Legen Sie das Hirngewebe in 10 cm große Kulturschalen mit eiskaltem PBS. Präparieren Sie die Großhirnrinde beidseitig mit einer Pinzette, isolieren Sie das Hippocampusgewebe und schneiden Sie es in kleinere Stücke. Übertragen Sie die Stücke in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Die bilaterale Dissektion der Großhirnrinde zeigt die Sichel des Hippocampusgewebes in beiden Hemisphären des Gehirns.
3. Suspendieren Sie die kleinen Stücke des Hippocampusgewebes in 2 ml eiskalter Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) und zentrifugieren Sie sie 3 Minuten lang bei 300 × g (bei Raumtemperatur), dann entsorgen Sie die HBSS.
4. Geben Sie 1950 μl Enzymmischung 1 in das 15-ml-Zentrifugenröhrchen, das die Hippocampus-Gewebestücke enthält. Schütteln Sie das Zentrifugenröhrchen kontinuierlich in einem 37 °C heißen Wasserbad für 5 min.
   HINWEIS: Enzymmischung 1 ist eine Kombination aus 50 μl Enzym P und 1900 μl Puffer Y, vorgewärmt auf 37 °C (als Teil des im Handel erhältlichen Kits enthalten, siehe Materialtabelle).
5. Nehmen Sie das Zentrifugenröhrchen aus dem Wasserbad. 30 μl der frisch zubereiteten Enzymmischung 2 werden in das 15-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben. Pipettieren Sie die Gewebefragmente 20 Mal mit einer 1-ml-Pipettenspitze auf und ab und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang in einem Wasserbad unter ständigem Schütteln bei 37 °C.
   HINWEIS: Die Enzymmischung 2 ist eine Kombination aus 20 μl Puffer Y und 10 μl Enzym A. Die beiden oben genannten Verdauungsschritte wandeln das Hirngewebe in eine zelluläre Suspension um. Die Gesamtaufschlusszeit sollte 15 Minuten nicht überschreiten.
6. Entfernen Sie das Zentrifugenröhrchen und pipettieren Sie die Suspension mehrmals mit einer 1 mL-Pipette auf und ab, bis keine großen Gewebestücke mehr übrig sind.
7. Filtrieren Sie die Zellsuspension durch einen 70 μm Zellsiebfilter und sammeln Sie das Filtrat in einem sauberen 50 mL Zentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: In diesem Schritt werden große Stücke unverdauten Gewebes entfernt.
8. Das Filtrat in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführen und 10 min lang bei 4 °C 300 × g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand mit einer 1-ml-Pipette.
9. Waschen Sie die Zellsuspension, indem Sie 20 Mal mit 15 mL HBSS auf und ab pipettieren und 10 Minuten lang bei 4 °C 300 × g zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und
   resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml MACS-Puffer.
   HINWEIS: In diesem Schritt wird die einzellige Suspension bereitgestellt, die in nachfolgenden Experimenten verwendet wird.

3. Akute Trennung von Mikroglia

1. 1 ml der einzelligen Suspension in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und 3 Minuten lang bei 4 °C 300 × g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand.
2. Resuspendieren Sie das einzellige Pellet in 90 μl MACS-Puffer. 10 μl CD11b/c-Mikrokügelchen zugeben und die Suspension 15 Minuten lang bei 4 °C auf einem horizontalen Schüttler inkubieren.
3. Stellen Sie die Sortiersäule in das Magnetfeld eines geeigneten MACS-Separators und befeuchten Sie die Säule zweimal mit 500 μL MACS-Puffer.
4. Waschen Sie die einzellige Suspension, indem Sie 1 mL MACS-Puffer direkt in das Röhrchen geben und bei 4 °C 300 × g für 3 min zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand vollständig an.
5. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μl MACS-Puffer.
6. Übertragen Sie die resuspendierte Zellsuspension mit einer 1-mL-Pipette in die Sortiersäule im Magnetfeld. Verwerfen Sie den Durchfluss. Waschen Sie die Säule dreimal mit 500 μl MACS-Puffer, während sie im Magnetfeld verbleibt.
   HINWEIS: Der Durchfluss enthält unbeschriftete Zellen. Die Säule sollte gewaschen werden, ohne sie aus dem Magnetfeld zu nehmen.
7. Entfernen Sie die Sortiersäule aus dem Magnetfeld. Geben Sie 1 mL MACS-Puffer in die Säule und drücken Sie ihn langsam mit dem Kolben durch. Sammeln Sie den Durchfluss.
   HINWEIS: Der Durchfluss enthält die markierten Zellen (d. h. die Mikroglia). Um die Reinheit der Mikroglia zu verbessern, kann der Vorgang mit einer neuen Sortiersäule (optional) wiederholt werden.
8. Säen Sie die ausgewählten Zellen in eine 24-Well-Platte, die ein Deckglas enthält, das mit PLL beschichtet ist. Fügen Sie 200 μl Nährmedium hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten lang in einem 37 °C heißen Inkubator mit 95 % O₂, 5 % CO₂ und 60 % bis 80 % Luftfeuchtigkeit. Dieser Schritt ermöglicht es den Mikroglia, sich an das Deckglas zu heften, um nachfolgende Ganzzell-Patch-Clamp- und Immunfluoreszenz-Experimente durchzuführen.

4. Immunfluoreszenz

1. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus den Plattenvertiefungen und spülen Sie die Zellen dreimal mit 0,1 M PBS auf dem Shaker.
2. Entsorgen Sie das PBS und fixieren Sie die Mikroglia mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei Raumtemperatur (RT) auf dem Deckglas.
3. Entfernen Sie das Fixiermittel und spülen Sie den Deckglas dreimal mit 0,1 M PBS aus.
4. Verwerfen Sie das PBS und permeabilisieren Sie die Zellen mit 200 μl Blockierungspuffer mit 0,2 % Triton X-100 und 5 % BSA in PBS für 1 h bei RT auf dem Schüttler.
5. Inkubieren Sie die Mikroglia mit Blockierungspuffer plus Anti-Iba1- und Anti-CD11b-Primärantikörpern¹⁸ über Nacht bei 4 °C.
6. Am nächsten Tag entfernen Sie die primären Antikörper und spülen Sie den Deckglas dreimal mit PBS at RT auf dem Schüttler aus.
7. Inkubieren Sie die Mikroglia mit dem Blockierungspuffer mit Fluorophor-gekoppelten Sekundärantikörpern für 2 h bei RT. Fügen Sie für die letzten 15 Minuten der Inkubation DAPI-Farbstoff hinzu.
8. Entfernen Sie die Sekundärantikörper und spülen Sie den Deckglas dreimal mit PBS aus. Montieren Sie die Deckgläser für die Bildgebung auf Objektträger.

5. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung von Kaliumströmen in Mikroglia

1. Tauen Sie die intrazelluläre Lösung auf und bewahren Sie sie auf Eis auf.
2. Pflasterpipetten (Elektroden) aus dünnwandigen Borosilikatglaskapillaren mit Hilfe eines vertikalen Abziehers¹⁷ ziehen.
   HINWEIS: Der Elektrodenwiderstand sollte weniger als 10 MΩ betragen.
3. Übertragen Sie ein Deckglas in die Aufnahmekammer und fügen Sie die extrazelluläre Lösung hinzu, die 160 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ und 10 mM HEPES enthält. Den pH-Wert mit 1 M NaOH-Lösung vor der Verwendung auf 7,2 einstellen^13,16 und den osmotischen Druck mit D-Saccharose auf 300 mOsm einstellen.
4. Lokalisieren Sie die kugelförmigen Mikroglia unter einem Wassermikroskop mit dem 40x-Objektiv.
5. Füllen Sie die Elektrode mit intrazellulärer Lösung, befestigen Sie sie an der Verstärkerkopfstufe des Elektrophysiologie-Aufbaus und üben Sie positiven Druck aus. Wechseln Sie zum 4x Objektiv und lokalisieren Sie die Elektrode.
   1. Senken Sie die Elektrode in die Badlösung ab und stellen Sie den Verstärker in den Voltage-Clamp-Modus, um den Membrantest im Badmodus durchzuführen. Wechseln Sie zurück zum 40x Objektiv und bewegen Sie die Elektrodenspitze näher an die Mikroglia.
      HINWEIS: Wenn sich die Elektrodenspitze sehr nahe an einer Mikrogliazelle befindet, sollte der Widerstand leicht ansteigen.
   2. Üben Sie einen winzigen Unterdruck aus, um die Zelle zu halten. Wenn der Widerstand 100 MΩ erreicht, wechseln Sie im Membrantest vom Bad - in den Patch-Modus . Wenn der Widerstand 300 MΩ erreicht, lassen Sie den Unterdruck ab.
   3. Wenn der Widerstand die Bildung einer Gigaohm-Dichtung (d. h. >1 GΩ) zwischen der Elektrode und der Mikrogliamembran anzeigt, wechseln Sie im Membrantest vom Patch - in den Zellmodus .
6. Üben Sie eine kleine Saugmenge aus und lösen Sie einen elektrischen Schlag aus, um die Membran zu zerreißen. Das Auftreten großer kapazitiver Transienten deutet auf einen erfolgreichen Membranbruch hin.
7. Wechseln Sie in den Voltage-Clamp-Modus und öffnen Sie das Aufnahmeprogramm. Kaliumströme für 200 ms aufzeichnen. Um Potentiale zu testen, wenden Sie Spannungsschritte in 20-mV-Schritten von -120 mV bis +40 mV bei 1 Hz an.
8. Analysieren Sie die erhaltenen Daten offline mit geeigneter Software.

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Ergebnisse

Kurz gesagt, der Prozess beinhaltet die Isolierung von hippokampalen Mikroglia aus dem erwachsenen Mausgehirn, gefolgt von der Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung dieser Zellen (Abbildung 1). Das Verfahren beginnt mit der Präparierung des Hippocampus von 3 bis 5 Monate alten erwachsenen C57BL/6J-Mäusen. Konkret wird das gesamte Gehirn nach der Perfusion entnommen und in eine Kulturschale mit eiskaltem PBS gegeben (Abbildung 2A)....

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Diskussion

Kultivierte Mikroglia von fötalen oder neugeborenen Mäusen sind eindeutig ungeeignet für die Untersuchung adulter Mikroglia. Darüber hinaus können Mikroglia, die aus dem gesamten Gehirn isoliert wurden, angesichts der Heterogenität der Mikroglia über verschiedene Hirnareale^{hinweg 21} die Eigenschaften von Mikroglia in einer spezifischen Gehirnstruktur möglicherweise nicht genau repräsentieren. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Isolierung von Mikrogl...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Corning	353003
15 mL Falcon tubes	BD	352096
24-well plates	BD	353047
35 mm Petri dish	Corning	353001	-
50 mL Falcon tubes	BD	352070
70 μm cell screening	Miltenyi	130-095-823	To remove cell clumps before cell sorting
Adult Mouse Brain Dissociation Kit	Miltenyi	130- 107-677
Anti-CD11b Antibody	Bio-Rad	MCA74	Goat Anti-mouse IgG also available. For blocking endogenous immunoglobulins.
Anti-Iba 1 Antibody	SYSY	234308	Goat Anti-guinea pig IgG) also available. For blocking endogenous immunoglobulins.
Axon Digidata 1440A	USA
Axon MultiClamp 700B Amplifier	USA
BSA Albumin Fraction V	BioFrox	4240GR500	Serum
C57BL/6 mice	Guangdong Medical Laboratory Animal Center
CD11 b/c MicroBeads	Miltenyi	130-105-634
Chloral hydrate	Absin	abs47051394	Widely used as anesthesia in mice
Clampfit 10.6	USA
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 800
Culture medium	Fisher Scientific	C11995500BT	-
DAPI dye	Beyotime	C1002
Electrode puller	Narishige	PC-10
HBSS	Servicebio	G4203
Horizontal shaker	SCILOGEX	SLK-O3000-S
Image analysis software	Fiji
MACS Columns	Miltenyi	130-042-201
MACS Separators	Miltenyi	130-042-102
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	T353-500	Use fresh 4% solution in 1X PBS, pH 7.2-7.4.
Poly-L-lysine	Beyotime	C0313	Coverslip coating
Triton X-100	Sigma	X100