יצירת נוגדנים: ייצור נוגדנים חד שבטיים באמצעות היברידיות

Overview

מקור: פרנסס נגד סג'אאסטד1,2,ויטני סוונסון2,3ותומאס ס. גריפית'1,2,3,4
1 מיקרוביולוגיה, אימונולוגיה, ותוכנית לתואר שני בביולוגיה של הסרטן, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
2 המרכז לאימונולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
3 המחלקה לאורולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
4 מרכז הסרטן הבונים החופשיים, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455

נוגדנים פוליקלונליים מוגדרים כאוסף של נוגדנים המכוונים נגד דטרמיננטים אנטיגניים שונים של אנטיגן או מספר אנטיגנים (1). בעוד נוגדנים פוליקלונליים הם כלים רבי עוצמה לזיהוי מולקולות ביולוגיות, יש מגבלה חשובה אחת - הם אינם מסוגלים להבחין בין אנטיגנים החולקים דטרמיננטים אנטיגניים. לדוגמה, כאשר אלבומין סרום בקר משמש לחיסון בעל חיים, תאי B עם משטח שונה Ig יגגיב דטרמיננטים אנטיגניים שונים על אלבומין סרום בקר. התוצאה היא תערובת של נוגדנים באנטיריום. מכיוון שארבומין בסרום בקר חולק כמה אפיטופים עם אלבומין בסרום אנושי באזורים השמורים אבולוציונית של החלבון, זה סרום אנטי-בקר אלבומין אנטי-וירוס יגיב גם עם אלבומין סרום אנושי. לכן, תרופה זו לא תהיה שימושית להבחנה בין אלבומינים של בקר וסרום אנושי.

מספר גישות ננקטו כדי להתגבר על בעיית הספציפיות של אנטי-זירה פוליקלונלית. האחת היא על ידי ספיגת הנוגדנים הלא רצויים על ידי העברת האנטי-אנרגיה דרך עמוד כרומטוגרפיה של אנטיגנים משותקים (2). שיטה זו היא מייגע ולעתים קרובות לא מסוגל להסיר לחלוטין את הנוגדנים לא רצויים. גישה נוספת היא לבודד תאי B בודדים המייצרים נוגדנים ולהרחיב אותם בתרבית. עם זאת, כמו רוב התאים הרגילים ללא תימוץ, תאי B אינם שורדים בתרבית ארוכת טווח.

כדי להתגבר על חוסר היכולת של תאי B לשרוד בתרבות, גישה אחת היא להכין היברידית של תאי מיאלומה-B. בשנת 1847, הנרי בנס-ג'ונס גילה כי חולים עם מיאלומה נפוצה, גידול לימפואידי, ייצרו כמות גדולה של נוגדנים (3). תאי B בחולים אלה הפכו ממאירים וגדלים ללא שליטה. מכיוון שתאי B הממאירים נגזרים משיבוט יחיד, הם זהים ומייצרים רק סוג אחד של נוגדן (כלומר,נוגדן חד שבטי, או mAb). עם זאת, רוב תאי מיאלומה אלה מייצרים נוגדנים של פרטים לא ידועים. בשנת 1975, על ידי היתוך תא מיאלומה לתא B, הצליחו סזאר מילשטיין וז'ורז ' קולר לייצר הכלאה שניתן לתרבות ללא הגבלת זמן במבחנה ומייצרת מספר בלתי מוגבל של נוגדנים חד שבטיים של ייחודיות אנטיגנית ידועה (4). הרציונל מאחורי הגישה שלהם הוא לשלב את המאפיינים האלמותיים של תא המיאלומה ואת הנוגדן המייצר תכונות של תא B. הטכניקה שלהם חוללה מהפכה בייצור הנוגדנים ומספקת אמצעי רב עוצמה לזיהוי וטיהור של מולקולות ביולוגיות באמצעות נוגדנים חד שבטיים.

בדרך כלל, הכנת נוגדן חד שבטי דורשת מספר חודשים. ההליך הכללי כולל את השלבים הבאים:

  1. חיסון וסינון של טיטר נוגדנים
  2. היתוך של תאי B המייצרים נוגדנים ותאי מיאלומה
  3. צמיחה סלקטיבית של ההיברידית
  4. הקרנת ההיברידיות לייצור הנוגדן החד שבטי הרצוי
  5. שיבוט על ידי הגבלת דילול - תהליך לפיו תאים מדוללים לריכוז כדי לאפשר סטטיסטית פחות מתא אחד להתווסף לבארות של צלחת 96-well. כמה בארות בסופו של דבר עם 0 תאים וחלקם יהיו 1 תא. בארות עם זרעים עם תא אחד בסופו של דבר יגדלו לתוך אוכלוסייה חד שבטית של תאים.
  6. צמיחת ההיברידיות והכנת נוגדן חד שבטי

פרוטוקול זה מתמקד בשלב האחרון - צמיחת ההיברידיות והכנת הנוגדן המונוקלונלי. הנוגדן מטוהר מן התרבות supernatant על ידי משקעים אמוניום גופרתי (המכונה לעתים קרובות מלח החוצה) - שיטה נפוצה של הסרת חלבונים מפתרון. חלבונים בתמיסה יוצרים קשרי מימן, יחד עם אינטראקציות הידרופיליות אחרות, עם מים דרך הקבוצות הקוטביות והאיוניות החשופות שלהם. כאשר מוסיפים ריכוזים של יונים קטנים וטעונים מאוד (כגון אמוניום או סולפט), קבוצות אלה מתחרות עם החלבונים לקשירה למים. זה מסיר את מולקולות המים מן החלבון ומקטין את המסיסות שלה, וכתוצאה מכך משקעים של החלבון.

Procedure

הערה: טכניקת תרבית תאים סטרילית צריכה להישמר בעת טיפול בתאי ההיברידימה ובמדיה באופן סטרילי (למשל, בארון בטיחות ביולוגית) עד לצעדי טיהור הנוגדנים.

1. הפשרת תאי היברידיה קפואים

  1. לדגור על הוויאל המכיל את תאי ההיברידיומה הקפואים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד להפשרה (כ-2 דקות).
  2. הוסף את התאים המופשרים לצינור חרוט 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של RPMI מלא (RPMI בתוספת סרום בקר עוברי 10%, 100 פניצילין U /mL, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 1mM נתרן pyruvate

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Results

באמצעות פרוטוקול זה, השגנו את התוצאות הבאות עם מספר הכלאות שונות:

הכלאה: RB6-BC5 (עכבר נגד עכבר Ly6C/ Ly6G (Gr1) IgG2b, κ mAb)
מנת יתר280 - 1.103
(1.103/1.43) (20) = 15.42 מ"ג/מ"ל

הכלאה: GK1.5 (עכבר נגד עכבר CD4 IgG2b, κ mAb)
מנת י?...

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Application and Summary

ההליך המתואר לעיל הוא דרך פשוטה וישירה קדימה לטהר נוגדנים חד שבטיים מתרבות היברידית. חשוב לזכור, עם זאת, כי אמוניום גופרתי יהיה לזרז חלבונים אחרים שעשויים להיות בתרבות supernatant. כתוצאה מכך, ריכוזי הנוגדנים שנקבעו ממדידות הספיגה הם הערכות. המשתמש עשוי לרצות להעריך את הטוהר של המדגם המחויג על ?...

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

References
  1. Lipman NS, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources. ILAR Journal, 46 (3), 258-268 (2005).
  2. Arora S, Ayyar BV, O'Kennedy R. Affinity chromatography for antibody purification Methods Mol Biol. 1129, 497-516 (2014).
  3. Henry BJ. On a new substance occurring in the urine of a patient with mollities ossium. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 138, 55-62 (1848).
  4. Köhler G and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature. 256, 495-497 (1975).
Tags

Skip to...

0:01

Concepts

2:51

Hybridoma Expansion

6:04

Antibody Production in Serum-Free Medium

7:28

Antibody Purification - Day 1

9:25

Antibody Purification - Days 2-4

12:00

Analysis and Results

Videos from this collection:

article

Now Playing

יצירת נוגדנים: ייצור נוגדנים חד שבטיים באמצעות היברידיות

Immunology

42.9K Views

article

ציטומטריית זרימה ומיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנטיות (FACS): בידוד של לימפוציטים מסוג Splenic B

Immunology

91.8K Views

article

מיון תאים המופעל מגנטי (MACS): בידוד של לימפוציטים T תימיים

Immunology

22.3K Views

article

אליסה אסייס: עקיפה, כריך ותחרותי

Immunology

235.0K Views

article

אליספוט אסאי: זיהוי של IFN-γ הפרשת טחול

Immunology

28.1K Views

article

אימונוהיסטוכימיה ואימונוציטוכימיה: הדמיית רקמות באמצעות מיקרוסקופיה קלה

Immunology

77.8K Views

article

מיקרוסקופיה חיסונית: כתמי אימונופלואורסצנטיות של מקטעי רקמות משובצים בפרפין

Immunology

53.0K Views

article

מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות קונפוקלית: טכניקה לקביעת לוקליזציה של חלבונים בפיברובלסטים של עכברים

Immunology

42.7K Views

article

טכניקות מבוססות אימונופרציפיטציה: טיהור חלבונים אנדוגניים באמצעות חרוזי אגרוז

Immunology

87.0K Views

article

ניתוח מחזור התא: הערכת התפשטות תאי CD4 ו- CD8 T לאחר גירוי באמצעות כתמי CFSE וציטומטריית זרימה

Immunology

23.9K Views

article

העברת תאים מאמצת: הצגת טחול עכבר תורם לעכבר מארח והערכה של הצלחה באמצעות FACS

Immunology

21.9K Views

article

ת לבדיקת מוות בתא: כרום שחרר את ההסתה של היכולת הציטוטוקסית

Immunology

151.3K Views

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved