1. הכנה

1. לפני שתתחילו, לבשו כפפות מעבדה וביגוד מגן מתאים.
2. לחטא את כל כלי הניתוח, תחילה עם חומר ניקוי ולאחר מכן עם 70% אתנול ולאחר מכן יבש ביסודיות.
3. הכן 50 מ"ל מתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) המכילה סרום עגל עוברי 2% (FCS).

2. ניתוח

1. באמצעות מערכת אספקת פחמן דו חמצני, להרדים את העכבר על ידי היפוקסיה. אבטחו את העכבר המתת חסד על צלחת ניתוח בתנוחת העפרוניזציה ובצעו לפרוסטומיה אורך באמצעות מספריים ומלקחיים.
2. באמצעות מלקחיים להזיז את המעיים ואת הבטן בצד ימין של הבטן כדי לחשוף את הבטן ואת הטחול. הטחול מחובר לקיבה.
3. באמצעות מלקחיים בזהירות לנתק את הטחול מן הבטן ומניחים אותו על צלחת פטרי המכיל 5 מ"ל של HBSS 2% FCS.

3. בידוד תאי מערכת החיסון

1. מניחים את הטחול על מסננת תא 40 מיקרומטר מעל צלחת פטרי. למחוץ את הטחול עם בוכנה כדי לנתק אותו.
2. לשחזר את התאים דבק על ידי שטיפה הבוכנה ואת מסננת עם 1 מ"ל של HBSS 2% FCS.
3. מעבירים את הטחול והמנותק לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
4. לשטוף את צלחת פטרי עם 5 מיליליטר של HBSS 2% FCS ולהעביר את הנוזל לצינור 15 מ"ל.
5. צנטריפוגות הצינור ב 370 x g במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant הימנעות הכדור.
6. resuspend הכדור ב 2 מ"ל של אשלגן אמוניום כלוריד צינור מעלה ומטה כדי resuspend הכדור ולזר את אריתרוציטים.
7. המתן 2 דקות והוסף HBSS 2% FCS לכדור resuspended כדי להשיג את הנפח עד 14 מ"ל.
8. צנטריפוגות הצינור שוב ב 370 x גרם במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס. להשליך את supernatant ו resuspend הכדור ב 5 מ"ל של HBSS 2% FCS על ידי צנרת למעלה ולמטה.
9. ספירת התאים באמצעות בדיקות כתמים כחולות טריפן והתאמת ריכוז התא הסופי ל- 10⁷ תאים/מ"ל באמצעות נפח מתאים של HBSS 2% FCS.

4. העברה מאמצת

1. העברה 2 מ"ל של השעיית תא המתקבלת בצינור איסוף 5 מ"ל.
2. צנטריפוגות הצינור ב 370 x g במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להשליך את supernatant.
3. resuspend הכדור ב 2 מ"ל של PBS וצנטריפוגה הצינור ב 370 x גרם במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס.
4. להשליך כדורי supernatant ו resuspend ב 200 μL של PBS.
5. באמצעות מזרק 0.5 מ"ל עם מחט 29G להזריק 200 μL של השעיית תא לתוך העכבר הניסיוני תוך ורידי לתוך סינוס הדם רטרו-מסלולית.
6. כמו שליטה, להזריק עכבר שני באותו סינוס דם עם 200 μL של תמיסת מלח חוצץ פוספט.

5. תאים קציר וכתמים

1. ארבעה ימים לאחר ההעברה המאמצת, להרדים עכברים ולהסיר את הטחול.
2. קוצר את הטחול כמתואר בסעיף 3.
3. העבר 100 μL של השעיות תא מכל עכבר לשני צינורות FACS, שכותרתו "שליטה" ו "הועבר".
4. צנטריפוגות הצינור ב 370 x g במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להשליך את supernatants.
5. הכן תערובת המכילה את ארבעת הנוגדנים בדילול המפורט בטבלה 1.

טבלה 1: קומפוזיציה לערבב נוגדנים. ארבעה קוקטיילים נוגדנים הכנה באמצעות מצומדים נוגדנים-פלואורסצנטיים מרוכזים ו- HBSS.

6. מוסיפים 100 μL של התערובת לכל צינור, ולאחר מכן לדגור במשך 20 דקות על קרח בחושך.
7. הוסף 1 מ"ל של HBSS 2%FCS ולאחר מכן צנטריפוגות הצינורות ב 370 x גרם במשך 3 דקות ב 10 °C.
8. להשליך את supernatants ו resuspend הכדורים ב 200 μL של HBSS 2% FCS.
9. העבר את התאים המותפנים מחדש לצינורות FACS חדשים ומסומנים בתווית.
10. באמצעות ציטומטריית זרימה, כפי שמוצג בפרוטוקול FACS, להעריך את נוכחותם של לימפוציטים חיוביים CD45.2.

6. ניתוח נתונים

1. פתח את תוכנת "FlowJo" וגרור את הקבצים עבור כל צינור בחלון "כל הדוגמה".
2. לחץ פעמיים על הקובץ "הועבר" כדי להציג את התאים שנרשמו מאותה דגימה על חלקת נקודות המציגה פיזור קדימה "SSC-A" על ציר Y ופיזור צדדי "FSC-A" על ציר X.
3. לחץ על "מצולע" וצור אסטרטגיית הגינג לבחירת לימפוציטים, לאחר מכן הבחין בין תאים תורמים ומארחים באמצעות סמני פני השטח של התא (CD45.1, CD45.2) ולאחר מכן מאפיין את CD45.2⁺ אוכלוסיית התאים (CD3, CD4).
4. חזור על שלבי הניתוח עם קובץ "עכבר הבקרה".
5. כדי להציג באופן חזותי אוכלוסיית תאים, לחץ על "עורך הפריסה".
6. גרור את "התאים שהועברו" ואת " האוכלוסייה "תאים שהועברו CD4" מ "הועבר" ו "פקד" קבצים אל " הכרטיסיהעורך פריסה".
7. תיימת נקודות המייצגת CD45.2⁺ תאים ולימפוציטים CD4 תופיע.
8. תאים שהועברו על - CD45.2 אמורים להופיע רק ב" עכברהמועבר" בתכנון הנקודות .