Name: the preparation of primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow for electroporation
Uploaded: 2009-01-06T23:59:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation at JoVE.com

קציר מוח העצם מן עצמות הירך לבין Tibiae <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב הראשון של ההליך הוא לקצור מח העצם של עצמות הירך לבין tibiae של 6 - עכבר 12 שבועות הישן (אנחנו משתמשים BALB / c עכברים אבל אתה יכול לעשות הליך זה עם זן כל העכבר). כדי להתחיל, להרדים את העכבר משאיפת CO 2 (לא יוצג). קציר עצם הירך לבין tibiae מן הרגליים האחוריות של כל אחד. ואז, עם סכין גילוח, לחתוך כל סוף עצמות הירך כדי להסיר את הירך והמפרקים הברך לחשוף את מח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן דומה, לחתוך כל סוף tibiae כדי להסיר את הברך ואזורים סמוכים הקרסול לחשוף את מח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח מזרק 3 מ&quot;ל עם מחט 26-מד ולמלא אותו RPMI FBS בתוספת 10%, פניצילין, סטרפטומיצין, ואת בטא mercaptoethanol (BME 100 = UM). בעזרת פינצטה, להחזיק את העצם מעל צלחת פטרי המכילה RPMI התקשורת. הכנס את מחט המזרק לתוך קצהו האחד של העצם, לוחץ על המתג כדי לשטוף את מוח העצם. מחט המזרק ניתן להזיז למעלה ולמטה בתוך העצם כדי לשטוף את מוח שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך עבור כל העצמות, ואז להמשיך עם הקמת תרבויות. </li></ol> הקמת תרבויות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להקים את התרבויות מח עצם, פיפטה מח העצם סמוקות מעלה ומטה מספר פעמים כדי לשבור את הרקמה לתוך תא ההשעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום מסנן 70 מיקרון על גבי צינור חרוטי 50 מ&quot;ל, ומוסיפים את ההשעיה תא המסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את צלחת פטרי פעם אחת עם RPMI, ואז מוסיפים את לשטוף את מסנן 70 מיקרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בסוף גומי של 1 מ&quot;ל במזרק הבוכנה, לטחון את חתיכות מוח העצם שנותרו על גבי פילטר 70 מיקרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את המסנן פעם אחת עם RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפת מסנן, צנטריפוגה ההשעיה תא בסל&quot;ד 1200 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את תא גלולה ידי resuspending ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים באמצעות hemocytometer. אנחנו בדרך כלל להשיג ~ 90 מיליון תאים מהעצמות אחד העכבר (שתי עצמות הירך בתוספת שתי tibiae). לאחר ספירת תאים, צנטריפוגה אותם שוב בסל&quot;ד 1200 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים כמות קטנה של RPMI ו aliquot אותם לתוך צלוחיות תרבות רקמה המכילה מספיק RPMI כך הריכוז הסופי הוא 1 מיליון תאים לכל מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ציטוקינים כדי לקדם את הפיתוח של סוג התא העניין שלך. במקרה זה, ציטוקינים interleukin-3 (IL-3 = 10 ng / mL) נוסף כדי לקדם את הפיתוח של בזופילים ותאי פיטום. כדי לרכוש בזופילים, דגירה 10 ימים. עבור תאים התורן, דגירה של 5 שבועות. בעת יצירת תא הפיטום, התקשורת IL-3 יש לשנות פעם בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנה מבט על כמה תאים התורן אמור להופיע רק לאחר ציפוי. תמונה זו ממחישה את התמיינות של תאים במח התורן לתוך בזופילים ותאי תורן 10 ימים לאחר תוספת של interleukin-3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם את סוג התא הרצוי מתקבל, להמשיך לשלב electroporation. </li></ol> Electroporating תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את הצעד electroporation, לקבוע את מספר התאים בקבוק התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הם electroporated בדרך כלל צפיפות של 10 מיליון דולר מ&quot;ל, כדי להעביר את המספר הסלולרי נדרש צינורות חרוטי ו צנטריפוגות צינורות ב 1200 סל&quot;ד במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר centrifuging, לשאוב את התקשורת, לשטוף את התאים עם 1X PBS, ו צנטריפוגות שוב ב 1200 סל&quot;ד במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS ולהוסיף Bio-Rad ג&#39;ין חיץ Pulser electroporation לעשות השעיה תא של 10 מיליון תאים לכל מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר resuspending את התאים, להוסיף את ה-DNA פלסמיד הרצוי בריכוז סופי של 10 עד 20 מיקרוגרם למ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 150 מיקרוליטר של השעיה התא לתוך בארות על פי בחירתך על צלחת electroporation 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת electroporation בחדר צלחת MXcell ולסגור את המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני transfection של תא הפיטום, פרוטוקול electroporation חייב להיות שתוכנת MXcell אלא באמצעות פרוטוקול מראש או מאוחסנים. באמצעות ניסויים אופטימיזציה גילינו את היעילות הגבוהה ביותר transfection של תא הפיטום להתרחש באמצעות מרובע פרוטוקולים גל הדופק. אנו ישתנו התנאים electroporation על הצלחת להעביר 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms ו 350V/10ms פולסים מרובע לנופף 2000uF אוהם ו 1000. לאחר פרוטוקול הוגדר ולטעון המכשיר, ללחוץ על &quot;דופק&quot; כדי electroporate התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר electroporation תושלם, העברת תאים לצלחת בתרבית רקמה. אנחנו בדרך כלל העברת כל 150 electroporation מדגם microliter אל באר צלחת 48-היטב בתרבות רקמה המכילה 300 מיקרוליטר RPMI (בתוספת 10% FCS, פניצילין, סטרפטומיצין, ואת בטא mercaptoethanol) עם 10 ננוגרם למ&quot;ל interleukin-3. תאים מודגרת לילה בשעה 37 ° C, אז assayed 24 שעות מאוחר יותר לביטוי ודיכוי. </li></ol> טראןsfection תוצאות תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים לאחר electroporation מוצלח באמצעות 20 מיקרוגרם למ&quot;ל GFP פלסמיד מוצג הווידאו. שימוש במערכת electroporation MXcell transfection יעילות של כ -30% ניתן להשיג. המערכת מאפשרת לך להשתנות התנאים כדי למקסם את היעילות transfection שלך, תוך שמירה על כדאיות התא.

כאשר מידע גנטי יותר עולה וכלים חדשים כגון siRNA מפותחים, השימוש פיזיולוגית התאים הרלוונטיים הפך חשוב יותר מתמיד כדי לקדם את ההבנה שלנו של המסלולים המחלה, חלבונים אינטראקציות, ואת הולכת אותות. תאים ראשוניים מתקבלים ישירות לרקמות או נוזלים מעובד במבחנה. תאים אלה ניתן לטפל במספר דרכים, כולל באמצעות הקדמה של חומר גנטי חיצוני. זה הופך ברור יותר ויותר כי הדרך היעילה ביותר להציג את ה-DNA או פלסמיד siRNA לתוך תאים ראשוניים הוא electroporation. Electroporation חושף תאים פולסים חשמליים על מנת transiently להגדיל את החדירות של קרום התא, ובכך לאפשר חומצות גרעין אקסוגניים להיכנס לתא. שיטה זו של transfection יכול להיות מותאם כדי להכיל את ההבדלים בין תאים מסוגים שונים / קווי, ולכן ניתן להשתמש בו כדי transfect תא הפיטום וכן כל מח עצם אחרות הנגזרות התא. יתר על כן, בניגוד transfection ויראלי בתיווך, electroporation אינה מטילה מגבלות על גודל של ה-DNA transfected, ולא דורשים הכנה נרחבת. בניגוד transfection השומנים בתיווך, electroporation יכול להיות פחות רעיל ואינו לגרום השמנה endosomal של חומצת גרעין transfected. ביו רד פיתחה את מערכת electroporation MXcell במיוחד עבור תאים אלה. MXcell מאפשר לך להשתנות התנאים כדי למקסם את היעילות ואת הכדאיות transfection התא. כדי לייעל את נצילות transfection ולמזער מוות של תאים, מספר רב של פרמטרים electroporation כולל מתח, קיבול, התנגדות, אורך הפולס יכול להיות מותאם ומוערכת.

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser MXcell Electroporation System</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2670</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Electroporation Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2677</td><td></td></tr></tbody></table>

the preparation of primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow for electroporation

זה הופך ברור יותר ויותר כי electroporation היא הדרך היעילה ביותר להציג את ה-DNA או פלסמיד siRNA לתוך תאים ראשוניים. Pulser ג&#39;ין מערכת MXcell electroporation וג&#39;ין Pulser חיץ electroporation פותחו במיוחד כדי transfect חומצות גרעין לתאי יונקים קשות transfect תאים, כגון וידאו cells.This יסודי גזע מדגים כיצד להקים ראשוני בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine ולאחר מכן להכין אותם electroporation במערכת MXcell. אנחנו מתחילים ידי בידוד עצם הירך לבין השוקה. מוח העצם של הירך והן השוקה נקצרים אז ותרבויות מבוססים. בתרבית תאים במח העצם הם transfected כך וניתח.

Watch this Scientific Journal Video about The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation at JoVE.com

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

הליך זה מתאר כיצד להקים ראשוני בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine ואחריו transfection באמצעות Pulser ג&#39;ין מערכת MXCell electroporation.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

<a class="grey_button" href="/video/1047">
ChineseVersion
</a>

the-preparation-primary-hematopoietic-cell-cultures-from-murine-bone

Research

JoVE Journal

Biology

25.7K Views.  Bio-Rad Laboratories, Inc.  ChineseVersion 

Video: The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Genetics

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

המונוציטים בידוד והזרקה תוך ורידית של Murine מח העצם נגזר

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Immunology and Infection

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting from advances in genome editing technology and lentivirus-mediated transgene delivery systems, an efficient and economical method is described here that establishes mice in which genes are manipulated specifically in hematopoietic stem cells. Lentiviruses are used to transduce Cas9-expressing lineage-negative bone marrow cells with a guide RNA (gRNA) targeting specific genes and a red fluorescence reporter gene (RFP), then these cells are transplanted into lethally-irradiated C57BL/6 mice. Mice transplanted with lentivirus expressing non-targeting gRNA are used as controls. Engraftment of transduced hematopoietic stem cells are evaluated by flow cytometric analysis of RFP-positive leukocytes of peripheral blood. Using this method, ~90% transduction of myeloid cells and ~70% of lymphoid cells at 4 weeks after transplantation can be achieved. Genomic DNA is isolated from RFP-positive blood cells, and portions of the targeted site DNA are amplified by PCR to validate the genome editing. This protocol provides a high-throughput evaluation of hematopoiesis-regulatory genes and can be extended to a variety of mouse disease models with hematopoietic cell involvement.

Described are protocols for the highly efficient genome editing of murine hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) by the CRISPR/Cas9 system to rapidly develop mouse model systems with hematopoietic system-specific gene modifications.

לנטינגיו CRISPR/Cas9 בתיווך הגנום עריכה לחקר התאים המטפאות במודלים למחלות

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

פרוטוקול חסכוני ויעיל לבידוד וגידול תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם מעכברים

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

מיטוב בידוד תאי סטרומה מבלוטת התימוס וממח העצם

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

מחבר זרקור: קידום מחקר המטופויטי באמצעות בידוד תאי סטרומה לריצוף תא בודד

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

בידוד תאי סטרומה מאיברים המטופויטיים

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

ביטוי של חלבונים פיוז'ן פלואורסצנט תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם מאתר ו מקרופאגים

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

Transcript

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

המונוציטים בידוד והזרקה תוך ורידית של Murine מח העצם נגזר

שימוש ג'ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

לנטינגיו CRISPR/Cas9 בתיווך הגנום עריכה לחקר התאים המטפאות במודלים למחלות

פרוטוקול חסכוני ויעיל לבידוד וגידול תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם מעכברים

בידוד תאי סטרומה מאיברים המטופויטיים

בידוד תאי סטרומה מאיברים המטופויטיים

בידוד תאי סטרומה מאיברים המטופויטיים

ביטוי של חלבונים פיוז'ן פלואורסצנט תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם מאתר ו מקרופאגים