מקור: פרנסס נגד סג'אאסטד1,2,ויטני סוונסון2,3ותומאס ס. גריפית'1,2,3,4
1 מיקרוביולוגיה, אימונולוגיה, ותוכנית לתואר שני בביולוגיה של הסרטן, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
2 המרכז לאימונולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
3 המחלקה לאורולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
4 מרכז הסרטן הבונים החופשיים, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
נוגדנים פוליקלונליים מוגדרים כאוסף של נוגדנים המכוונים נגד דטרמיננטים אנטיגניים שונים של אנטיגן או מספר אנטיגנים (1). בעוד נוגדנים פוליקלונליים הם כלים רבי עוצמה לזיהוי מולקולות ביולוגיות, יש מגבלה חשובה אחת - הם אינם מסוגלים להבחין בין אנטיגנים החולקים דטרמיננטים אנטיגניים. לדוגמה, כאשר אלבומין סרום בקר משמש לחיסון בעל חיים, תאי B עם משטח שונה Ig יגגיב דטרמיננטים אנטיגניים שונים על אלבומין סרום בקר. התוצאה היא תערובת של נוגדנים באנטיריום. מכיוון שארבומין בסרום בקר חולק כמה אפיטופים עם אלבומין בסרום אנושי באזורים השמורים אבולוציונית של החלבון, זה סרום אנטי-בקר אלבומין אנטי-וירוס יגיב גם עם אלבומין סרום אנושי. לכן, תרופה זו לא תהיה שימושית להבחנה בין אלבומינים של בקר וסרום אנושי.
מספר גישות ננקטו כדי להתגבר על בעיית הספציפיות של אנטי-זירה פוליקלונלית. האחת היא על ידי ספיגת הנוגדנים הלא רצויים על ידי העברת האנטי-אנרגיה דרך עמוד כרומטוגרפיה של אנטיגנים משותקים (2). שיטה זו היא מייגע ולעתים קרובות לא מסוגל להסיר לחלוטין את הנוגדנים לא רצויים. גישה נוספת היא לבודד תאי B בודדים המייצרים נוגדנים ולהרחיב אותם בתרבית. עם זאת, כמו רוב התאים הרגילים ללא תימוץ, תאי B אינם שורדים בתרבית ארוכת טווח.
כדי להתגבר על חוסר היכולת של תאי B לשרוד בתרבות, גישה אחת היא להכין היברידית של תאי מיאלומה-B. בשנת 1847, הנרי בנס-ג'ונס גילה כי חולים עם מיאלומה נפוצה, גידול לימפואידי, ייצרו כמות גדולה של נוגדנים (3). תאי B בחולים אלה הפכו ממאירים וגדלים ללא שליטה. מכיוון שתאי B הממאירים נגזרים משיבוט יחיד, הם זהים ומייצרים רק סוג אחד של נוגדן (כלומר,נוגדן חד שבטי, או mAb). עם זאת, רוב תאי מיאלומה אלה מייצרים נוגדנים של פרטים לא ידועים. בשנת 1975, על ידי היתוך תא מיאלומה לתא B, הצליחו סזאר מילשטיין וז'ורז ' קולר לייצר הכלאה שניתן לתרבות ללא הגבלת זמן במבחנה ומייצרת מספר בלתי מוגבל של נוגדנים חד שבטיים של ייחודיות אנטיגנית ידועה (4). הרציונל מאחורי הגישה שלהם הוא לשלב את המאפיינים האלמותיים של תא המיאלומה ואת הנוגדן המייצר תכונות של תא B. הטכניקה שלהם חוללה מהפכה בייצור הנוגדנים ומספקת אמצעי רב עוצמה לזיהוי וטיהור של מולקולות ביולוגיות באמצעות נוגדנים חד שבטיים.
בדרך כלל, הכנת נוגדן חד שבטי דורשת מספר חודשים. ההליך הכללי כולל את השלבים הבאים:
פרוטוקול זה מתמקד בשלב האחרון - צמיחת ההיברידיות והכנת הנוגדן המונוקלונלי. הנוגדן מטוהר מן התרבות supernatant על ידי משקעים אמוניום גופרתי (המכונה לעתים קרובות מלח החוצה) - שיטה נפוצה של הסרת חלבונים מפתרון. חלבונים בתמיסה יוצרים קשרי מימן, יחד עם אינטראקציות הידרופיליות אחרות, עם מים דרך הקבוצות הקוטביות והאיוניות החשופות שלהם. כאשר מוסיפים ריכוזים של יונים קטנים וטעונים מאוד (כגון אמוניום או סולפט), קבוצות אלה מתחרות עם החלבונים לקשירה למים. זה מסיר את מולקולות המים מן החלבון ומקטין את המסיסות שלה, וכתוצאה מכך משקעים של החלבון.
הערה: טכניקת תרבית תאים סטרילית צריכה להישמר בעת טיפול בתאי ההיברידימה ובמדיה באופן סטרילי (למשל, בארון בטיחות ביולוגית) עד לצעדי טיהור הנוגדנים.
1. הפשרת תאי היברידיה קפואים
באמצעות פרוטוקול זה, השגנו את התוצאות הבאות עם מספר הכלאות שונות:
הכלאה: RB6-BC5 (עכבר נגד עכבר Ly6C/ Ly6G (Gr1) IgG2b, κ mAb)
מנת יתר280 - 1.103
(1.103/1.43) (20) = 15.42 מ"ג/מ"ל
הכלאה: GK1.5 (עכבר נגד עכבר CD4 IgG2b, κ mAb)
מנת י?...
ההליך המתואר לעיל הוא דרך פשוטה וישירה קדימה לטהר נוגדנים חד שבטיים מתרבות היברידית. חשוב לזכור, עם זאת, כי אמוניום גופרתי יהיה לזרז חלבונים אחרים שעשויים להיות בתרבות supernatant. כתוצאה מכך, ריכוזי הנוגדנים שנקבעו ממדידות הספיגה הם הערכות. המשתמש עשוי לרצות להעריך את הטוהר של המדגם המחויג על ?...
Skip to...
Videos from this collection:
Now Playing
Immunology
42.9K Views
Immunology
91.8K Views
Immunology
22.3K Views
Immunology
235.0K Views
Immunology
28.1K Views
Immunology
77.8K Views
Immunology
53.0K Views
Immunology
42.7K Views
Immunology
87.0K Views
Immunology
23.9K Views
Immunology
21.9K Views
Immunology
151.3K Views
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved