מיקרוביוטה של גני נמלים אטיין: הדמיה של נוף מיקרוביאלי על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים

Summary

אנו מציעים פרוטוקול מיקרוסקופ אלקטרונים סורק אופטימלי להדמיית דגימות הטרוגניות ועדינות ביותר המכילות ביומסה צמחית ופטרייתית, יחד עם מיקרוביוטה וביופילם. פרוטוקול זה מאפשר לתאר את הממדים המרחביים של ארגון המיקרוביוטה.

Abstract

במערכות אקולוגיות בקנה מידה מאקרו, כגון יערות גשם או שוניות אלמוגים, הלוקליזציה המרחבית של אורגניזמים היא הבסיס להבנתנו את האקולוגיה הקהילתית. גם בעולם המיקרוביאלי, מערכות אקולוגיות מיקרובסקליות רחוקות מלהיות תערובת אקראית והומוגנית של אורגניזמים ובתי גידול. גישה להתפלגות המרחבית של מיקרובים היא בסיסית להבנת התפקוד והאקולוגיה של המיקרוביוטה, שכן מינים החיים יחד נוטים יותר לתקשר ולהשפיע זה על הפיזיולוגיה של זה.

מערכת אקולוגית מיקרוביאלית בין-ממלכותית נמצאת בליבה של מושבות נמלים המגדלות פטריות, המגדלות פטריות בזידיומיצט כמשאב תזונתי. נמלים אטין מחפשות מצעים מגוונים (בעיקר צמחיים), עוברים מטבוליזם על ידי הפטרייה המתורבת תוך יצירת מבנה ספוגי, "גן מיקרוביאלי" הפועל כמעי חיצוני. הגן הוא רשת שזורה של קורים פטרייתיים הגדלים על ידי חילוף חומרים של המצע, פתיחת גומחות להקמת מיקרוביוטה אופיינית ומותאמת. המיקרוביוטה נחשבת כתורמת לפירוק המצע ולצמיחת פטריות, אם כי הארגון המרחבי שלה טרם נקבע.

במאמר זה אנו מתארים כיצד אנו משתמשים במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כדי לחקור, בפירוט חסר תקדים, את הארגון המרחבי של המיקרוביוטה והביופילם במערכות שונות של גידול פטריות של נמלים מגדלות פטריות. הדמיית SEM סיפקה תיאור של המבנה המרחבי והארגון של המיקרוביוטה. SEM גילה כי מיקרוביוטה מתאספת בדרך כלל בביופילמים, מבנה נפוץ של נופים מיקרוביאליים בגידול פטריות. אנו מציגים את הפרוטוקולים המשמשים לתיקון, ייבוש, ייבוש, ציפוי מרזב ודימוי קהילה כה מורכבת. פרוטוקולים אלה הותאמו להתמודדות עם דגימות עדינות והטרוגניות, הכוללות ביומסה של צמחים ופטריות, כמו גם המיקרוביוטה והביופילם.

Introduction

מערכות אקולוגיות מורכבות מאורגניזמים המחוברים ביניהם על ידי תהליכים במיקום גיאוגרפי מסוים (כלומר, הסביבה). אורגניזמים מתקשרים עם סביבתם לאורך זמן, ומהם נוצרים דפוסים מרחביים מורכבים והטרוגניים. תבניות מרחביות קובעות את המגוון והיציבות האקולוגיים, ובסופו של דבר, את תפקוד המערכת האקולוגית 1,2,3,4. במערכות אקולוגיות בקנה מידה מאקרו, כגון ביצות, סוואנות, שוניות אלמוגים ומערכות אקולוגיות צחיחות, דפוסים מרחביים מתואמים עם זרימת משאבים וריכוז. התרת אופטימיזציה של משאבים, הטרוגניות מרחבית ודפוסים מביאים למערכות אקולוגיות עמידות יותר מאשר מערכות הומוגניות². הלוקליזציה המרחבית של אורגניזמים העומדת בבסיס האקולוגיה הקהילתית מתורגמת גם לעולם המיקרוביאלי.

מערכות אקולוגיות מיקרוביות, רחוקות מאורגניזמים המעורבבים באופן אקראי והומוגני ברחבי מיקרו-בתי גידול, מציגות תבניות מרחביות המגדירות חלק ניכר מתפקודן ^5,6,7. מעמודות וינוגרדסקי ועד מיקרוביוטה הקשורה לסביבה ולפונדקאי, מערכות אקולוגיות אלה מאורגנות באופן הטרוגני בחלל, עם סידורים מרחביים המעוררים תגובות פנוטיפיות שונות. מינים החיים יחד נוטים יותר לתקשר ולהשפיע זה על הפיזיולוגיה של זה. לפיכך, הארגון המרחבי הקהילתי, יותר מהרכבו כשלעצמו, תוחם תכונות מערכת אקולוגית ונישות אקולוגיות ^5,7,8. להמחשת מושגים אלה, שינויים בדפוסים מרחביים נראים מתואמים עם התקדמות פתולוגית של פלאקים דנטליים, עששת, מחלות חניכיים ^9,10, מחלות מעי דלקתיות¹¹, דלקות ריאה של סיסטיק פיברוזיס, זיהומים כרוניים בפצעים^12,13, סרטן המעי הגס והחלחולת ואדנומות¹⁴.

תחת ההיקף של ביוגאוגרפיה מיקרוביאלית (חקר התפלגות המגוון הביולוגי ודפוסים על פני מרחב וזמן בקנה מידה מיקרוביאלי), הידע של מערכות אקולוגיות מיקרוביאליות מועיל במידה רבה על ידי הבנת הדפוסים המרחביים שלהם 6,13,15,16,17. בחנו דפוסים מרחביים של מערכת אקולוגית מיקרוביאלית הבנויה על ידי חרקים, הנמצאת בליבה של נמלת אטין כריזמטית המגדלת פטריות (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae: Attini: Attina). שם שוכן "גן מיקרוביאלי", שבמרכזו פטריית בזידיומיצט בשבט Leucocoprinae (Basidiomycota: Agaricaceae) או במשפחה Pterulaceae (Basidiomycota: Agaricales)18,19,20,21,22. הגן הוא מבנה ספוגי הבוקע מרשת שזורה של קורים שגדלה על-ידי חילוף חומרים של המצע הצמחי ברובו ששולבו על-ידי הנמלים (איור 1). אלה עשויים לכלול, על פי סוג האטין: חלקי צמחים יבשים, פרשים ופגרים של חרקים, עלים טריים, זרעים וחלקי פרחים^23,24. בדומה למעי אוכל-עשב חיצוני, הגינה ממירה באופן אנזימטי וכימי פולימרים סרבנים למשאבים תזונתיים חיוניים, ומספקת לנמלים חומצות אמינו חיוניות, שומנים וסוכרים מסיסים 21,25,26,27,28.

ניתוחים אולטרה-מבניים, אנזימטיים ושעתוק שבוצעו עבור גנים מהסוגים Atta ו-Acromyrmex החותכים עלים מצביעים על כך שסביבות אלה מבנות רצף של התפרקות המצע וטלאים תזונתיים 26,29,30,31,32. חלקים צעירים של הגן נוטים להיות כהים יותר בשל מצע טרי ששולב לאחר שפוצל. מצעים אלה שנוספו לאחרונה מאוכלסים לעתים קרובות מהקצוות, שנחתכו על ידי עובדי נמלים וחוסנו בגושי תפטיר. קורים פטרייתיים, המוקרנים מקצוות חתוכים, מתפשטים על המצע 29,32,33. השפע ההיפאלי עולה ככל שהשפלת המצע מתקדמת, וכתוצאה מכך אזורים לבנבנים ופעילים מטבולית 30,31,32. אזורים ישנים יותר, עם מצע מפורק יותר ומיקרוביוטה שופעת^29,32, נוטים להציג גוונים חומים ולחות גבוהה יותר. העובדים מסירים שברים מאזור זה, ומפרידים אותם בערימות פסולת, שם הם גם לוקחים מצעים הפוגעים בסימביונט הפטרייתי 34,35,36. ערימות פסולת, למרות שהן מנותקות פיזית מהגינה, הן נקודה של התפרקות מתמשכת של המצע ומחזור חומרי מזון על ידי המיקרוביוטה השופעת של התושבים 29,32,37,38,39.

מיקרוביוטה המורכבת בעיקר מאנטרובקטר, קלבסיאלה, פנטואה, פסאודומונאס וסרטיה, מאכלסת גם היא את הגן, ככל הנראה משותפת למערכות פטריות אטיניות מגוונות. קידוד מסלולים מטבוליים שיכולים להשלים מטבוליזם פטרייתי, המיקרוביוטה עשויה להשתתף בתגובות הפיזיולוגיות של הגן 40,41,42,43,44^. לא רק שנתונים מטאגנומיים הצביעו על כך שהמיקרוביוטה הייתה שם^41,42, אלא גם ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) של פטריות נמלים חותכות עלים הראה בעיקר חיידקים בצורת מוט מעל מצע צמח³². אף על פי שחיידקים (כולל זנים צלולוליטיים) בודדו מכל הגן, הם הודגמו רק בחלקים ישנים יותר של הגן ובערימות פסולת, כמו גם בגלולה הראשונית שנישאה על ידי מלכות המייסדים^29,32. כמו כן, לא היה בטוח אם המיקרוביוטה יכולה ליצור ביופילמים in vivo (כלומר, בגינה ובפסולת), כפי שהוצע על ידי היכולת המטבולית שלהם⁴² ונצפה במבחנה⁴⁴.

כאן, השתמשנו ב- SEM כדי להבין עוד יותר את הארגון המרחבי של המיקרוביוטה ברחבי אזורי הגנים, תוך פירוט אינטראקציות פיזיות של מיקרוביוטה-מצע ומיקרוביוטה-קורים. על ידי מתן תמונות עם עומק מוקד גדול יותר, SEM מאפשר תצפיות של מבנים מיקרוסקופיים תלת ממדיים ברזולוציה גבוהה, המאפשר ניתוח מעמיק של דפוסי המיקרוביוטה המרחבית של הגן. אנו מפרטים שלבים לתיקון, ייבוש, ייבוש, התזה של הפרווה ותמונה של דגימות הטרוגניות ועדינות כאלה המבוססות על פטריות. על ידי הסרת שלב הפוסט-קיבוע באמצעות אוסמיום טטרוקסיד (OsO₄) והפחתת זמן ההתייבשות, פישטנו את הפרוטוקולים 32,33,45 להכנת דגימות גינה ופסולת לניתוח SEM. פרוטוקול מותאם זה משמר דפוסים מבניים היפאליים, כמו גם את הארגון המרחבי של המיקרוביוטה והביופילם, וניתן ליישם אותו במערכות אקולוגיות מיקרוביאליות עדינות אחרות ובביופילמים.

איור 1: גנים מיקרוביאליים של אטין. הגן הוא מבנה דמוי ספוג הנובע מרשת שזורה של קורים הגדלה על ידי חילוף חומרים של המצע הצמחי ברובו המשולב על ידי הנמלים. בגן שוכנת גם המיקרוביוטה, המקודדת מסלולים מטבוליים שיכולים להשלים את חילוף החומרים הפטרייתי. נתונים מטאגנומיים וניתוחים קודמים של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק הצביעו על נוכחותו, אם כי היה לנו ידע מועט על הארגון המרחבי שלו ועל האינטראקציות הפיזיות שלו עם המצע וקורי הפטרייה. השתמשנו ב-SEM כדי לחשוף את הארגון המרחבי והתבניות של המיקרוביוטה והביופילם. איורים מאת מריאנה ברקוטו (גינה ומיקרוביוטה שאומצו מברקוטו ורודריגז ⁹⁴), ותצלומים מאת מריאנה ברקוטו ואנצו סורנטינו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

1. דיגום מושבות שדה

הערה: בעת איסוף מושבות נמלים, יש לוודא כי כל ההרשאות הנדרשות על פי החקיקה המקומית מתקבלות לפני האיסוף. במקרה שלנו, היתר האיסוף #74585 הונפק על ידי Instituto Chico Mendes de Conservação e Biodiversidade (ICMBio). כאשר הדגימות מגיעות ממושבת מעבדה, עבור לסעיף 2.

1. איתור וסימון המושבה. חפרו תעלה המקיפה את אזור הקן עד לחשיפת חדר הגן (איור 2A).
   הערה: חלק ממיני האטין עשויים לבנות את מושבותיהם מתחת לפסולת העלים או בתוך בולי עץ רקובים. במקרים כאלה, בזהירות לסובב את המלטה או בזהירות לשבור את יומני לאיסוף הדגימות. למידע מפורט על איתור, איסוף ותחזוקה של מושבות חיות של מיני נמלים אטיניים מגוונים, ראו Sosa-Calvo et ^al.46.
2. פתחו את תא הגינה לרוחב כדי למנוע מהאדמה ליפול על משטח הגינה. אספו בזהירות דגימות גינה באמצעות מלקחיים אנטומולוגיים, כף או רחפן מטבח, בהתאם לגודל הגינה.
   הערה: הקפד לעקר את הכלים לפני האיסוף. בעת איסוף גינות נמלים חותכות עלים, יש ללבוש כפפות בד עבות כדי למנוע (או לפחות להחליש) עקיצות עובדים. עבור מינים אחרים של אטין כפפות בד הן אופציונליות.
3. מעבירים את דגימות הגינה לנמען פלסטיק נקי המכיל שכבת טיח לאיזון לחות הגינה. לאחר העברת עובדי הגינה והנמלים, סגרו הרמטית את הנמען כדי למנוע ייבוש דגימה. אחסנו דגימות גינה בטמפרטורה של 23-25 מעלות צלזיוס עד לעיבוד.
4. סגור את התעלה עם אדמה שהוסרה בעבר.

איור 2: פרוטוקול הכנת מדגם. (א) דגימה של מושבות שדה. (B) עיבוד דגימה. (ג) יסודות קצרים וזרימת עבודה להכנת הדגימה: 1. קיבוע: לחיזוק ושימור מבנה המדגם. 2. התייבשות: תכולת המים של הדגימות מוחלפת באתנול. 3. ייבוש נקודה קריטית: CO₂ נוזלי מחליף אתנול ומתאדה. 4. הרכבה: המדגם מוצג לניתוח. 5. ציפוי מרזב בזהב: למנוע טעינת דגימה. 6. הדמיה. איורים וצילומים מאת מריאנה ברקוטו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. ריאגנטים

הערה: זכור כי יש להכין מראש את הפתרונות הבאים.

1. הכינו מאגר נתרן קקודילט 0.2 מ'. לשם כך, להמיס 42.8 גרם של נתרן cacodylate ב 800 מ"ל של מים מזוקקים, תוך ערבוב עד המסה וייצוב pH ב 7.2 (אם נדרש, להתאים pH באמצעות חומצה הידרוכלורית). לפצות את נפח התמיסה ל 1 L על ידי הוספת מים מזוקקים. אחסן את התמיסה ב 4 ° C (למשך ~ חודש אחד).
   אזהרה: גלוטראלדהיד ופרפורמאלדהיד רעילים ויש לטפל בהם בתוך מכסה אדים. ללבוש כפפות ניטריל משקפי מגן כל הזמן בעת טיפול ריאגנטים כאלה.
2. הכינו את הקיבוע של קרנובסקי (שונה מקרנובסקי)⁴⁷. לשם כך, להוסיף 10 מ"ל של 25% תמיסה מימית גלוטראלדהיד ו 10 מ"ל של 20% תמיסה מימית paraformaldehyde ל 25 מ"ל של 0.2 M נתרן cacodylate חיץ ולערבב. הוסף 1 מ"ל של 0.1 M סידן כלורי (CaCl₂) והשלם את הנפח ל 100 מ"ל על ידי הוספת מים מזוקקים. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4°C (עד חודש אחד).
   אזהרה: הקיבוע של קרנובסקי מזיק בשאיפה ועלול לגרום לגירוי בעור ובעיניים. לכן, הימנע נשימה אדים, באמצעות רק בחוץ או באזור מאוורר היטב. יש ללבוש כפפות ניטריל ומשקפי מגן כל הזמן בעת הטיפול בתמיסה.
3. באמצעות אתנול מוחלט (כיתה אנליטית), להכין 30%, 50%, 70%, ו 90% אתנול תמיסות במים מזוקקים; 100% אתנול נדרש גם.

3. קיבוע לדוגמה

הערה: מקבעים מקשיחים ומשמרים דגימות, תוך שמירה על תכונות מורפולוגיות. אלדהידים (כגון פרפורמאלדהיד וגלוטראלדהיד) הם מקבעים לא קרישה מסוג קישור צולב, הגורמים לקשרים צולבים בתוך ובין חלבונים וחומצות גרעין⁴⁸.

1. הוציאו פועלים, ביצים, גלמים וזחלים מדגימות הגינה באמצעות מלקחיים אנטומולוגיים (איור 2B). יש להפריד בין שברי גינה שגודלם אינו עולה על 5 מ"מ³. הוסיפו את השברים לצינור בנפח 2 מ"ל (איור 2C).
2. לצינורות המכילים את הדגימות, השתמש פיפטה זכוכית פסטר כדי להוסיף ~ 1 מ"ל של פתרון קיבוע Karnovsky (ודא שהדגימה מכוסה לחלוטין). ערבבו על-ידי תסיסה עדינה כדי לעזור לדגימה להשרות ולדגור בטמפרטורה של 4°C במשך 24 שעות לפחות לפני המשך עיבוד הדגימה (איור 2C.1).
   הערה: כאשר שלבי ההתייבשות הבאים לא יבוצעו מיד לאחר הקיבוע, הפרוטוקול עשוי להיות מושהה בשלב זה, ודגימות עשויות להיות מאוחסנות במשך ~1 שנה ב 4 ° C.
   אנו ממליצים להשתמש בפיפטה מזכוכית פסטר, מכיוון שהיא מורכבת מחומר אינרטי וקל יותר לנקות אותה לשימוש חוזר לאחר מכן. חומר הגינה הוא הידרופובי מאוד, נוטה לצוף על פני השטח של התמיסה המקבעת. זה בדרך כלל לוקח עד 5 דקות כדי להיות ספוג לחלוטין fixative. יש לוודא שהקיבוע מכסה את שברי הגינה מכיוון שנפחו נוטה להצטמצם ככל שהוא נכנס לנקבוביות הדגימה. וידאנו אמפירית שלאחר שהדגימה הושרה ונרטבה, מרכיביה (בפרט, התפטיר הפטרייתי העדין) הפכו רגישים להתנפצות כאשר ערבבו אותה עוד יותר. לכן, אנו ממליצים להימנע ככל האפשר מטלטול הדגימות.

4. התייבשות מדגם

הערה: סדרת שטיפת האתנול מחליפה בהדרגה את המים בדגימות לאתנול. חשוב להתחיל עם תמיסת אתנול בריכוז נמוך (ראה להלן) כדי למנוע נזק מוגזם או קריסה של דגימות עדינות כאלה⁴⁹.

1. הסירו לחלוטין את הפתרון המקבע של קרנובסקי באמצעות פיפטה מזכוכית, תוך זהירות שלא לשבש את הדגימה (איור 2C.1).
   הערה: יש להשליך את הקיבוע של קרנובסקי במושתל המסומן כראוי לטיפול בשאריות כימיות רעילות.
2. מיד לאחר הסרת הקיבוע, הוסיפו 1 מ"ל של אתנול 30%, נזהרו לא לשבש את הדגימה, ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (איור 2C.2).
   הערה: דוגמאות צריכות תמיד להיות ספוגות בתמיסה. הקפידו להחליף במהירות תמיסות במהלך סדרת השטיפה ההדרגתית של אתנול. כאשר הגן מאבד את ההיבט הנקבובי שלו ומצטבר בתחתית הצינור, 1 מ"ל אתנול נוטה להספיק כדי לכסות את הדגימה (כאשר הדגימה אינה גדולה מ -5 מ"מ³). עם זאת, אם הדגימות אינן מכוסות לחלוטין, להוסיף אתנול עד הדגימה מכוסה לחלוטין.
3. לחלוטין להסיר 30% אתנול עם פיפטה זכוכית, נזהר לא לשבש את המדגם. יש להשליך 30% אתנול כראוי.
   הערה: עבור כל סדרת השטיפה ההדרגתית של אתנול, יש להשליך אתנול לנמען שסומן כראוי לטיפול בשאריות כימיות רעילות.
4. מוסיפים 1 מ"ל אתנול 50% ודגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לחלוטין להסיר 50% אתנול עם פיפטה זכוכית, נזהר לא לשבש את המדגם. יש להשליך 50% אתנול כראוי.
5. מוסיפים 1 מ"ל של 70% אתנול ודגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לחלוטין להסיר 70% אתנול עם פיפטה זכוכית, נזהר לא לשבש את המדגם. יש להשליך 70% אתנול כראוי.
   הערה: בשלב שטיפת אתנול 70%, המשתמש רשאי להשהות את הפרוטוקול במידת הצורך, מכיוון שצינורות דגימה עשויים להיות מאוחסנים למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס, כאשר החומר לא יעובד באופן מיידי.
6. מוסיפים 1 מ"ל של 90% אתנול ודגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר לחלוטין 90% אתנול עם פיפטה זכוכית, נזהר לא לשבש את המדגם. יש להשליך 90% אתנול כראוי.
7. מוסיפים 1 מ"ל של 100% אתנול ודגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לחלוטין להסיר 100% אתנול עם פיפטה זכוכית, נזהר לא לשבש את המדגם. יש להשליך 100% אתנול כראוי.
8. בעזרת מלקחיים ו/או מרית, העבירו בזהירות את הדגימות למיכלי הדגימה של מייבש הנקודות הקריטיות (CPD), המכילים תוויות זיהוי דגימה (שיוצרו בעבר בנייר ועיפרון). כדי למנוע ייבוש דגימות, העברה זו מתבצעת עם המיכל ממוקם בצלחת פטרי מכוסה 100% אתנול.
9. הניחו את המכסים על המיכלים וטבלו אותם בכוס זכוכית מדורגת המכילה 100% אתנול מספיק כדי לטבול את המיכלים. מכסים את הזכוכית ודגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר; ואז כראוי להשליך 100% אתנול.
10. העבירו את מיכלי הדגימה לכוס זכוכית מדורגת אחרת המכילה מספיק אתנול 100% כדי לטבול את המיכלים. מכסים את הזכוכית ודגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר; לאחר מכן, העבירו את מיכלי הדגימה למייבש הכביסה Critical Point.
    הערה: לאחר סדרת הכביסה, פיפטות זכוכית וכוסות יש לשטוף בשפע במים מזוקקים, ואת שאריות המים האלה יש להשליך במקבל המסומן כראוי לטיפול בשאריות כימיות רעילות. לאחר השטיפה, ניתן לשטוף פריטי זכוכית בחומר ניקוי ניטרלי, לשטוף במי ברז ולייבש באוויר.

5. ייבוש נקודה קריטית

הערה: מייבש כביסה Critical Point מחליף את האתנול בדגימות בפחמן דו-חמצני נוזלי (_CO2), שמתאדה מהדגימה בטמפרטורה ולחץ גבוהים יותר. פעל בהתאם להוראות היצרן עבור הליכים אלה.

1. הפעל את הציוד.
2. פתחו את התא, הניחו את מיכלי הדגימה בתוכו והוסיפו 100% אתנול עד שהוא מכסה את המיכלים. סגור את החדר.
3. הפעל את האפשרות קירור והמתן עד שהטמפרטורה תגיע ל -10 מעלות צלזיוס.
4. פתח את שסתום צילינדר CO₂ והפעל את האפשרות Stirrer .
5. הפעל את CO₂ באפשרות , תמיד לבדוק את התא כדי לוודא כמה CO₂ כבר מילא אותו. כאשר התא כמעט מלא, בטל את האפשרות CO₂ ב והפעל את אפשרות Exchange , תוך שמירה על הפעלתו עד שיהיה מספיק CO₂ רק כדי לכסות את המיכלים. ודא שהמכולות מכוסות תמיד ב- CO₂ (כלומר, בטל את אפשרות Exchange לפני שכל CO₂ עזב את התא). חזור על שלב 5.5 6x.
6. הפעל CO₂ בפעם האחרונה ומלא את התא עד שהמכלים מכוסים.
7. הפעילו את האפשרות 'חימום' ובטלו את האפשרות 'בוחש'. סגור את שסתום צילינדר CO₂.
8. המתן עד שהטמפרטורה תעלה ל 35 °C (75 °F); לאחר מכן, הפעל את האפשרות יציאת גז .
   הערה: בסביבות 30 מעלות צלזיוס, התא מגיע ללחצים של 70-80 בר, ומשיג את הנקודה הקריטית, שבה הנוזל נעלם.
9. כאשר לחץ התא מגיע לבר אחד, כל תכולת הגז הוסרה. פתח את התא והסר את המיכלים.
10. כבה את הציוד.

6. הרכבה

1. הכינו מחזיקי דגימות SEM (כלומר, גבעולי אלומיניום; איור 2ג.4).
   1. עטפו את הגבעולים בחתיכת רדיד אלומיניום, המכסה רק את החלק העליון, כדי להקל על ניקוי הגבעולים לאחר הניתוח.
   2. זהה את הספסלים על ידי כתיבת קוד / מספר לדוגמה בתחתית המחזיק, הבטחת זיהוי של מה ממוקם על גבי.
   3. מכסים את החלק העליון בסרט פחמן דו-צדדי. הניחו את הגבעולים במחזיק דגימה.
2. פתחו את מכסה מיכל הדגימה, והעבירו בזהירות את הדגימה המיובשת לצלחת פטרי מזכוכית באמצעות מלקחיים ומרית.
   הערה: גינות קריטיות מיובשות בנקודה נוטות להצטבר וליצור דגימות צפופות מאוד שיש להפריד בזהירות כשברים בגודל שאינו עולה על 1 מ"מ³.
3. מניחים בזהירות שברים על המשטח הדביק של הספח המכוסה בסרט. ברגע שקטע הגינה נוגע בקלטת, קשה מאוד להזיז אותו (מחדש), לכן היזהרו לא למקם אותו במקומות או בתנוחות לא רצויות. הוסיפו עד תשעה שברים לכל גיבוב.
4. חזור על שלבים 6.2 ו- 6.3 עבור כל דגימה.

7. ציפוי מרזב בזהב

הערה: ציפוי הדגימה נדרש כדי למנוע את טעינתה. עקוב אחר הוראות היצרן להתאמת הגדרות כגון לחץ גז הפעולה (0.5 × 10-1 מ"מ כספית של לחץ גז בפרוטוקול זה), זמן הגמגום (220 שניות), עובי שכבת הזהב (~ 120 Å), הזרם (50 mA) ואספקת המתח. גמגום נוטה לעקוב אחר זרימת עבודה משותפת, אם כי הציוד של יצרנים שונים עשוי לפעול מעט אחרת.

1. פתחו את זרוע המטרה בעלת הצירים והניחו את הגבעולים על שולחן הדגימות.
2. סגרו את זרוע המטרה בעלת הצירים ובדקו אם מגן הרסיסים של תא ואקום הזכוכית מוטבע כראוי.
3. פתח את שסתום צילינדר הארגון והפעל את מתג ההפעלה הראשי.
4. עקוב אחר הוואקום העולה בתצוגת הציוד עד שהוא מגיע לסימן 0.5 × ^10-1 מ"מ כספית בתצוגה; לאחר מכן, הפעל את שטיפה. חזור על הפעולה 5x.
5. הפעל את מערכת זרימת המים, הפעל את האפשרות HV On ופתח את מכסה סרט הזהב. אשר כי צבע הפלזמה הוא ורדרד. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, הגדר 220 שניות של התזה עם מתח של 50 mA, אשר יפקיד שכבת זהב של ~ 120 Å (12 ננומטר).
6. HV מופעל כבוי באופן אוטומטי. כבה את מערכת זרימת המים וסגור את מכסה סרט הזהב.
7. כבה את מתג ההפעלה הראשי, ואפשר לאוויר להיכנס לתא הוואקום. עבור דגימות גינה ואשפה, חזור על שלבים 7.1-7.7 3x.
   הערה: אם ההדמיה לא תתרחש מיד לאחר הכנת הדגימה, אחסנו את הגבעולים במיכל הרמטי מלא בשכבת סיליקה כדי למנוע התייבשות של הדגימות.

8. הדמיה

הערה: בצע את הוראות היצרן לכוונון הגדרות SEM, כגון קוטר צמצם אובייקטיבי, מתח הפעלה, יישור מערכת קרן האלקטרונים, יישור צירית וסטיגמטורים.

1. הניחו את הספסלים במחזיק הדגימה, ורשמו הערות על מיקום כל דגימה.
   הערה: יש ללבוש כפפות בעת הכנסה או הסרה של מחזיק הדגימה, ולשמור על המחזיק נקי ככל האפשר.
2. הפעל את תוכנת הפעולה משולחן העבודה.
3. בחר את הגדרות המכשיר. דמיינו דגימות גינה בקוטר צמצם אובייקטיבי של 30 מיקרומטר (כלומר, בשלב השני), הפועלות בוואקום גבוה, איתור אותות מאלקטרונים משניים (SED), מתח תאוצה של 20 קילו וולט, מרחק עבודה של 15 - 20 מ"מ, זרם בדיקה של 40.0 (במצב זרם גבוה), ושינוי ההגדלה בהתאם לדגימה.
4. בהתאם להוראות הניווט, לחץ על סמל פתח האוורור והמתן לאוורור תא הדגימה. מד התקדמות מציין את מצב הוואקום.
5. כאשר הגיע ללחץ אטמוספרי, פתח את תא הדגימה והכנס בזהירות את מחזיק הדגימה.
6. סגור בעדינות את דלת התא ולחץ על סמל Evac כדי לפנות את המכשיר, בהתאם למצב הוואקום דרך סרגל ההתקדמות. מערכת הניווט תציג את מיקום השלב הנע ותספק גרף מחזיק בעת השלמת המעבר. לחץ על סמל המצלמה כדי להקליט תמונה של המחזיק כדי לקבל תצוגה עליונה שתסייע לנווט בין דגימות בזמן ההדמיה.
7. לחץ על סמל התצפית כדי להפעיל את אקדח האלקטרונים והמתן עד להיווצרות התמונה. השתמש בממשק המשתמש הידני (בקרה ידנית) כדי להזיז ידנית את ציר Z לגובה המתאים (בהתבסס על גובה הדגימה ומרחק העבודה שנקבע).
   הערה: להארכת חיי חוט הטונגסטן, השהה את פונקציית התצפית בכל פעם שאינה מבצעת הדמיה פעילה.
8. השתמש באפשרויות המוצגות על המסך או בפקד הידני כדי לשנות את קצב הרסטר ואת מיקום התמונה. הזז את הבמה כדי לקבל תצוגה מעמיקה של הדגימה, תוך שימוש בפונקציה RDC כדי להתמקד באזורים ספציפיים. כאשר מתבוננים במבנה מטרה (או מבנה מעניין), התאימו את ההגדלה, המיקוד, הבהירות, הניגודיות והסטיגמה בהתאם. תקן סטיגמה באמצעות ממשק המשתמש הידני כדי להזיז את הבמה לכיווני X ו- Y.
   1. התאם את ההגדלה בין 100x ל- 700x כדי להמחיש היבטים כלליים של הגן (כגון צפיפות hyphal, מצע ודפוסי התיישבות).
   2. התאימו את ההגדלה בין 700x ל-1,500x כדי להמחיש את הדפוסים המרחביים של המיקרוביוטה.
   3. התאימו את ההגדלה בין 1,500x ל-3,000x כדי לצפות באינטראקציות הפיזיות של המיקרוביוטה והביופילם.
   4. התאימו את ההגדלה בין 3,000x ל-4,000x כדי להתמקד בצבירי חיידקים ספציפיים.
9. כדי לשמור תמונה, השתמש בפונקציה Freeze , לחץ על סמל התמונה והגדר את נתיב הקובץ. כסטנדרט, נתח לפחות שלושה שברי גן, הדמיה כל אחד בכל טווחי ההגדלה המוזכרים בשלב 8.8. התוצאה היא לפחות 12 תמונות לדגימה, אם כי תמונות רבות יותר עשויות לתמוך בתיאורים מפורטים יותר. אנו מציעים כי 15-25 תמונות לדגימה, הנעות בין כל ההגדלות בשלב 8.8 נוטות לספק פרטים עדינים לתיאור המדגם.
   הערה: הוספת רסטר ושמירה של תמונה אורכת מספר שניות שבמהלכן יש להימנע מכל רטט בשולחן הצף של SEM.
10. לאחר סיום ההדמיה, לחץ על האפשרות פתח אוורור כדי לאוורר את התא, בהתאם למצב הוואקום דרך מד ההתקדמות. הסר בזהירות את המחזיק, סגור בעדינות את דלת התא ולחץ על Evac כדי לפנות את החדר.
11. מיד עם השלמת הפינוי, צא מתוכנת ההפעלה.
12. התאם את הבהירות והניגודיות כדי לשפר את התצוגה החזותית באמצעות עורך תמונות.

תוצאות

כאן, הצגנו פרוטוקול פשוט כדי להמחיש את המרכיבים של דגימות גינת אטין ופסולת, כגון קורים פטרייתיים, מצע, מיקרוביוטה וביופילמים. SEM שיפר את ההבנה שלנו לגבי האופן שבו הגינה והפסולת מפיגמים את התבניות המבניות של המיקרוביוטה (איור 3). בגינות אטיניות, קורים פטריי?...

Discussion

SEM משתמש בקרן אלקטרונים כדי לסרוק את הדגימה, ויוצר תמונה מוגדלת שלה כך שניתן לדמיין מיקרו-מבנים תלת מימדיים ברזולוציה גבוהה. מכיוון ש- SEM פועל תחת ואקום גבוה, נדרשת הסרה של עד / יותר מ -99% מהמים מהדגימות. בתוך תא ואקום SEM, דגימות לחות חלקית עלולות להתייבש ולקרוס, מלבד פיזור אל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL tube	Axygen	MCT-200-C-BRA	To fix and dehydrate samples
Calcium chloride anhydrous	Merck	C4901	CaCl2 anhydrous to prepare Karnovsky’s fixative
Critical point dryer	Leica	EM CPD 300	For critical point drying
Double Sided Carbon Conductive Tape, 12 mm (W) X 5 M (L)	Electron Microscopy Sciences	77819-12	For mounting samples
Entomological forceps	No specific supplier		To manipulate garden samples
Ethyl alcohol (=ethanol), pure (≥99.5%)	Sigma-Aldrich	459836	For dehydration
Forceps	No specific supplier		To manipulate garden samples
Glass beaker	No specific supplier		For dehydration
Glass Petri dish	No specific supplier		To manipulate garden samples
Glass pipette	No specific supplier		To fix and dehydrate samples
Glutaraldehyde (Aqueous Glutaraldehyde EM Grade 25%)	Electron Microscopy Sciences	16220	To prepare Karnovsky’s fixative
Gold target	Ted Pella, Inc.	8071	To sputter coat with gold
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	320331	For adjusting solutions pH
Image editor	Photoshop	any version	To adjust images
Paraformaldehyde (Paraformaldehyde 20% Aqueous Solution EM Grade)	Electron Microscopy Sciences	15713	To prepare Karnovsky’s fixative
Propilene recipient	No specific supplier		For maintaining alive ant colonies
Scanning Electron Microscope	JEOL	IT300 SEM	For sample imaging
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	C0250	For preparing sodium cacodylate buffer
Spatula	No specific supplier		To manipulate garden samples
Specimen containers with 15 mm dia. x 10 mm high	Ted Pella, Inc.	4591	For critical point drying
Sputter coater	Baltec	SCD 050	To coat with gold
Stub (Aluminium mount, flat end pin) 12.7 mm x 8 mm	Electron Microscopy Sciences	75520	For mounting samples