1. הכנה

1. לפני שתתחילו, לבשו כפפות מעבדה וביגוד מגן מתאים.
2. לחטא את כל כלי הניתוח, תחילה עם חומר ניקוי ולאחר מכן עם 70% אתנול ולאחר מכן יבש ביסודיות.
3. הכן 50 מ"ל מתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) המכילה סרום עגל עוברי 2% (FCS).

2. ניתוח

1. באמצעות מערכת אספקת פחמן דו חמצני, להרדים את העכבר על ידי היפוקסיה. אבטחו את העכבר המתת חסד על צלחת ניתוח בתנוחת העפרוניזציה ובצעו לפרוסטומיה אורך באמצעות מספריים ומלקחיים.
2. באמצעות מלקחיים, להזיז את המעיים ואת הבטן בצד ימין של הבטן כדי לחשוף את הבטן ואת הטחול. הטחול מחובר לקיבה.
3. באמצעות מלקחיים, לנתק בזהירות את הטחול מהבטן ומניחים אותו בצלחת פטרי המכילה 5 מ"ל של HBSS 2% FCS.

3. בידוד תאי מערכת החיסון

1. מניחים את הטחול במסננת תא 40μm מעל אותה צלחת פטרי. למחוץ את הטחול עם בוכנה כדי לנתק אותו באותה מנה.
2. מעבירים את הטחול המנותק ואת הנוזל לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
3. צנטריפוגות הצינור ב 370 x g במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant, הימנעות הכדור.
4. resuspend הכדור ב 2mL של אשלגן אצטט ליזה אריתרוציטים. המתן 2 דקות ולאחר מכן האיפור את עוצמת הקול עד 15 מ"ל באמצעות HBSS 2% FCS.
5. צנטריפוגות הצינור שוב ב 370 x גרם במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס. להשליך את supernatant ו resuspend הכדור ב 5mL של HBSS 2% FCS.
6. ספירת התאים באמצעות בדיקות כתמים כחולות טריפן ולהתאים את ריכוז התא הסופי ל 10⁷ תאים / מ"ל באמצעות נפח מתאים של HBSS 2% FCS.

4. כתמי תאים

1. העבר 200μL של השעיית התא לתוך שישה צינורות FACS, שכותרתו 1 עד 6.
2. צנטריפוגות הצינורות ב 370 x גרם במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant הימנעות הכדור.
3. לאחר מכן, להכין שישה תערובות נוגדנים חדשניים על ידי הוספת כמות מתאימה של נוגדן 200μL HBSS 2% FCS על פי טבלה 1.
4. לאחר מכן, העבר תערובות נוגדנים אלה לצינורות FACS ממוספרים המתאימים.
5. לדגור על התליות התא מעורבב עם הנוגדנים במשך 20 דקות על קרח בחושך.
6. הוסף 1mL של HBSS 2% FCS לכל צינור ולאחר מכן צנטריפוגה שוב ב 370 x g במשך 3 דקות ב 10 °C.
7. להשליך את supernatant ו resuspend הכדור ב 200μL של HBSS 2% FCS.
8. העבר את הכדורים המחודשים לצינורות FACS חדשים.

טבלה 1: קומפוזיציה לערבב נוגדנים. שישה תערובות של 200μL של נוגדן HBSS + הוכנו לניסוי. Mix 1 מיועד להגדרת PMT, ערבובים 2 עד 5 מיועדים להגדרות פיצוי, ומיקס 6 מיועד למיון תאים.

5. כיול FACS

1. ראשית, הפעל את הממיין ובצע את"הפעלה Fluidics."
2. הפעל את הנחל ולאחר מכן לחכות 15 דקות עבור הזרם להתייצב.
3. התאם את המשרעת של הזרם כדי לקבל היווצרות טיפה מנותקת. לאחר מכן לחץ על "הנקודה המתוקה" כדי להשלים את התאמת המשרעת.
4. שים את מסנן הצפיפות הניטרלית (N.D. ) - 1.0 ופתח את ממשק "CST" אשר מייצג התקנה ומעקב cytometer.
5. כדי לבצע בקרת איכות יומית, תחילה לדלל את חרוזי CST עם בינוני FACS בעקבות הוראות היצרן ולאחר מכן, בצע את פקד CST.
6. לאחר השלמת בקרת CST, החלף את מסנן N.D. 1.0 במסנן N.D. 2.0 בציטומטר.
7. לאחר מכן, לדלל חרוזי השהיית טיפה במדיום FACS בהתאם להוראות היצרן ולאחר מכן לטעון לתוך FACS.
8. כדי להבטיח ביצוע מיון נכון -
   1. תחילה לחץ על "מתח" ולאחר מכן על "מסנן אופטי". הרביע הימני צריך להיות שווה ל-100%. במידת הצורך, להתאים את בורג הלייזר האדום על cytometer שמאל או ימין כדי להשיג 100% ברביע הימני.
   2. לאחר מכן, בצע מיון בדיקה כדי להבטיח שהזרם נופל לתוך צינור האיסוף. כדי לעשות זאת, לחץ על "מגירת פסולת" ולהתחיל "מיון מבחן". תבדוק שזרמים צדדיים נופלים לצינורות איסוף. אם הם לא, להתאים מתח עד שהם עושים.
   3. נווט אל תבנית הניסוי. לאחר מכן, פתח את הניסוי "עיכוב שחרור אקרופרופ" ולחץ על "פריסת מיון".
   4. שנה את קצב הזרימה כדי להשיג 1000 עד 3000 אירועים לשניה.
   5. לחץ על "מתח" ולאחר מכן על "מסנן אופטי". הרביע השמאלי צריך להיות שווה ל-0 ורביע ימין ל-100.
   6. בחלון "פריסת מיון" לחץ על "מיון" ולאחר מכן לחץ על "ביטול". הרביע השמאלי צריך להיות שווה ל-100 ורביע ימין ל-0. אם הרביע השמאלי קטן מ- 95 לחץ על "השהיה אוטומטית" כדי להתאים אותו באופן אוטומטי.

6. ציטומטריה של זרימה ובקרת טוהר

1. התחל ציטומטריית זרימה על ידי התחלה עם הצינור 1 (תאים לא מזוהמים) כדי להגדיר את מורפולוגיה התא ואת הפסגות השליליות של פלואורכרום. הגדר את הפיזור קדימה ואת הצד ולהגדיר את המתחים של כל פרמטר פלואורסצנטי. מקם את האוכלוסייה השלילית בעשור הראשון באמצעות הרשתות בכל חלקת נקודות.
2. לאחר מכן, עומס צינור 2 (בקרת צבע יחיד) בציטומטר. התאם את החפיפה הספקטרלית עד חציוני האוכלוסייה השליליים והחיוביים מיושרים או משתמשים בתוכנת החישוב האוטומטית. חשוב לשמור על האות בקנה מידה. בקרות פיצוי חייבות להתאים להגדרות הפלורוכרום והגלאים הניסיוניים. להקליט 10,000 אירועים.
3. חזור על שלבים אלה באמצעות צינור 3, 4 ו- 5 (פקדי צבע בודדים אחרים).
4. לאחר מכן, עומס צינור 6 (תאים מוכתמים) ולהגדיר אוכלוסיות תאים של עניין באמצעות אסטרטגיית gating ספציפית.
5. בחלון פריסת מיון, בחר את אוכלוסיית התאים בעלי עניין. בחר את סף התא ב "אירועי יעד" ואת רמת הדיוק ב "דיוק". כאן רק אוכלוסייה אחת ממוינת, עם זאת, ניתן למיין ארבע אוכלוסיות שונות בו זמנית.
6. לאחר שתוכן לחץ על "מיין" ועל "אישור", ולאחר מכן המתן למיון תאים.
7. לאחר השלמת מיון התאים, בצע בקרת טוהר על ידי צנרת ראשונה של 10μL של תאים ממוינים לתוך צינור FACS חדש עם 90 microliters של HBSS 2% FCS.
8. לאחר מכן, לטעון את הצינור cytometer. להקליט ולנתח את הפנוטיפים של התאים כדי לוודא כי אסטרטגיית gating עבד כמתוכנן.

7. ניתוח נתונים

1. פתח את תוכנת 'FlowJo' וגרור את הקבצים עבור כל צינור בחלון "כל הדוגמה".
2. לחץ פעמיים על קובץ כדי לפתוח אותו בחלון חדש.
3. לחץ על "מצולע" ושחזור אסטרטגיית הגטינג ששימשה בעבר.
4. חזור על השלבים עם כל הקבצים האחרים.
5. כדי להמחיש את התוויות הנקודות, לחץ על "עורך הפריסה" וגרור את האוכלוסיות העניין מצינור 6 ובקרת טוהר בכרטיסיה עורך הפריסה. התאים אמורים להופיע רק באוכלוסיית העניין בבקרת טוהר (ראו איור 2).
6. כדי לבדוק את הטוהר של לימפוציטים B בתאים ממוינים, לחץ על "עורך השולחן". גרור אוכלוסיית לימפוציטים B מצינור 6 ובקרת טוהר בטבלה.
7. בתפריט "סטטיסטיקה" בחר את התדירות של CD45⁺ תאים כדי לבדוק את הטוהר של אוכלוסיית תאים זו ולאחר מכן לחץ על "צור טבלה".
8. ערכי פרמטר מופיעים בטבלה חדשה. בחלון בקרת טוהר, בדוק את התדירות של לימפוציטים B בתוך CD45⁺ תאים, אשר צריך להיות גבוה מ 98% (ראה איור 2, הלוח התחתון).