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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le protocole actuel décrit comment isoler et purifier la microglie hippocampique primaire de souris adultes, suivi d’instructions pour effectuer des enregistrements de cellules entières sur ces cellules fortement isolées.

Résumé

Les microglies sont des cellules immunitaires résidentes dans le cerveau qui interagissent avec les neurones pour maintenir l’homéostasie du système nerveux central (SNC). Des études montrent que la surface microgliale exprime des canaux potassiques qui régulent l’activation microgliale, tandis que des anomalies dans ces canaux potassiques peuvent entraîner des maladies neuronales. À l’heure actuelle, les enregistrements de microglie sur cellules entières sont principalement effectués sur des microglies primaires cultivées de souris fœtales ou nouveau-nées en raison de difficultés à effectuer des évaluations électrophysiologiques sur des microglies isolées de manière aiguë. Cette étude présente un protocole facile à suivre pour isoler la microglie de l’hippocampe de souris adultes et effectuer des enregistrements de cellules entières sur les cellules isolées. En bref, le cerveau a été retiré d’une souris après la décapitation, l’hippocampe a été disséqué bilatéralement et les microglies ont été isolées à l’aide d’un kit de dissociation du cerveau de souris adulte. Les microglies ont ensuite été purifiées à l’aide d’une méthode de tri cellulaire activé par magnétisme (MACS) et ensemencées sur des lamelles. L’isolement microglial réussi a été confirmé par coloration immunofluorescente avec des anticorps anti-CD11 et anti-Iba1. Une lamelle a été placée dans une chambre d’enregistrement, et les courants potassiques de cellules entières de la microglie gravement isolée ont été enregistrés dans des conditions de pince de tension.

Introduction

Les microglies, qui dérivent des progéniteurs myéloïdes dans le sac vitellin primitif, résident dans le SNC et représentent environ 10 à 15 % des cellules nerveuses totales 1,2. Sur le plan fonctionnel, en plus de surveiller l’environnement local, d’exécuter des fonctions de défense immunitaire et de fournir une nutrition et un soutien aux neurones 3,4, la microglie peut également entrer en contact direct avec les neurones pour réguler les récepteurs de surface neuronale et la liaison des ligands correspondants, et interagir indirectement avec les neurones via la sécrétion de cytokines5. Des études in vitro et in vivo ont démontré que les microglies expriment différents types de canaux potassiques, qui contribuent au maintien du potentiel membranaire négatif6 et régulent l’activation microgliale. Étant donné que des canaux potassiques microgliaux anormaux ont été observés dans diverses maladies du cerveau7, il est crucial pour les chercheurs d’identifier des médicaments potentiels qui ciblent ces canaux potassiques et de développer des stratégies pour réguler la fonction microgliale.

Les méthodes traditionnelles de digestion et de purification de la microglie utilisent souvent l’ensemble du cerveau, ce qui néglige l’hétérogénéité de la microglie dans différentes zones du cerveau8. La dissociation in vitro et la culture à long terme dans des milieux contenant du sérum placent les microglies dans un état actif9, ce qui peut ne pas refléter avec précision leurs caractéristiques physiologiques et leur état réel.

De plus, alors que des courants potassiques redresseurs vers l’extérieur ont été enregistrés dans des microglies primaires de nouveau-nés en culture et des lignéescellulaires 10, les données provenant de cultures à long terme de tissus cérébraux de souris fœtales ou néonatales peuvent différer de celles de microglies matures. Le protocole actuel vise à isoler de manière aiguë la microglie et à effectuer immédiatement des enregistrements de cellules entières des courants de potassium microgliaux à l’aide de tissus cérébraux de souris adultes.

Les propriétés biochimiques et potassiques ont été examinées à l’aide d’une méthode adaptée à l’isolement et à la purification de la microglie à partir de petits tissus 11,12,13,14,15. Par conséquent, ce protocole fournit des conseils aux chercheurs pour élucider les propriétés biochimiques et fonctionnelles de la microglie dans des conditions physiologiques et pathologiques. Bien que ce protocole utilise l’hippocampe et les canaux potassiques comme exemples, il peut également être appliqué à l’étude d’autres zones du cerveau et des propriétés électrophysiologiques des canaux/cellules.

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Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par le Comité de protection et d’utilisation des animaux des sciences de la vie de l’Université normale de Chine méridionale, et des normes appropriées de bien-être animal ont été maintenues (approbation éthique : SCNU-SLS-2023-048). Des souris C57BL/6J mâles ou femelles âgées de 3 à 5 mois ont été utilisées pour cette étude. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont répertoriés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation des solutions

  1. Préparez 50 mL de solution intracellulaire contenant 160 mM de KF, 10 mM de HEPES, 10 mM d’EGTA et 2 mM de MgCl2. Ajustez le pH à 7,2 avec 1 M de solution de KOH et ajustez la pression osmotique à 300 mOsm avec du D-saccharose13,16. Conserver à -20 °C.
  2. Préparer 50 mL de tampon de tri cellulaire activé magnétique (MACS) contenant 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans du PBS.
  3. Préparez la poly-L-lysine (PLL) à une dilution de 1:1000 dans l’eau.
    REMARQUE : Les lamelles doivent être enduites de PLL la veille de l’expérience. Incuber les lamelles enrobées à 37 °C pendant la nuit. Recyclez PLL le deuxième jour et séchez les lamelles enduites à 37 °C.

2. Préparation d’une suspension unicellulaire à partir de tissu cérébral

  1. Anesthésier les souris avec de l’hydrate de chloral à 2,5 % (0,15 ml/10 g, i.p.) (selon les protocoles approuvés par l’établissement). La disparition du réflexe cornéen et du réflexe de douleur en pinçant les orteils ou en pinçant la peau chez la souris confirme une anesthésie profonde. Placez les animaux en position couchée sur une table de dissection et épinglez leurs membres.
    1. Exposez le thorax et perfuser le cœur17 avec du PBS stérile glacé pour éliminer les cellules sanguines circulantes intravasculaires. Tenez la tête et coupez la peau le long de la ligne médiane du cerveau avec des ciseaux pour exposer le crâne.
    2. Coupez l’arrière du crâne bilatéralement et entre les orbites avec de petits ciseaux. Coupez le crâne le long de la suture sagittale et retirez le crâne avec une pince à épiler. Extrayez rapidement le tissu cérébral à l’aide d’une pince à épiler17.
  2. Placez le tissu cérébral dans des boîtes de culture de 10 cm contenant du PBS glacé. Disséquez le cortex cérébral bilatéralement à l’aide d’une pince à épiler, isolez le tissu de l’hippocampe et coupez-le en petits morceaux. Transférez les morceaux dans un tube à centrifuger de 15 ml.
    REMARQUE : La dissection bilatérale du cortex cérébral révèle le croissant de tissu hippocampique dans les deux hémisphères du cerveau.
  3. Remettre en suspension les petits morceaux de tissu de l’hippocampe dans 2 ml de solution saline équilibrée de Hank’s glacée (HBSS) et centrifuger à 300 × g pendant 3 minutes (à température ambiante), puis jeter le HBSS.
  4. Ajouter 1950 μL du mélange enzymatique 1 dans le tube à centrifuger de 15 mL contenant les morceaux de tissu de l’hippocampe. Agitez le tube de centrifugation en continu dans un bain-marie à 37 °C pendant 5 min.
    REMARQUE : Le mélange enzymatique 1 est une combinaison de 50 μL d’enzyme P et de 1900 μL de tampon Y, préchauffé à 37 °C (présent dans le cadre du kit disponible dans le commerce, voir le tableau des matériaux).
  5. Retirez le tube de centrifugation du bain-marie. Ajouter 30 μL de mélange d’enzymes 2 fraîchement préparé dans le tube à centrifuger de 15 mL. Pipetez les fragments de tissu de haut en bas 20 fois avec une pointe de pipette de 1 mL et incubez dans un bain-marie pendant 5 min en agitant continuellement à 37°C.
    REMARQUE : Le mélange enzymatique 2 est une combinaison de 20 μL de tampon Y et de 10 μL d’enzyme A. Les deux étapes de digestion ci-dessus convertissent le tissu cérébral en une suspension cellulaire. Le temps total de digestion ne doit pas dépasser 15 min.
  6. Retirez le tube de centrifugation et pipetez la suspension de haut en bas à plusieurs reprises avec une pipette de 1 ml jusqu’à ce qu’il ne reste plus de gros morceaux de tissu.
  7. Filtrez la suspension cellulaire à travers un filtre de criblage cellulaire de 70 μm et collectez le filtrat dans un tube à centrifuger propre de 50 mL.
    REMARQUE : Cette étape permet d’enlever tous les gros morceaux de tissu non digéré.
  8. Transvaser le filtrat dans un tube à centrifuger neuf de 15 mL et centrifuger à 4 °C, 300 × g pendant 10 min. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 mL.
  9. Laver la suspension cellulaire en pipetant 20 fois de haut en bas avec 15 mL de HBSS et centrifuger à 4 °C, 300 × g pendant 10 min. Jetez le surnageant et
    remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de tampon MACS.
    REMARQUE : Cette étape fournit la suspension unicellulaire utilisée dans les expériences ultérieures.

3. Séparation aiguë de la microglie

  1. Transvaser 1 mL de suspension unicellulaire dans un tube de microcentrifugation de 2 mL et centrifuger à 4 °C, 300 × g pendant 3 min. Jetez le surnageant.
  2. Remettre en suspension la pastille unicellulaire dans 90 μL de tampon MACS. Ajouter 10 μL de microbilles CD11b/c et incuber la suspension à 4 °C pendant 15 min sur un agitateur horizontal.
  3. Placez la colonne de tri dans le champ magnétique d’un séparateur MACS approprié et humidifiez la colonne deux fois avec 500 μL de tampon MACS.
  4. Lavez la suspension unicellulaire en ajoutant 1 mL de tampon MACS directement dans le tube et centrifugez-le à 4 °C, 300 × g pendant 3 min. Aspirez complètement le surnageant.
  5. Remettre la pastille de cellule en suspension dans 500 μL de tampon MACS.
  6. Transférez la suspension de la cellule en suspension dans la colonne de tri dans le champ magnétique à l’aide d’une pipette de 1 mL. Jetez le flux continu. Lavez la colonne trois fois avec 500 μL de tampon MACS pendant qu’elle reste dans le champ magnétique.
    REMARQUE : Le flux contient des cellules non étiquetées. La colonne doit être lavée sans la retirer du champ magnétique.
  7. Retirez la colonne de tri du champ magnétique. Ajoutez 1 ml de tampon MACS à la colonne et poussez-le lentement à travers avec le piston. Récupérez le flux continu.
    REMARQUE : Le flux contient les cellules marquées (c’est-à-dire la microglie). Pour améliorer la pureté de la microglie, le processus peut être répété avec une nouvelle colonne de tri (en option).
  8. Ensemencez les cellules sélectionnées dans une plaque de 24 puits contenant une lamelle recouverte de PLL. Ajouter 200 μL de milieu de culture et incuber pendant 20 min dans un incubateur à 37 °C avec 95 % d’O2, 5 % de CO2 et 60 % à 80 % d’humidité. Cette étape permet à la microglie de se fixer à la lamelle pour des expériences ultérieures de patch-clamp et d’immunofluorescence sur cellules entières.

4. Immunofluorescence

  1. Aspirez le milieu de culture des puits de la plaque et rincez les cellules trois fois avec 0,1 M de PBS sur l’agitateur.
  2. Jeter le PBS et fixer la microglie sur la lamelle avec du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant 20 min à température ambiante (RT).
  3. Retirez le fixateur et rincez trois fois la lamelle avec 0,1 M PBS.
  4. Jetez le PBS et perméabilisez les cellules avec 200 μL de tampon de blocage contenant 0,2 % de Triton X-100 et 5 % de BSA dans du PBS pendant 1 h à RT sur l’agitateur.
  5. Incuber la microglie avec un tampon bloquant et des anticorps primaires anti-Iba1 et anti-CD11b18 pendant une nuit à 4 °C.
  6. Le lendemain, retirez les anticorps primaires et rincez la lamelle trois fois avec du PBS à RT sur l’agitateur.
  7. Incuber la microglie avec le tampon bloquant contenant des anticorps secondaires couplés à des fluorophores pendant 2 h à RT. Ajouter le colorant DAPI pendant les 15 dernières minutes d’incubation.
  8. Retirez les anticorps secondaires et rincez la lamelle trois fois avec du PBS. Montez les lamelles sur les lames de microscope pour l’imagerie.

5. Enregistrement par patch-clamp de cellules entières des courants potassiques dans la microglie

  1. Décongelez la solution intracellulaire et conservez-la sur de la glace.
  2. Tirez des pipettes patch (électrodes) de capillaires en verre borosilicate à paroi mince à l’aide d’un extracteur vertical17.
    REMARQUE : La résistance de l’électrode doit être inférieure à 10 MΩ.
  3. Transvaser une lamelle dans la chambre d’enregistrement et ajouter la solution extracellulaire contenant 160 mM de NaCl, 4,5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2 et 10 mM de HEPES. Ajustez le pH à 7,2 avec une solution de NaOH à 1 M avant d’utiliser 13,16, et ajustez la pression osmotique à 300 mOsm avec du D-saccharose.
  4. Localisez la microglie sphérique au microscope à l’eau à l’aide de l’objectif 40x.
  5. Remplissez l’électrode d’une solution intracellulaire, fixez-la à la tête de l’amplificateur de l’installation d’électrophysiologie et appliquez une pression positive. Passez à l’objectif 4x et localisez l’électrode.
    1. Abaissez l’électrode dans la solution de bain et réglez l’amplificateur en mode pince de tension pour effectuer le test de membrane en mode bain . Revenez à l’objectif 40x et rapprochez la pointe de l’électrode de la microglie.
      REMARQUE : Lorsque la pointe de l’électrode est très proche d’une cellule microgliale, la résistance doit augmenter légèrement.
    2. Appliquez une petite pression négative pour maintenir la cellule. Lorsque la résistance atteint 100 MΩ, passez du mode bain au mode patch dans le test membranaire. Lorsque la résistance atteint 300 MΩ, relâchez la pression négative.
    3. Lorsque la résistance indique la formation d’un joint gigaohm (c’est-à-dire >1 GΩ) entre l’électrode et la membrane microgliale, passez du mode patch au mode cellule dans le test de membrane.
  6. Appliquez une petite quantité d’aspiration et déclenchez un choc électrique pour rompre la membrane. L’apparition de grands transitoires capacitifs indique une rupture membranaire réussie.
  7. Passez en mode pince de tension et ouvrez le programme d’enregistrement. Enregistrez les courants de potassium pendant 200 ms. Pour tester les potentiels, appliquez des paliers de tension par incréments de 20 mV de -120 mV à +40 mV à 1 Hz.
  8. Analysez les données obtenues hors ligne à l’aide d’un logiciel approprié.

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Résultats

En bref, le processus implique l’isolement de la microglie de l’hippocampe du cerveau de souris adulte, suivi d’un enregistrement de ces cellules par patch-clamp de cellules entières (Figure 1). La procédure commence par la dissection de l’hippocampe de souris adultes C57BL/6J âgées de 3 à 5 mois. Plus précisément, le cerveau entier est retiré après la perfusion et placé dans une boîte de culture contenant du PBS glacé (

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Discussion

Les microglies cultivées à partir de souris fœtales ou nouveau-nées ne conviennent clairement pas à l’étude de la microglie adulte. De plus, compte tenu de l’hétérogénéité de la microglie dans différentes zones du cerveau21, la microglie isolée de l’ensemble du cerveau peut ne pas représenter avec précision les caractéristiques de la microglie dans une structure cérébrale spécifique. Ce protocole fournit une méthode pour isoler la microgl...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32170950, 32371065), de la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong, n° 2023A1515010899 et 2021A1515010804.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Petri dishCorning353003
15 mL Falcon tubesBD352096
24-well platesBD353047
35 mm Petri dishCorning353001-
50 mL Falcon tubesBD352070
70 μm cell screeningMiltenyi130-095-823To remove cell clumps before cell sorting
Adult Mouse Brain Dissociation KitMiltenyi130- 107-677
Anti-CD11b AntibodyBio-RadMCA74Goat Anti-mouse IgG also available. For blocking endogenous immunoglobulins.
Anti-Iba 1 AntibodySYSY234308Goat Anti-guinea pig IgG) also available. For blocking endogenous immunoglobulins.
Axon Digidata 1440AUSA
Axon MultiClamp 700B AmplifierUSA
BSA Albumin Fraction VBioFrox4240GR500Serum
C57BL/6 mice Guangdong Medical Laboratory Animal Center
CD11 b/c MicroBeadsMiltenyi130-105-634
Chloral hydrateAbsinabs47051394Widely used as anesthesia in mice
Clampfit 10.6USA
Confocal MicroscopeZeiss LSM 800
Culture mediumFisher ScientificC11995500BT-
DAPI dyeBeyotimeC1002
Electrode pullerNarishigePC-10
HBSSServicebioG4203
Horizontal shakerSCILOGEXSLK-O3000-S
Image analysis softwareFiji
MACS ColumnsMiltenyi130-042-201
MACS SeparatorsMiltenyi130-042-102
ParaformaldehydeFisher ScientificT353-500Use fresh 4% solution in 1X PBS, pH 7.2-7.4. 
Poly-L-lysineBeyotime C0313Coverslip coating
Triton X-100SigmaX100

Références

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