שינוי אנזימטי והערכת ציטומטריית זרימה של חלבונים המוצגים על פני השטח של שמרים

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במצעים המוצגים על פני השטח של שמרים לבדיקות שינוי אנזימטיות. הפלטפורמה הודגמה באמצעות ניתוח פעילות הדפוספורילציה של טירוזין פוספטאז SHP-2 כנגד אחד המצעים שלו כבדיקת שינוי אנזימטי מייצגת.

Abstract

תצוגת משטח שמרים היא אסטרטגיית קישור גנוטיפ-פנוטיפ המאפשרת סינון תפוקה גבוהה של תפקוד החלבון. באופן מסורתי, תצוגת פני השטח של שמרים יושמה על האבולוציה של חלבוני קישור חדשים, כאשר ציטומטריית זרימה משמשת להערכה ומיון לפי רמות חוזק קשירה. לאחרונה, יש עניין גובר ביישום תצוגת פני שמרים לסינון שינויים אנזימטיים של גרסאות סובסטרט, עם שינויים תוספים (למשל, זרחון) או חיסור (למשל, פרוטאוליזה) המספקים פנוטיפ הניתן לקריאה על ידי ציטומטריית זרימה. שינויים כאלה מיושמים באופן קבוע באמצעות לוקליזציה תוך-תאית, אך היכולת להשיג שינוי אנזימטי חוץ-תאי של מצעים מוצגים יכולה לפתוח תגובות רבות נוספות לחקירה. כאן, אנו מתארים טכניקות לתכנון ויישום מבחני סינון לשינוי אנזימטי חוץ-תאי למצעים מועמדים המוצגים על פני השמרים והערכה לאחר מכן באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה. אנו מספקים פרוטוקולים אלה בהקשר של מצעים מוצגים של שמרים זרחניים המכילים שאריות טירוזין זרחניות ומגיבים כיצד ניתן להתאים את המסגרת המיושמת הזו לפיתוח מבחני סינון עבור זוגות אנזימים-סובסטרט אחרים.

Introduction

הבנת האינטראקציות בין אנזימים למטרותיהם הפכה לתחום מחקר מעניין יותר ויותר בשל נחיצותה באפיון הביולוגי של המסלולים השולטים בהומאוסטזיס תאי ובהתפתחות מחלות ^1,2. אנזימים אחראים לקטליזה של רבות מהתגובות השומרות על החיים הביולוגיים, ושולטים במסלולים נחוצים כגון חילוף חומרים תאי ^3,4, איתות 5, ואפילו תהליכים בסיסיים כמו תיקון גנום ^6,7. בשל תפקידם בתהליכים אלה, האינטראקציות ביניהם ממלאות תפקיד גם בהתפתחות מחלות רבות, שכן סטיות בפעילותן עלולות לגרום לחוסר ויסות חמור בפעילות התאים, ולגרום לאפופטוזיס או לשגשוג של תאים סרטניים מזיקים². לחקר הפעילות האנזימטית היו יישומים חשובים בפיתוח טיפולים חדשים ^8,9, הדורשים בדיקות המותאמות לכל אינטראקציה ספציפית של אנזים-סובסטרט¹⁰. מבחנים אנזימטיים מרובים נקבעו כפרוטוקולים סטנדרטיים להערכה ואפיון של אינטראקציות אלה. בדיקות שפותחו לניתוח אינטראקציות אנזימטיות מסווגות למבחני זיהוי המנטרים את הקישור להפעלה/עיכוב¹¹ או מבחנים המנטרים את שינוי הסובסטרט על ידי אנזימים¹².

תפקיד עיקרי אחד של אנזימים הוא ויסות התנהגות התאים. העברת אותות, התגובה התוך-תאית של תא לטריגר חוץ-תאי¹³, אחראית להישרדות התא ולתפקודו. התפשטות תאים, התמיינות ותהליכים תפקודיים רבים אחרים כוללים כולם מסלולי איתות עם אינטראקציות אנזימטיות השולטות בהם^14,15. אנזימים מזרזים שינויים לאחר התרגום, אשר לעתים קרובות מווסתים את רשתות האיתות המסיביות האחראיות להעברה נכונה של מסרים חוץ-תאיים¹⁶. זרחון חלבון הוא השינוי הנפוץ ביותר לאחר התרגום, בכל מקום באיתות תאים ובמספר מסלולים תאיים אחרים. כתוצאה מכך, חלבון קינאזות התגלו כחלק משמעותי מהמטרות הטיפוליות הפוטנציאליות בשל תפקידם הרגולטורי הקריטי¹⁷. פוספטאזים הם המולקולות המווסתות הטבעיות עבור קומפלקסי איתות תאים מבוססי פוספט^18,19, בעלי יכולת להסיר שאריות פוספט מחלבוני המטרה שלהם²⁰. בעשור האחרון, פוספטזים הפכו למטרה טיפולית עיקרית לטיפול בסרטן²¹ ומחלות דלקתיות²² בהתבסס על מעורבותם בוויסות מסלולי איתות במורד הזרם בסוגי תאים מרובים. יחד, חלבון קינאז ופוספטאזות מספקים מגוון רחב של אינטראקציות, שניתן לחקור באמצעות פיתוח פרוטוקולי בדיקה אנזימטיים ספציפיים.

תצוגת משטח שמרים שימשה ככלי לאפיון והערכה של פעילות אנזימטית^23,24. הוא מספק פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה לסינון תהליכי שינוי לאחר תרגום בשילוב עם אסטרטגיות קיבוע רשתית אנדופלזמית^25,26. זה מאפשר לזוגות קינאז-סובסטרט להיות ממוקמים ולשמור ברטיקולום האנדופלזמי באמצעות קשירה לקולטני KDEL²⁷, כאשר זרחון של המצע יכול להתרחש בקצב מוגבר עקב הקרבה בין קינאזות למטרותיהם. קשירת קולטן KDEL מתווכת על ידי רצף שימור רשתית אנדופלזמית FEHDEL C-terminal שהוכח כבעל יכולת שימור חזקה יותר מרצפי HDEL אחרים^25,28. לאחר מכן, המצע הזרחני מעוגן למשטח השמרים לצורך הערכתו לאחר מכן באמצעות ציטומטריית זרימה²⁹. נכון לעכשיו, לא נקבעו פרוטוקולים הניתנים להכללה לשינוי אנזימטי של מצעים המוצגים על פני השמרים. אנו מרחיבים את היכולות של תצוגת פני השטח של שמרים על ידי ניצול גרסאות המצע הזרחני המתבטאות מחוץ לתאים ושינוים באמצעות דה-פוספורילציה על ידי הפוספטאז הידוע שלהם. ניתוח ציטומטריית זרימה מספק פלטפורמה להערכה פנוטיפית של המצעים הנ"ל באמצעות מדידת שינויים בחציון הזרחן כתוצאה מהדגירה עם הפוספטאז הידוע. זה מספק שיטה ניתנת להתאמה לשינוי לאחר תרגום של חלבונים המוצגים על פני השטח תוך מתן שיטה לניתוח שינוי אנזימטי של אינטראקציות בעת שימוש בפלטפורמת תצוגת משטח השמרים.

אנו מציגים טכניקות לפיתוח ויישום של מבחן שינוי אנזימטי המתאר הכנסת אינטראקציה של קינאז-סובסטרט לפלטפורמת תצוגת פני השטח של השמרים, הדגירה המשותפת של המצע הזרחני המתבטא עם פוספטאז רקומביננטי, והניתוח שלאחר מכן של פעילות הדפוספורילציה באמצעות ציטומטריית זרימה. בדוח זה, זה מושג על ידי לוקליזציה משותפת של התחום הציטופלזמי של CD28 עם לימפוציטים קינאז (LCK) ברטיקולום האנדופלזמי של השמרים, ואחריו הצגת ה-CD28 הזרחני על פני השמרים ודפוספורילציה לאחר מכן על ידי הומולוגיה של Src אזור 2 המכיל פוספטאז-2 (SHP-2). נוגדן פאן אנטי-פוספוטירוזין (במחקר זה, 4G10), המזהה שאריות טירוזין זרחני במגוון רחב של רצפי פפטידים, משמש לכימות רמת הזרחן כפונקציה של טיפול בפוספטאז. התהליך המפורט מספק גישה הניתנת להכללה לחקירת אינטראקציות אנזים-סובסטרט; דרך פרוספקטיבית לחקור אנזימים ומצעים בצורה מטוהרת.

Protocol

1. גידול תאים של שמרים המכילים פלסמיד ואינדוקציה של ביטוי חלבון

1. בהתאם למתכון המתואר בטבלה 1, הכינו את המדיה הנדרשת לגידול שמרים שאינם מכילים פלסמיד (YPD), גידול תאי שמרים המכילים פלסמיד (SD-CAA) ואינדוקציה של ביטוי חלבון (SRG-CAA) כמו גם צלחות SD-CAA.
2. הפוך DNA פלסמיד של תצוגת שמרים המכילים את זוג מצע הקינאז לתאי שמרים EBY-100 בשיטה מבוססת קטיון ליתיום^30,31, המאומצת בדרך כלל לשימוש בערכות טרנספורמציה של שמרים ממגוון יצרנים.
   הערה: ניתן להשתמש באלקטרופורציה³² או בטכניקות טרנספורמציה מועדפות אחרות של פלסמיד שמרים בהתאם למבנה הפלסמיד שעובר טרנספורמציה.
3. הכן צינור תרבית של 14 מ"ל עם 10 מ"ל של מדיה YPD. יש לחסן תאי EBY-100 ולגדול באינקובטור רועד בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, 300 סל"ד עד שהתרבית מגיעה לצפיפות אופטית (OD_600nm) של 0.8-1.0 (8 x 10⁶- 1 x 10⁷ תאים/מ"ל).
   הערה: OD_600nm נמדד על ידי הכנת קובטות דגימה של 3 מ"ל המכילות דילול של 1:10 של תרביות שמרים במדיה שלהן ו-3 מ"ל קובטות ריקות המכילות את המדיה המשמשת לדילול דגימה. תוכנית OD_600nm בספקטרופוטומטר משמשת למדידה תחילה של הקובטה הריקה, ולאחר מכן כל קובטה דגימה על ידי הגדרת הדילול המתאים שהוכן עבור כל דגימה. 1 OD_{600 ננומטר} מתאים ל-1 × 10⁷ שמרים/מ"ל.
4. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה של התרבית ב-1,000 x גרם למשך 3 דקות, ושטפו עם תמיסת^{הכביסה הראשונה} המסופקת בערכת טרנספורמציה של שמרים, או TE (10 מ"מ Tris-HCl ו-1.0 מ"מ EDTA)³¹.
5. גלולה את התאים שוב ב-1,000 x גרם למשך 3 דקות והשעו מחדש ב-1 מ"ל של מאגר הטרנספורמציה המסופק בערכת טרנספורמציה של שמרים, או מים סטריליים. יש לחלק את התאים ל-50 מיקרוליטר וניתן לאחסן אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים.
6. לצורך טרנספורמציה של פלסמיד, מכינים מנה אחת לכל פלסמיד ומופשרים על קרח, ולאחר מכן, 0.5-1.5 מיקרוגרם של DNA פלסמיד המכיל את מבנה תצוגת השמרים מתווסף ישירות לתאים. מתווסף 0.5 מ"ל מתמיסת הטרנספורמציה המסופקת בערכת טרנספורמציה של שמרים, או 0.5 מ"ל של 50% פוליאתילן גליקול סטרילי ותמיסת LiOAc^{0.1 M 31}. שלב היטב את תערובת התאים, ה-DNA של הפלסמיד ותמיסת הטרנספורמציה על ידי פיפטינג.
7. דגירה של תערובת טרנספורמציה באופן סטטי למשך 30-60 דקות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, תערובת מערבולת במרווחים של 15 דקות. קציר תאים על ידי צנטריפוגה בחום של 1,000 × גרם למשך 3 דקות.
8. הכן צינור תרבית של 14 מ"ל עם 4.5 מ"ל של מדיה SD-CAA. השעו מחדש את התאים המכילים את הפלסמיד הרצוי ב-500 מיקרוליטר של SD-CAA וחסן את 4.5 מ"ל המוכן.
9. היזהר לא לנקב את האגר, פזר 50 מיקרוליטר מתוך 5 מ"ל של תרבית מחוסנת על צלחת SD-CAA ודגר סטטית ב-30 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות כדי לקבוע את יעילות הטרנספורמציה.
10. דגרו את 5 מ"ל תרבית התאים SD-CAA בחממה רועדת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, 300 סל"ד למשך 18 שעות לפחות. עקוב אחר הצפיפות האופטית (OD_600nm) לאחר 16 שעות ו-20 שעות. לאחר שהדגימה גדלה לצפיפות אופטית מספקת שאינה עולה על 6, צנטריפוגה את התרבית למשך 3 דקות ב-2,500 × גרם. השליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור השמרים.
11. השעו מחדש את כדור השמרים ב-SRG-CAA ל-OD סופי_{של 600 ננומטר} פחות מ-1 (<1 × 10⁷ שמרים/מ"ל).
12. דגרו את תרבות השמרים בחממה רועדת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, 300 סל"ד למשך 8 שעות לפחות אך לא יותר מ-24 שעות.
    הערה: אינדוקציה של ביטוי חלבון בתאי שמרים יכולה להיות מגוונת בכל מקום בין 20-37 מעלות צלזיוס. 30 מעלות צלזיוס מתאים לסינתזה של זוגות קינאז/סובסטרט^29,33 אך ניתן לכוונן אותו במידת הצורך עבור החלבונים הספציפיים הנחקרים.
13. מדוד OD_600nm כדי לקבוע את צפיפות התא.
    הערה: ניתן להפסיק את הפרוטוקול בשלב זה על ידי אחסון תרביות השמרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

2. ביוטינילציה של נוגדן 4G10 נגד פוספוטיזין

1. השעו בקבוקון של 2 מ"ג של PEG4-NHS-ביוטין לריכוז סופי של 5 מ"מ על ידי הוספת 680 מיקרוליטר של PBS סטרילי.
   הערה: השעיה מחדש של PEG4-NHS-ביוטין צריכה להיעשות טרי מיד לפני ביצוע תגובת הביוטינילציה. NHS עובר הידרוליזה בתמיסה מימית. השימוש ב-PBS ובבקבוקונים סטריליים חשוב להכנת ריאגנטים לאחסון לטווח ארוך ולשימוש במבחנים מבוססי תאים כדי להפחית את ההשפעות הפוטנציאליות של מזהמים על כדאיות הריאגנטים או הבדיקות הרגישות המבוצעות.
2. בהתבסס על ריכוז הנוגדנים 4G10, הוסף 100 מיקרוגרם נוגדן לבקבוקון סטרילי של 1.7 מ"ל.
3. הוסף 1 מיקרוליטר של 5 מ"מ PEG4-NHS-ביוטין משלב 2.1 לבקבוקון המכיל 100 מיקרוגרם של נוגדן 4G10 כדי להשיג יחס מולארי של ביוטין לנוגדנים של 7.5:1. פיפטו את התערובת בעדינות כדי להומוגני את התגובה.
4. דגרו את התגובה בטמפרטורת החדר עם סיבוב קבוע למשך שעתיים לפחות.
5. עקוב אחר פרוטוקול היצרן עבור עמודות התפלה ספין של 0.5 מ"ל כדי להחליף את המאגר מה-4G10 הביוטיניל (B-4G10) ל-PBS.
   הערה: עמודות התפלה עם חיתוך משקל מולקולרי (MWCO) של 7 kDa משמשות בדרך כלל לביוטינילציה של נוגדנים כדי לאפשר הסרת ביוטין ומולקולות קטנות אחרות שלא הגיבו תוך שמירה על הנוגדן הגדול יותר.
6. יש לדלל את הנוגדן B-4G10 לריכוז סופי של 1 מיקרומטר ב-PBSA (PBS עם 1 גרם/ליטר אלבומין בסרום בקר). יש לצרף את הנוגדן B-4G10 לנפחים קטנים יותר כדי למנוע מחזורי הקפאה/הפשרה חוזרים ונשנים.
   הערה: ניתן לאחסן נוגדנים ביוטיניים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש יומיומי עד 3 חודשים מבלי לאבד יעילות משמעותית. אחסן את שאר המינונים שאינם בשימוש בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך שנתיים לכל היותר.

3. דה-פוספורילציה של מצעים המתבטאים על פני תא השמרים

1. הכן את פתרון מאגר העבודה פי 2 כפי שתואר קודם לכן בספרות³⁴.
   הערה: מומלץ פי 2 כדי להקל על מדידת המרכיבים הדרושים.
2. הכן את מאגר העבודה עבור הדגימות בבקבוקון של 1.7 מ"ל על ידי דילול תמיסת החיץ 2x שהוכנה בשלב 3.1 1:2 במים נטולי יונים.
   הערה: נפח התגובה הכולל עבור כל דגימה יהיה 20 מיקרוליטר, וכל דגימה תדרוש בין 10 מיקרוליטר ל-18 מיקרוליטר של מאגר עבודה. הכן מספיק מאגר עבודה עבור כל הדגימות או הבקרות.
3. בעקבות הכנת הדגימה המומלצת המתוארת בטבלה 2, סמן בקבוקונים של 1.7 מ"ל עם שם הבקרה או המדגם המתאים.
4. בהתבסס על OD_600nm שנמדד בשלב 1.9, חשב את נפח התרבית הדרוש לשחזור שני מיליון (2 × 10⁶) תאי שמרים מתרבית השמרים המתאימה עבור כל דגימה.
5. הוסף את נפח תרבית השמרים שחושב בשלב הקודם לבקבוקון של 1.7 מ"ל עבור כל דגימה.
6. צנטריפוגה את הבקבוקון למשך דקה אחת במשקל 4,500 × גרם. הסר בזהירות את הסופרנטנט באמצעות מיקרופיפטה והשליך כפסולת מסוכנת ביולוגית.
7. השעו מחדש את התאים הגלולים ב-1 מ"ל של PBSA וחזרו על שלב 3.6.
   הערה: חשוב להסיר כמה שיותר סופרנטנט מבלי להפריע לתאים הגלולים.
8. בהתבסס על ריכוז המלאי שלו, חשב את נפח ה-SHP-2 האנושי הרקומביננטי הנדרש לריכוז סופי של 1,000 ננומטר בנפח תגובה כולל של 20 מיקרוליטר.
   הערה: יש לצטט SHP-2 רקומביננטי בכמויות קטנות כך שכל חלבון המשמש בכל בדיקה לא עבר יותר משני מחזורי הקפאה-הפשרה. יש להשליך כל שאריות SHP-2 מאליקוט לאחר שכל הדגימות הוכנו לבדיקה.
   ריכוזי המלאי של אנזימים רקומביננטיים יכולים להשתנות בהתאם למספר האצווה. SHP-2 רקומביננטי מנוסח בדרך כלל בריכוז מלאי של 0.2-0.4 מ"ג/מ"ל. עבור ריכוז מלאי של 0.324 מ"ג/מ"ל SHP-2, זה מתאים לריכוז מלאי של 4.696 מיקרומטר (ל-SHP-2 יש משקל מולקולרי של 69 kDa). 4.26 מיקרוליטר ממלאי SHP-2 בתגובה של 20 מיקרוליטר מביא לריכוז תגובה סופי של 1,000 ננומטר SHP-2.
9. הוסף 7.7 מ"ג DTT ל-10 מ"ל מים נטולי יונים שהוכנו בחרוט של 15 מ"ל ליצירת תמיסת DTT של 5 מ"ל. אם מגבלות הציוד מקשות על שקילת מיליגרם, הוסף 0.77 גרם DTT ל-10 מ"ל מים נטולי יונים, ולאחר מכן בצע דילול של פי 100 כדי ליצור את פתרון ה-DTT של 5 מ"מ המשמש לבדיקה.
   הערה: ניתן להכין את תמיסת ה-DTT בתמיסות מלאי בריכוז גבוה יותר לדילול ל-5 מ"מ אם לא ניתן למדוד כמויות בקנה מידה של מיליגרם באמצעות הציוד הזמין. יש להכין תמיסת DTT טרייה לפני השעיית התאים במאגר עבודה בשל נטייתו להידרוליזה, מה שהופך אותו לבלתי יציב לאורך תקופות ארוכות כאשר הוא מדולל במים.
10. השעו מחדש את התאים הגלולים במאגר העבודה שהוכן בשלב 3.2 כך שנפח התגובה הסופי בכל דגימה או בקרה יהיה 20 מיקרוליטר.
    הערה: יש לחשב את כמות מאגר העבודה שנוספה על סמך כמות ה-DTT (2 μL) ו-SHP-2 (המחושבת בשלב 3.8) שתהיה בכל דגימה.
11. הוסף 2 μL של תמיסת DTT של 5 mM שהוכנה בשלב 3.9 לכל דגימה או בקרה לריכוז תגובה סופי של 0.5 mM DTT.
12. הוסף את נפח SHP-2 המחושב בשלב 3.8 לכל דגימה לנפח סופי של 20 מיקרוליטר וערבב בעדינות באמצעות מיקרופיפטה.
13. עטפו את מכסי בקבוקון הדגימה בפרפילם כדי למנוע דליפה או זיהום צולב.
14. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים על רוטור במהירות קבועה.
15. הסר דגימות מהרוטור ועצור את התגובה על ידי הוספת 1 מ"ל PBSA לכל דגימה.
16. חזור על שלב 3.6.

4. תיוג תאים וניתוח ציטומטריית זרימה של מצעים דה-זרחניים

1. השעו מחדש דגימות משלב 3.16 בתערובת של 20 מיקרוליטר של הריאגנטים הראשוניים המתאימים להם כמתואר בטבלה 2. דגירה של דגימות למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: כל ריכוזי הריאגנטים המשמשים חושבו כמוגזמים ביחס למספר החלבונים המתבטאים על פני תאי השמרים. החישוב מניח ביטוי של 10,000 חלבונים לתא מכל 2 x 10⁶ שמרים בדגימה³⁵, כאשר באופן שגרתי רק ~50% מהם עושים זאת. טבלה 3 מציגה את יחס ריאגנט התיוג העודף עבור כל אחד מהריאגנטים המבוטאים בטבלה 2, מחושב באופן הבא:
   
2. דגימות צנטריפוגות ב-4,500 × גרם למשך דקה אחת והשליכו את הסופרנטנט כפסולת ביולוגית מסוכנת.
3. שטפו תאים פעם אחת על ידי השעיה של 1 מ"ל של PBSA. חזור על שלב 4.2.
4. השעו מחדש דגימות בתערובת של 20 מיקרוליטר של הריאגנטים המשניים המתאימים להם כמתואר בטבלה 2. דגירה של דגימות למשך 15 דקות בהיעדר אור.
5. חזור על שלב 4.2.
6. חזור על שלב 4.3.
7. השעו מחדש את הדגימות השטופות ב-300-500 מיקרוליטר של PBSA והעבירו לצינורות פוליסטירן של 5 מ"ל כדי לנתח מיד באמצעות ציטומטר זרימה מתאים.
   הערה: אם יש צורך להעביר דגימות, שמור על קרח רטוב. זה לא מומלץ, אך ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לכל היותר ככדורים רטובים.
8. לאחר ביצוע ההפעלה וההכנה הדרושים של הציטומטר לניסוי חדש, לחץ על כפתור ניסוי חדש בתפריט קובץ , תן שם לניסוי ולחץ על שמור כדי להבטיח שהנתונים שנרכשו יישמרו בנתיב הקובץ הרצוי.
9. בחר בסמל תרשים הנקודות בסרגל הכלים העליון כדי ליצור שתי עלילות נקודות או יותר עבור כל דגימה שתרוץ. עבור אחד מעלילות הנקודות, בחר את שם ציר ה-X כדי להציג את ערוץ FSC-A ואת שם ציר ה-Y כדי להציג את ערוץ SSC-A. תרשים זה מציג את אזור פיזור הצד - שטח לעומת פיזור קדימה - ומשמש לשער תאי שמרים לניתוח נוסף.
10. בתרשים נקודות אחר, בחר את שם ציר ה-X כדי להציג את הערוץ שבו המגיב המשני המכוון לנוגדני תג האנטי-אפיטופ העיקריים זוהר. בחר את שם ציר ה-Y כדי להציג את הערוץ שבו המגיב המשני של סטרפטווידין זוהר. תרשים זה יציג רק את האירועים המגודרים מהצד לעומת עלילת הפיזור קדימה כתאי שמרים ומשמשת להצגת זרחון טירוזין על ציר ה-Y וביטוי פני השטח של המצע על ציר ה-X.
    הערה: המגיב המשני המכוון לנוגדנים העיקריים של תג האנטי-אפיטופ פלואורסצס בערוץ FITC (AF-488) והמגיב המשני סטרפטווידין פלואורסצס בערוץ AF-647 בדוגמה זו. הערוצים המשמשים עשויים להשתנות בהתאם לריאגנטים הראשוניים והמשניים המשמשים במהלך התיוג.
11. הנח כל צינור דגימה במחזיק הצינור של הציטומטר ובחר הפעל עבור הציטומטר כדי להתחיל לטעון את הדגימה ולרכוש נתונים. התאם אירועים להצגה, אירועים להקלטה, זמן להקלטה וקצב זרימה לדוגמה לפי הצורך.
12. הגדר שער המקיף את תאי השמרים הבריאים בתרשים SSC-A לעומת FSC-A שנוצר בשלב 4.9. איור 1 ממחיש ייצוג תיאורי של אסטרטגיית השער שיש ליישם.
    הערה: בתרשים SSC-A לעומת FSC-A, 100,000 אירועים להצגה ו-50,000 אירועים לתיעוד בתוך שער השמרים המוגדר הוא הנחיה טובה להמחשה ואיסוף נתונים מספיקים להמשך ניתוח. ניתן ליישם אסטרטגיות שער מחמירות יותר לבחירה עבור שמרים בודדים על סמך עלילה של גובה פיזור קדימה לעומת אזור פיזור קדימה כפי שדווח לאחרונה³⁶. אסטרטגיית השער המוצגת באיור 1 תואמת לגישה פחות מחמירה, כולל סינגלט וכמה שמרים כפולים דרך שער פיזור.
13. רשום פלואורסצנטיות של כל דגימות הבקרה באמצעות מנתח ציטומטריית זרימה. דגימות בקרה נאספות תחילה באופן שגרתי כדי לסייע בהגדרת אסטרטגיית שער, כמתואר להלן בשלב 4.14.
14. הגדר אסטרטגיית שער עבור החלקה שלך שנוצרה בשלב 4.10 לפני ניתוח דגימות מטופלות. איור 1 ממחיש ייצוג תיאורי של אסטרטגיית השער שיש ליישם.
15. רשום פלואורסצנטיות של דגימות דה-זרחניות באמצעות ציטומטר הזרימה ואסטרטגיית השער המוגדרת בשלבים 4.12 ו-4.14.
16. לנתח נתוני זרימה ציטומטרית שנרכשו באמצעות תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה.
17. הערך את הדפוספורילציה על ידי מדידה והשוואה של חציון ציר ה-Y של תאים המבטאים חלבון על פני השטח שלהם והזרחון הבסיסי המסופק על ידי תאים שאינם מציגים בין דגימות לבקרות. חשב את הפרש הזרחן החציוני באחוזים באופן הבא:
    

תוצאות

ניתוח ציטומטריית זרימה משכפול בודד של מערכת המודל שלנו מודגר במשך שעתיים ללא (איור 1A) ועם (איור 1B) SHP-2 1,000 ננומטר חושף הפרש זרחון חציוני של 63.6%, המוגדר כיחס בין חציון ציר Y (זרחון) מכל האירועים המוצגים על פני השטח פחות אות הזרחן הבסיסי המוגדר כחציון ציר ה-Y של האירועים הלא מוצגים בין הדגימה המטופלת לבקרה הלא מטופלת כמתואר במשוואה מוגדר בפרוטוקול שלב 4.12. לפני ניתוח החציונים, הדגימות היו מגודרות על סמך גודלן (פיזור קדימה) ומורכבותן (פיזור צדדי) כדי להקיף קבוצת תאים בריאה. בתנאים המוגדרים, ניתן להבחין בדפוספורילציה של הדגימה לעיני כל (איור 1C).

הבדיקה מוגדרת על ידי הליך פשוט המורכב מארבע שיטות עיקריות (איור 2A). מערכת תצוגת משטח השמרים בה אנו משתמשים ופרסמנו בעבר מבוססת על פלסמיד המכיל מקדם דו-כיווני עם יכולת ביטוי השראה בו זמנית של זוג קינאז-סובסטרט המורכב מהזנב הציטופלזמי של CD28 והטירוזין קינאז LCK (איור 2B)²⁹. לוקליזציה משותפת של החלבונים המתורגמים מכוונת על ידי רשתית אנדופלזמית המכוונת לפפטיד אות והשינוי שלאחר התרגום שנכפה על ידי זמן שהייה מוגבר הנובע מרצף שימור ER מסוף C. הפרשת המצע הזרחני המאוחה ל-Aga2p מובילה לביטוי פני השטח (איור 2C). המצע מתוכנן להיות מוקף בשני תגי אפיטופ, המאפשרים אישור חוץ-תאי של תרגום מוצלח וביטוי פני השטח לאחר מכן. הדגירה של המצע המציג תאי שמרים עם הפוספטאז המעניין (במקרה זה, טירוזין פוספטאז SHP-2) מאפשרת ניתוח של שינוי אנזימים באמצעות ירידה בפוספט הקשור למצע (איור 2D).

למרות שהוגדרו תנאים אופטימליים למערכת המודל המוצגת, יכולת ההכללה של הבדיקה מאפשרת לנתח גיוון של החלבונים. התנאים האופטימליים לבדיקה הוגדרו באמצעות סדרה של טיטרציות שבהן שילובים שונים של זמן וריכוז פוספטאז הוערכו בריבוע (איור 3). הנתונים שנותחו הוכיחו מובהקות סטטיסטית באמצעות ANOVA דו-כיווני עם שכפול (p < 0.05). התנאים שנבחרו של שעתיים ו-1,000 ננומטר (48.8% ±-10%) הציעו הבדל זרחון חציוני של כ-50% תוך שמירה על מובהקות סטטיסטית בהשוואה למקבילו של 750 ננומטר בשעתיים (p < 0.05) בהתבסס על ניתוח מבחן t עם שונות לא שווה. מבחן ה-t גם לא גילה הבדל משמעותי מהתוצאה של 2 שעות ו-1,000 ננומטר על ידי הגדלת הזמן בשעה אחת תחת כל אחד מהריכוזים שסיפקו אחוז הפרש זרחון חציוני משוער (p > 0.05 עבור 500 ננומטר, 750 ננומטר ו-1,000 ננומטר ב-3 שעות).

ניתוח פוסט הוק של Tukey HSD מגלה שכל ההשוואות הממוצעות בין תקופות הדגירה בכל הריכוזים שונות באופן משמעותי מלבד שעה עד שעתיים. כאשר משווים את הריכוזים המרובים שנבדקו, אנו רואים רק הבדלים ממוצעים מובהקים סטטיסטית כאשר משווים 250 ננומטר לכל הריכוזים האחרים, מה שמצביע על כך שצפויות רמות דומות של פעילות פוספטאז בתוך קבוצות, למעט 250 ננומטר. למרות שצפינו בהבדל של 20% כאשר הדגימות טופלו ב-4 שעות ו-1,000 ננומטר SHP-2 (22.1% ±-5.5%), בהשוואה לתנאים האופטימליים (מבחן t, p <-0.05), החלטנו לא להמשיך בשילוב זה עקב ביטוי פני שטח מופחת ובריאות שמרים מופחתת מהדגירה הארוכה עם DTT. אנו משערים שזה נגרם על ידי תנאי ההפחתה של המאגר העובד, הדרוש לתפקוד תקין של SHP-2 פוספטאז.

איור 1: ניתוח ציטומטריית זרימה של מערכת המודל. תרשימי צפיפות המציגות פיזור קדימה (ציר X) לעומת שער פיזור צדדי (ציר Y) (משמאל) ותרשימי נקודות המציגות ביטוי פני השטח באמצעות תיוג תג אפיטופ מסוף C של מצע (ציר X) לעומת זרחון מצע (ציר Y) (מרכז) של תחום ציטופלזמי CD28 מודגר למשך שעתיים (A) ללא SHP-2 ו-(B) עם הריכוז האופטימלי של SHP-2 המוגדר כ-1,000 ננומטר. Y-Median נמדד בתוך השערים המוגדרים המקיפים תאים מבוטאים על פני השטח (ירוק) רק כמדידת זרחון יחסית. אירועי אות שאינם מציגים היו מגודרים כדי להגדיר את מדידת ה-Y-חציון הרקע (אפור). (C) שכבת-על של תרשים נקודות של דגימות המציגות הפרש ראייה ברור בחציון Y. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: שינוי אנזימטי של חלבונים המוצגים על פני השטח של שמרים. (A) סכמת בדיקה המציגה את השלבים הקריטיים בארבע השיטות המתוארות: הכנת דגימות עם פוספטאז (tan) לבדיקה אנזימטית, דגירה לפעילות אנזימטית רצויה, שטיפת תאים ותיוג לזיהוי פעילות, וניתוח ציטומטריית זרימה ואיסוף נתונים. (B) סכמת גנים המייצגת מבנה כללי של הקסטה המשמשת לקיבוע רשתית אנדופלזמית של זוג אנזים-סובסטרט וביטוי פני השטח של המצע. (C) ייצוג גרפי של לוקליזציה משותפת של רשתית אנדופלזמית של זוג קינאז-סובסטרט (משמאל) ואחריו הפרשת המצע ששונה לאחר התרגום המוצג על פני השמרים ומסומן בנוגדנים אנטי-פוספוטירוזין (כחול) ונוגדני תג אנטי-אפיטופ (ורוד) כדי לאשר ביטוי פני השטח (מימין). (D) דגירה של תאי שמרים עם פוספטאז (שזוף) מסירה את קבוצת הפוספט מהמצע המוצג, משבשת את תיוג הנוגדנים נגד פוספוטיזין, ומקלה על ניתוח שינוי אנזימטי באמצעות ציטומטריית זרימה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: פעילות פוספטאז וטיטרציה של זמן. תאי שמרים נחשפו לשילובים מרובים של זמן וריכוז פוספטאז ואחריהם ניתוח זרימה ציטומטרית. כל הדגימות שטופלו הושוו לביקורת שהודגרה לאותו משך זמן ותנאי חיץ ללא SHP-2. אחוז הפרש הזרחן החציוני הוגדר כיחס בין חציון Y לאירועים המוצגים על פני השטח פחות אות הרעש הבסיסי שסופק על ידי חציון ה-Y באירועים שאינם מציגים בדגימות המכילות SHP-2, חלקי אותו יחס בבקרה שלהם. השערת האפס נדחית כאשר נצפים הבדלים משמעותיים בהשוואת שינויים בין קבוצות זמן וריכוז באמצעות ANOVA דו-כיווני (עמ' < 0.05). השפעת המשתנים המתוארים על אחוז הפרש הזרחן החציוני אינה תלויה זה בזה (אינטראקציה p > 0.05). מבחן ה-HSD של טוקי בוצע לניתוח פוסט-הוק למידע נוסף על משמעות ההבדל בין קבוצות הדגירה והריכוז הכוללות, וסדרה של מבחני t המניחים שונות לא שווה שימשו להגדרת מובהקות סטטיסטית של קבוצות בודדות בזמן ובריכוז מוגדרים. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן של ארבעה שכפולים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הנחיות להכנת מדיה לגידול שמרים ואינדוקציה של חלבון. תיאור טבלאי של המסה הנדרשת מכל רכיב כימי לגיבוש 1 ליטר של מצע גידול שמרים סלקטיבי, מצע אינדוקציה סלקטיבי של חלבון שמרים ותמצית שמרים פפטון דקסטרוז. לאחר שהמדיום המתואר מעורבב כראוי, יש לעקר את המסנן לפני השימוש בו. הוראות נוספות כלולות להכנת צלחות מדיה לגידול שמרים סלקטיביות. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 2: הכנת דגימה מומלצת לאסטרטגיית זרחון מצע ותיוג נוגדנים. תיאור טבלאי של הדגימות הנדרשות למדידת שינויים אנזימטיים של מצעים זרחניים המוצגים על פני השמרים. הכנת הדגימה ומעקב אחר אסטרטגיית תיוג הנוגדנים מוגדרת הן עבור הבקרות הנדרשות והן עבור כל דגימה שיש לנתח, כולל דילולים מתאימים של ריאגנטים לתיוג. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 3: חישובי יחס עודף נוגדנים לחלבון. תיאור טבלאי של המספר התיאורטי של נוגדנים זמינים לכל חלבון המתבטא על פני תא שמרים תוך תיוג לציטומטריית זרימה. המספר התיאורטי המבוטא מניח ש-100% מתאי השמרים מבטאים 10,000 חלבונים על פני השטח שלהם כדי להבטיח עודף נוגדנים וחישובי יחס העודף מבוססים על ריכוז מלאי הריאגנטים המוצג בטבלה ונרכש מהספק. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה משלימה S1: רצף חומצות אמינו של קלטות בנייה. ייצוג טבלאי של רצף חומצות האמינו עבור קלטות הבנייה הממוקמות משני צידי מקדם Gal 1-10. רצפים מודגשים תואמים לתיאורים מקודדי הצבע שלהם. הצד Gal-10 של הפלסמיד מיוצג כתרגום רצף חומצות אמינו הפוך כדי להקל על הבנתו. כל התווים שנותרו בשחור תואמים את תרגום חומצות האמינו של אתרי עיכול אנזימי הגבלה המשמשים לספק מודולריות למבנה. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Discussion

הפרוטוקול המוצג מאפשר ניתוח של אינטראקציות אנזימטיות באמצעות תצוגה חוץ-תאית של חלבונים על פני השמרים. שילוב קיבוע רשתית אנדופלזמית בפלסמיד תצוגת פני השטח המשמש מציג את היכולת לנתח אינטראקציות ספציפיות בין אנזימים ומצעים ששונו לאחר תרגום מחוץ לתא עקב האינטראקציות התוך תאיות שניתן לתכנן להתרחש^27,29. מבחני האינטראקציה האנזימטית שהוקמו בעבר באמצעות תצוגת פני השטח של שמרים כוללים ביטוי של החלבונים המעניינים תוך תאיים, כאשר תצוגת פני השטח היא אך ורק כלי לזיהוי אינטראקציות תוך-תאיות המתרחשות בין חלבוני המטרה 23,25,29.

פרוטוקול זה נבנה על פלטפורמה זו על ידי העברת האינטראקציות האנזימטיות הממוקדות לסביבה החוץ-תאית, מה שמציג גמישות נוספת הן באנזימים שניתן לחקור, והן בסביבה שבה פעילותם מנוטרת. האינטראקציות הנחקרות המתרחשות מחוץ לתאית נותנות לחוקרים את ההזדמנות להתאים את סביבת הדגירה כך שתהיה אופטימלית יותר לפעילות אנזימטית, ולהרחיב את האנזימים שניתן לחקור שפעילותם נפגעת ברטיקולום האנדופלזמי של השמרים, שהיא סביבה מחמצנת בכבדות³⁷. יתר על כן, היכולת לטטר את ריכוז האנזימים ביחס לסובסטרט נתון מאפשרת בדיקות פעילות אנזימטיות ספציפיות שלא ניתן היה לבצע תוך תאיות עקב רוויה משוערת בקצב התגובה במהלך ההפרדה.

במסגרת הפרוטוקול, ישנם מספר צעדים קריטיים שיש לציין כדי להבטיח שהתוצאה הרצויה תישמר. טרנספורמציה מוצלחת של המבנים שנחקרו לשמרים חיונית לתוצאות מיטביות מהשלבים הבאים. יש לבצע ניטור מדויק של הצפיפות האופטית כדי לעקוב אחר הצמיחה הבריאה של תרביות ולהבטיח שהן לא יגדלו יתר על המידה לפני השראת חלבון או הכנת דגימה. שלב הלוג של צמיחת תאי שמרים מקיף את התקופה שבה ייצור החלבון הוא הגבוה ביותר, בעוד שבשלב הנייח, המנגנונים האחראים לייצור החלבון נעצרים³⁸. בהתחשב בכך, מדידות צפיפות אופטיות מספקות מדידה מדויקת של שלבי הגידול שבהם נמצאות תרביות השמרים, ושלבים כגון אינדוקציה של חלבון והכנה לבדיקות צריכים להיעשות מחוץ לשלב הנייח או כאשר התרביות גדלות יתר על המידה (OD_600nm < 6).

עבור בדיקת השינוי האנזימטי, סביבת הדגירה המתוארת הייתה ספציפית לאנזים הנחקר, SHP-2 ולפעילות האנזימטית שבוצעה, דה-פוספורילציה. DTT שימש לסביבת ההפחתה שהוא מספק במהלך הדגירה עם SHP-2³⁴. לכן, חשוב למדוד ריכוזים מדויקים של הכימיקלים המשמשים לשינוי סביבת הדגירה במבחנים האנזימטיים כדי להבטיח פעילות אנזימטית עקבית בין דגימות וניסויים. SHP-2 שימש כחלבון רקומביננטי, וזה קריטי לווסת את הטמפרטורה במהלך השלבים השונים של הטיפול באנזים. לבדיקה מוצלחת, האנזים לא צריך לעבור יותר משני מחזורי הקפאה-הפשרה וצריך להיות על קרח במהלך הכנת כל דגימה. לאחר מכן הכרחי להקצות את האנזים הרקומביננטי לנפח מספיק כדי לעמוד בדרישות הבדיקה. במהלך הדגירה בפועל, יש לשלוט בקפדנות על הטמפרטורה בטמפרטורה האופטימלית עבור האנזים, 37 מעלות צלזיוס במקרה זה, עם תנועה מתמדת מרוטור כדי להבטיח הומוגניות של תערובת הדגירה.

השיטה הכוללת לניתוח עם אנזימים רקומביננטיים דרשה שינויים ספציפיים לאינטראקציה בין SHP-2 למצע הזרחני המוצג על פני השטח. התאמת הפרוטוקול לאינטראקציות אחרות של אנזים-סובסטרט חוץ-תאיות כרוכה בשינוי הרצפים המשמשים, סביבת מאגר הפעילות והמגיב המשמש לזיהוי. לבדיקת אינטראקציות אחרות של קינאז-סובסטרט-פוספטאז, ההסתגלות כוללת החלפת רצפי החלבון עבור זוג קינאז-סובסטרט למיקומם בהתאמה בקלטת הבנייה המתוארת בטבלה משלימה S1. רצף החלבון של המצע יחד עם לפחות תחום הקינאז של הקינאז המעניין צריך להיכלל בפלסמיד, והפוספטאז המכוון למצע הזרחני המיוצר צריך להיות בצורה של חלבון רקומביננטי. האינטראקציה המייצגת בין LCK, CD28 ו-SHP-2 מספקת דוגמה לשימוש בהפרדת הרשתית האנדופלזמית המתוכננת בקלטת המבנה ככלי לייצור חלבונים שעברו שינוי לאחר תרגום כדי להיחקר מחוץ לתאית עם אנזים המטרה שלהם. מצעים מעניינים שאינם צריכים לעבור שינויים לאחר התרגום (למשל, סובסטרטים שניתן לזרחן מחוץ לתאית באמצעות תוספת קינאז) יכולים להתבטא על פני השמרים ללא אנזים מזווג בתוך קלטת הבנייה. במקרה זה, רצף החלבון עבור הקינאז המתואר בטבלה משלימה S1 יוסר כאשר רק רצף המצע ייכלל בקלטת הבנייה. אנו מציינים מניסיוננו הקודם כי לוקליזציה משותפת של סרין-תראונין קינאז עם מצע ידוע הביאה לתצוגה של סובסטרט שלא עבר זרחן (Ezagui and Stern, נתונים שלא פורסמו), ולכן יש לבצע בדיקות קפדניות של שינוי אנזימטי מוצלח לפני יישום פוספטאז חוץ-תאי. פרסמנו בעבר פרוטוקול ללוקליזציה משותפת של קינאז-סובסטרט שעשוי להועיל לשלב³⁹ מתאים זה.

קינאזות ופוספטאזות מכילים לעתים קרובות שאריות ציסטאין לא מזווגות, שכאשר הן מתחמצנות, יוצרות קשרים דיסולפידים בתוך החלבון או על פני חלבונים, מה שעלול לשבש את הפעילות הקטליטית של החלבון עקב שינוי קונפורמציה^40,41. הבנת הביוכימיה של חלבון זה חיונית לקביעת סביבת התגובה הנכונה לשינוי אנזימטי. כתוצאה מכך, יש להוסיף חומר מפחית לסביבת הדגירה כדי להבטיח שהחלבון הרקומביננטי המשמש יישאר פעיל. DTT הוא חומר הפחתה נפוץ המשמש למטרות אלה, אך יש לייעל את הריכוז בבדיקה. שימוש בריכוז DTT גבוה מדי מעכב את הצגת המצע על פני השמרים, שכן עוגני Aga1p ו-Aga2p מוחזקים זה לזה באמצעות קשרי דיסולפיד, אשר מצטמצמים בנוכחות DTT⁴². ריכוז ה-DTT הותאם לריכוז המינימלי שיאפשר פעילות פוספטאז מקסימלית יחסית מבלי שיהיו לו השפעות מזיקות על תצוגת פני השטח של מצעים⁴². יש לייעל את סביבת הדגירה עבור כל אנזים שנבדק כדי להבטיח שמירה על הפעילות האנזימטית בעת שימוש בבדיקה זו. אם אנזים דורש סביבת הפחתה חזקה משמעותית מה-DTT של 0.5 מ"מ המשמש בבדיקה זו, הפלטפורמה מוגבלת על ידי ההפחתה בתצוגת פני השטח וייתכן שלא תהיה אופטימלית עבור הבדיקה האנזימטית הספציפית הרצויה. באופן דומה, המאגר 2x ששימש במהלך שלב הדגירה בפרוטוקול זה נכלל ממחקר קודם על מאגרים מקובלים המקדמים פעילות SHP-2, ויש לבצע מחקר דומה לגיבוש מאגר דגירה לכל אנזים אחר המשמש לבדיקה זו³⁴. נקודות התחלה ליצירת מאגרים אלה יכולות לכלול חיפוש ספרות ליישומים מוצלחים במבחנה של האנזים המעניין או המלצת יצרן האנזים למאגר פעילות. יש לטטר את האנזים הרקומביננטי בו נעשה שימוש במיוחד עבור בדיקה זו כדי לזהות ריכוז וזמן דגירה מקובלים, המאפשרים לפעילות האנזימטית הממוקדת להתרחש לפני איסוף הנתונים.

לצורך התאמת פרוטוקול זה לסוגים אחרים של אינטראקציה בין אנזים למצע, יהיה צורך לבחור ריאגנטים חדשים לזיהוי פלואורסצנטי ולטטר אותם לרגישות. מחקרים אחרים הדגימו דוגמאות לכך, כולל שימוש בנוגדנים ממוקדי תג אפיטופ כדי לזהות נוכחות או היעדר מצעי פפטיד לאחר טיפול בפרוטאז^23,25 ונוגדנים רגישים לאצטילציה לאיתור שינויים בחלבוני היסטון⁴³. לצורך הסמכת ריאגנטים אלה, יש לקבוע בקרה חיובית (כזו המדגימה באופן מאומת את שינוי העניין) ובקרה שלילית (כזו המדגימה באופן מאומת חוסר שינוי עניין). זה יכול להיעשות באמצעות תצוגת משטח שמרים של מבנה שהדגים בעבר את שינוי העניין, או במקרים מסוימים ניתן לבסס באמצעות קיבוע של חלבונים או פפטידים רקומביננטיים. לדוגמה, במקרה של זרחון (ושינויים רבים אחרים לאחר תרגום מעניינים), ניתן לסנתז פפטידים מרצף ידוע עם פוספוטיזין (בקרה חיובית) או טירוזין לא שונה (בקרה שלילית) וביוטין C-terminal שיאפשר קיבוע של הפפטידים על חרוזים מצופים סטרפטווידין. ניתן לתייג את החרוזים המצופים בפפטיד עם הנוגדן הספציפי לשינוי ולהעריך את הספציפיות והרגישות של הזיהוי באמצעות ציטומטריית זרימה בשיטות דומות לאלו המתוארות בסעיף 4. יש להשתמש בדילולים שונים של נוגדנים כדי למצוא ריכוז המספק אות מקסימלי של הבקרה החיובית, אות מינימלי של הבקרה השלילית, ומאזן קיפול עודף מספיק של נוגדן לכל חלבון שונה (תוך שימוש במשוואה בהערה משלב 4.1) עם שיקולים כלכליים למספר הניסויים שייערכו לכל כמות נוגדנים שהתקבלה.

אנו מתארים פרוטוקול להתאמת הקלות של פלטפורמת תצוגת משטח השמרים לבדיקות פעילות אנזימטית חוץ-תאיות. השיטה מודגמת באמצעות CD28 זרחני המוצג על פני השמרים כדי לעבור דה-פוספורילציה על ידי SHP-2 רקומביננטי במהלך הדגירה, אך ניתן להכליל אותה עבור סוגים רבים של שינוי אנזימטי באמצעות שינוי של מאגר עבודה וזוג אנזים-מצע בשימוש.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Media Bottles	Corning	06-414-1D
1.7/2.0 mL Microtubes	Axygen	MCT-175-C
10 µL SureOne Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-438
1000 µL SureOne Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-408
12 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes	Greiner	07-000-212
3 mL platic Cuvettes	BRAND	759076D
300 µL SureOne Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-411
5 mL Serological Pipettes	Fisher Scientific	13-678-11D
Acid Casein (Casamino Acids)	Fisher Scientific	BP-1424-500
Analytical Balance	Mettler Toledo	30243397
Bacteriological Petri Dish	Corning	Falcon 351008
Biosafety Cabinets	Labconco	Logic Class II, Type A2  302310102
Biospectrometer	Eppendorf	Kinetic 6136000010
Bovine Serum Albumin	Fisher bioreagents	BP1600-100
Citric Acid	Fisher Scientific	A940-500
CytoFLEX Flow Cytometry Analyzer	Beckam Coulter	Cytoflex C09745	CytExpert software
Dextrose	Fisher Scientific	D16-1
Dithiothreitol	Fisher bioreagents	BP172-5
Donkey anti-goat FITC	Invitrogen	A16000
EDTA	Alfa Aesar	H56165.30
Ez-Link PEG4-NHS-Biotin	Thermo Scientific	A39259
Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit	Zymo Research	T2001
Galactose	Fisher Scientific	BP656-500
General Purpose Refrigerator	Marvel Scientific	MS24RAS4RW
Goat anti-myc tag antibody	Bethyl	A190-104A
Mictrotube Centrifuge	Eppendorf	5425 R 5406000313
Mini Low Temperature Refrigerated Incubator	Fisher Scientific	15-015-2632
Mouse anti-phosphotyrosine antibody 4G10	BioXcell	BE0194
Parafilm M	Bemis	M PM999
Phosphate Buffered Saline	Fisher bioreagents	BP399-500
Pipette Controller	Eppendorf	easypet 3 4430000018
Raffinose	Thermo Scientific	J21060-36
Recombinant human Active SHP-2 Protein	R&D Systems	1894-SH
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5910 R
Saccharomyces cerevisiae yeast surface display strain EBY 100	ATCC	MYA-4941
Shaker Incubator	Eppendorf	M1335-0002 New Brunswick Innova 42
Single Channel Pipette Set	Eppendorf	05-403-151
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S671-500
Sodium Citrate Dihydrate	Fisher Scientific	S279-500
Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate	Fisher Scientific	S373-500
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate	Fisher Scientific	S468-500
Streptavidin Alexa Fluor 647	Invitrogen	S32357
Top Loading Balance	Mettler Toledo
Tris hydrochloride	EMD Millipore	648317-100GM
Tube revolver rotator	Fisher Scientific	11-676-341
Weighing Paper	Fisher Scientific	09-898-12B
Yeast Nitrogen Base	BD Difco	291940
Zeba Spin Desalting Columns	Thermo Scientific	89883