1. הגדרת

מאגרים ריגנטים

1. תמיסת מלח סטרילית עם אגירה בפוספט (PBS) ללא סידן או מגנזיום
2. חוצץ ציפוי - PBS סטרילי או חוצץ קרבונט
3. דילול אסאי - 10% סרום בקר עוברי (FBS) ב- PBS
4. תרבית תאים בינונית - RPMI 1640 עם 10% FBS, פניצילין/סטרפטומיצין, ו- L-גלוטמין
5. מאגר כביסה - PBS המכיל 0.05% Tween20
6. מים מזוקקים כפולים (ddH₂O)
7. מצע זיהוי - 100 מ"ג AEC (3-אמינו-9-אתיל-קרבזול) ב-10 מ"ל DMF (N,N, דימתילפורמיד).

ציוד

8. מכסה המנוע של זרימה למינאר
9. אינקובטור לח (מוגדר ב 37°C, 5% CO₂)
10. קורא ELISPOT אוטומטי או מיקרוסקופ ניתוח

חומרים

11. לוחות אליספוט
12. מאגרים סטריליים ולא סטריליים
13. פיפטורים וטיפים
14. פיפטות סרולוגיות סטריליות
15. צינורות פוליפרופילן סטריליים חרוטיים
16. שני בקבוקי סחיטה לשטיפת צלחת

ריאגנטים ספציפיים לאסיי

17. תאים- תאים ראשיים או קווי תאים (כאן, נעשה שימוש בטחול מ- C57BL/6 עכברים)
18. ממריצים- מיטוגן או אנטיגן (כאן, פוטבול 12-myristate 13-אצטט (PMA, 50 ng/mL) ויונומיצין (1 מיקרומטר) שימשו)
19. נוגדן ראשוני - אנטי ציטוקינים ביוטילציה גילוי נוגדן (מדולל ל 2 מיקרוגרם / מ"ל בדלל אסאי)
20. נוגדן משני- פרוקסידאז סטרפטאבידין-חזרת (SAv-HRP)

2. הליך

ציפוי

1. שמירה על התנאים סטריליים ובתוך מכסה המנוע זרימה למינאר, לדלל את נוגדן לכידת אנטי ציטוקינים מטוהר לריכוז סופי של 0.5-4.0 מיקרוגרם / מ"ל במאגר ציפוי סטרילי. (הערה: עבור IFN- γ ו- IL-6 להשתמש 5 מיקרוגרם / מ"ל).
2. העבר את פתרון נוגדני לכידת, 100 μL / well, ללוח ELISPOT.
3. מכסים את הצלחת בכיסוי צלחת ולאטום אותה כדי למנוע אידוי.
4. לדגור על הצלחת לילה ב 4°C.

חסימת

5. למחרת, לחשוף את צלחת ELISPOT במכסה המנוע זרימה למינאר. הפוך במהירות את הצלחת על מגבונים סטריליים כדי להסיר את פתרון נוגדני לכידת מכל באר.
6. לאחר מכן, הוסף 200 μL של תרבית תאים מדיום לכל באר. שלב זה יחסום כריכה לא ספציפית במהלך ההסתה.
7. החליפו את כיסוי הצלחת ודגרו את הצלחת במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.

ציפוי והפעלת תאים

8. בזמן הלוח הוא דגירה, להכין פתרון mitogen 2X המכיל 50 ng / mL PMA ו 1 μM ionomyצין במדיום תרבית התא.
9. לאחר מכן, להכין השעיות הסלולר היעד לריכוז מלאי של 2 x 10⁶ תאים / מ"ל.
10. לאחר הדגירה הושלמה, להסיר את המדיום תרבית התא מכל באר על ידי היפוך מהיר את הצלחת על מגבונים סטריליים בתוך מכסה המנוע זרימה למינאר.
11. לאחר מכן, צור דילול טורי פי 2 של פתרון ההשעיה של תא המלאי. כדי לעשות זאת, תחילה להוסיף 200 μL של פתרון מלאי מתלה סלולרי מוכן לתוך בארות בשורה העליונה של צלחת ELISPOT.
12. לאחר מכן, הוסף 100 μL של תרבית תאים רגילים בינוני לחמש השורות הבאות של הלוח מתחת לשורות המכילות פתרון מלאי סלולרי.
13. לאחר מכן, בצע דילול טורי פי 2 על ידי צנרת 100 μL של המתלה הסלולרי מהשורה העליונה לשורה ישירות מתחת. ודא ערבוב נכון על ידי צנרת בעדינות פתרון זה למעלה ולמטה כדי להבטיח אפילו להפיץ את התאים.
14. חזור על תהליך זה עבור ארבע השורות הנותרות.
15. השאר את השורה השישית עם מדיום התרבות בלבד. זה ישמש כשליטה ניסיונית.
16. לאחר מכן, להוסיף 100 μL של פתרון מיטוגן מוכן הבארות הניסיוניות של חמש השורות הראשונות של הלוח. בבארות הבקרה והשורה השישית, הוסף 100 μL של מדיה תרבית התא ללא מיטוגן.
17. החליפו את כיסוי הצלחת ואת צלחת הדגירה ב 37°C, 5% CO₂ באינקובטור במשך 20-48 שעות. (הערה: 20-24 שעות בדרך כלל מספיק לאיתור IL-2 ו- TNF- α, בעוד 48 שעות הוא אופטימלי עבור IL-4 ו- IFN-γ).

זיהוי

נוגדן ראשי

18. הכן את נוגדן אנטי ציטוקינים ביוטינילה לריכוז של 2 מיקרוגרם /מ"ל בדילול אסאי.
19. הכן 20-25 מ"ל של חוצץ כביסה בשלב זה על ידי ערבוב 0.05% Tween-20 ב- PBS.
20. לאחר הדגירה הושלמה, לפתוח את הצלחת במהירות הפוך אותו על כיור כדי להסיר את כל הנוזל מן הבארות. (הערה: לאחר נקודה זו הצלחת כבר לא צריך להישמר סטרילי).
21. לאחר מכן, לשטוף את הצלחת על ידי הוספת ~ 200 μL לשטוף חוצץ לכל באר. לגרש את הנוזל הזה על ידי היפוך מהיר והטלת הצלחת מעל כיור. חזור על תהליך זה בסך הכל חמש כביסות.
22. לאחר מכן, להוסיף 100 μL של ביוטיניל מדולל אנטי ציטוקינים גילוי פתרון נוגדנים לכל באר. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעתיים בטמפרטורת החדר או בלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

נוגדן משני

23. לאחר השלמת הדגירה, לגרש את נוגדן הזיהוי על ידי היפוך והטלת הצלחת מעל הכיור.
24. כמו קודם, לשטוף את הצלחת 5 פעמים עם ~ 200 μL לשטוף חוצץ, גירוש הנוזל בין כל לשטוף.
25. לאחר מכן להוסיף 100 μL של פתרון peroxidase סטרפטאבידין-חזרת מדולל לכל באר (מדולל לריכוז האופטימלי שנקבע מראש בדילול אסאי).
26. החליפו את כיסוי הצלחת ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה וחצי-שעתיים ב-37°C.

המצע

27. לאחר הדגירה, לא יותר מ 15 דקות לפני השימוש, הראשון להפעיל פתרון מצע AEC על פי הוראות היצרן.
28. לאחר מכן, להשליך את התוכן של הבארות לשטוף את הצלחת חמש פעמים עם חוצץ לשטוף, כמו קודם.
29. לאחר מכן, מיד להוסיף 100 μL של פתרון מצע AEC מוכן לתוך כל באר.
30. לדגור על הצלחת בטמפרטורת החדר במשך ~ 10-20 דקות תוך ניטור התפתחות המקום.
31. עצור את התגובה על ידי שטיפה של הצלחת במים והזזת הצלחת מעל הכיור.
32. כתם את הצלחת על מגבות נייר ולאפשר את הצלחת לאוויר יבש לילה או עד שהוא יבש לחלוטין. הסרת מגש הפלסטיק מתחת לצלחת תקל על הייבוש.

3. רכישת נתונים וניתוח נתונים

1. לאחר הייבוש, הכתמים מוכנים לספירה עם קורא לוחות אוטומטי. כאן, קורא חיסון CTL משמש, אבל פרוטוקול זה יכול להיות מותאם עבור כל קורא.
2. קודם תדליק את המכשיר, אחר כך את המחשב. לאחר מכן, פתח את תוכנית ה- CTL ולחץ על "ספירת סריקות".
3. לחץ על "נפלט" כדי שהמגש יימשך מהמכונה. לאחר מכן, להסיר את מתאם פלסטיק וליישר שורה "A" על צלחת ELISPOT ומתאם.
4. בחר שם קובץ ומיקום לשמירת הקובץ וטען את הצלחת על המגש.
5. לאחר מכן, לחץ על "לטעון" על התוכנה ולסגור את הדלת בצד של המכונה.
6. לחץ על "התחל- לאחר הספירה". ודא שהקובץ נשמר ולאחר מכן פתח את תוכנת בקרת האיכות "QC" כדי לנתח את הנתונים ולספור את מספר המקומות.

הערות:

1. המספר המינימלי של תאים צריך להיקבע בניסויים ראשוניים. המספר האופטימלי של כתמים הוא ~ 50 / טוב. אם תאים רבים מדי נטענים, יהיה קשה לזהות נקודות נפרדות. בנוסף, התאים יחפפו ולא יוכלו ליצור monolayer על הממברנה, ולכן רמת הזיהוי עשויה להיות מופחתת.
2. בעת אופטימיזציה של הניסוי, שקול את רמת הביטוי הצפויה של חלבון היעד. עם הביטוי נמוך יותר, כך מספר התאים הנדרש לבאר גבוה יותר.
3. שלא כמו אליסה, עדיף לשטוף את הצלחת ביד ולא להשתמש מכונת כביסה צלחת. לוחות ELISPOT הם עדינים יותר ויש להימנע ניקוב קרום PVDF.
4. יש להגביל את תנועת הצלחת במהלך תקופת הדגירה כפי שהוא יכול לגרום כתמים כתם.
5. לוחות צריך להיות מאוחסן בחושך, כמו חשיפה לאור ישיר גורם כתמים לדעוך.