ברצוננו להודות יוני ימאמוטו לעיצוב שלו ובנייה של מכשיר אוטומטי, ממונע מסלף tetrode המתואר בסרט. בנוסף, ברצוננו להודות לכל חברי בעבר ובהווה וילסון מעבדה על תרומתם כונן מיקרו והטכנולוגיה tetrode הפיתוח במעבדה.

1. המצאה של tetrodes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין בניית tetrode אחד על ידי קבלת 50 ס&quot;מ, polyimide מבודדים, Ni-chrome תיל עם ליבה בקוטר 12.5 מיקרון. מקפלים את החוט לשניים. הפעל את האצבעות לאורך צמד כדי לגרום להם להישאר ביחד. ודא זוג חוטים יש מגע טוב לאורך כל אורכו שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקפלים את הצמד שוב על ידי מחזיק את שני הקצוות יחד. ודא כי לולאה נוצר בצד אחד אינו מפותל. חותכים את ארבעת החוטים בצד הלא כרך כך ארבעה טיפים מיושרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לשלב הבא, תצטרך קליפ תנין שונה, מכשיר מפנה ממונע, וכן פס אופקי מעל המכשיר מפנה. קליפ תנין הוא שונה על ידי הדבקת פס פלסטיק לבסיס של קליפ. איפה את הטיפים תיל חשופים, מהדק את ארבעת החוטים יחד עם קליפ תנין שונה. לתלות את הלולאה של חוטים על הבר אופקי. מניחים את קליפ תנין לשלב ממונע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 80 החל השעון מבחינת פיתולים פיתולים ואחריו 40 השעון מבחינת בניגוד צרור את החוט במהלך כשלוש דקות. פרמטרים אלה יכולים להיות מגוונים בהתאם לצרכים שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי סיבוב tetrode הושלמה, הפתיל את החוטים יחד על ידי חימום משלוש זוויות שונות עם אקדח חום (420 ° C או 790 ° F), תוך שימוש בינוני נמוך לזרום. עבור כל זווית, להתחיל 1-2 ס&quot;מ מתחת שבו צרור חוט מתפצל, להפעיל את האקדח חום למעלה ולמטה במרחק של 2 ס&quot;מ מן החוטים כ -5 שניות. היזהר כמו טמפרטורות גבוהות לחלוטין להמיס את הבידוד להוביל קצרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו החוטים יש התמזגו יחד, להסיר את tetrode מן המנגנון מתפתל בעדינות על ידי הרמת קליפ תנין כדי להקל על המתח tetrode, וחתך את tetrode ליד קליפ תנין. בקצה השני, לחתוך את הלולאה כך יש ארבעה גדילים לא מלוכדות של תיל באורך שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להפריד בין גדילים בודדים בחלק העליון על ידי כיפוף בעדינות את החוטים עם פינצטה היטה רך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tetrode מוכן כעת טוען לתוך מערך מיקרו הכונן. בצע 21-25 יותר tetrodes ולאחסן אותם בתוך קופסה אבק חינם עד שהגיע הזמן בתהליך הטעינה tetrode. </li></ol> 2. טעינת tetrodes וחוטי הקרקע לתוך מערך מיקרו הכונן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמשיך, תצטרך מערך שלם מיקרו הכונן. אם לא נבנה עוד אחד, להפנות את הווידאו &quot;מערך כונן מיקרו עבור כרוני ב-vivo הקלטה:. ייצור כונן&quot; בתוכנית העיצוב שלנו, tetrode תצורף בקצה אחד לחומרה מחבר, ולא יפעלו דרך polyimide צינור המוביל כונן המיקרו כזה טיפים אלקטרודה להאריך מתחת לבסיס של מערך כונן המיקרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחילים, לבנות בעל הכונן יכול להיות מחובר ללוח מחבר בצד אחד, בצד השני, יכול להיות מהודק ידי panavise. בדוגמה זו, בעל הכונן מחבר הטחנה-max מודבק בקצה אחד של הידית X-ACTO סכין (איור 1 ג&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזקת tetrode עם פינצטה היטה רך באמצעות stereoscope, לדחוף את קצה tetrode לתוך polyimide צינור המוביל של אחד מיקרו כוננים. לחצו על tetrode לתוך הצינור עד חוטים בודדים קרובים אלקטרודה ללוח מחבר בראש מערך הכונן. היזהר לא שריטה או לכופף את החוטים, כמו זה יגרום tetrode להזין את המוח בזווית, ולא בניצב, ואת תחליש את שלמות tetrode. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להאכיל את הקצה השני של ארבעת החוטים לחורים שלהם בלוח אלקטרודה ממשק באמצעות פינצטה היטה רך. שוב, יש להימנע מסתלסל או לכופף את החוטים. עם כל ארבעת החוטים במקום, לדחוף את סיכות זהב לתוך החורים שלהם עם צבת כי יש הלסת התחתונה מקוצר. כאשר הפינים נדחפים לתוך החור, הם רצועת בידוד חוט וליצור חיבור חשמלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעיון מאוחר יותר, לעקוב אחר מיפוי בין מיקרו כוננים עמדה פינים על הלוח ממשק אלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך טעינה כולל של 18 tetrodes. שלושת הנותרים מיקרו כוננים במערך ישמש לבית אלקטרודות התייחסות. אלקטרודה כל התייחסות עשוי tetrode המשתמשת רק אחת מארבע קצות חוט מחוברים. כדי להצמיד את האלקטרודות הפניה, בצע את ההליך טוען לצרף אבל רק אחת מארבע אלקטרודות את הסיכה אלקטרודה בהתאמה התייחסות על הלוח מחבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתם מתכננים רב אתר הקלטות, זה עשוי להיות כדאי לתכנן את החיבורים בין tetrodes ללוח מחבר מראש. זה אמור לצמצם את האפשרות של התאמת tetrode טועה במהלך הניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טעינת tetrode הושלמה, לעשות שני חוטים הקרקע, אחד עבור החיה ואחד חרוט מגן. גזור אחד &quot;חוט ארוך פלדה מבודדים (טקסט: 0.005&quot; 6 קוטר) ולהסיר 3 מ&quot;מ של בידוד, באמצעות פינצטה מתכת, מקצה אחד של התיל. ואז לחתוך 4&quot;תיל פלדה מבודד ארוך (טקסט: 0.005 &#39;קוטר). הסרה של 3 מ&quot;מ של בידוד בקצה אחד 1 ס&quot;מ בקצה השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסלול חוט הקרקע &quot;6 דרך החור בצד של מערך מיקרו הכונן לכיוון הלוח ממשק. חבר את חוט חשוף הלוח ממשק אלקטרודה עם סיכת זהב ב חור באדמה המיועד. חוט זה יתחבר הגולגולת של החיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרקע כביש 4 &quot;חוט תיל במקביל את הקרקע שהותקנו בעבר. חבר את הקצה הפשיטו 3 מ&quot;מ ללוח אלקטרודה ממשק משתמש סיכת זהב חור נוסף בשטח המיועד. חוט זה יהיה מאוחר להיות מחובר חרוט מגן, אשר ישמש כלוב פאראדיי קטן כדי להפחית את רעש טנדר. אנחנו סיים עכשיו חוטי חיבור יכולה להמשיך עם זיקוק tetrodes שלנו. </li></ol> 3. קביעת אורך tetrodes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המטרה שלנו בתהליך הזה היא לחתוך את כל tetrodes כך שהם מעט יותר לעומק את מבנה המוח היעד. בדוגמה שלנו, מיקרו הכוננים מיועדים נסיעה מקסימלית של 5-6 מ&quot;מ, מספיק כדי להגיע לאזורים רבים neocortical ההיפוקמפוס הגבי של חולדה בוגרת. ראשית, נמוך כל מיקרו כוננים כך tetrodes נחשפים מרבית. במקביל לחתוך את כל tetrodes מאמצים כי כ 5 מ&quot;מ יותר באורך הסופי הרצוי באמצעות מספריים חדים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשביל לחתוך הסופי, להכין זוג משונן מספריים panavise. קלאמפ ידית אחת עם זווית כלפי מטה קלה עם serrations כלפי מעלה, תוך השארת ידית אחרים תלויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו לסגת לחלוטין את כל tetrodes לתוך צינורית המדריך שלהם על ידי סיבוב מיקרו כוננים למעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש stereoscope, מלא להאריך one tetrode מתוך הצינורית שלו. שימוש, שליט עמדת מספריים משונן במרחק הרצוי מן הצינורית מדריך. לאט ובעדינות לחתוך את tetrode בתנועה אחת חלקה. אחרי זה tetrode נחתך, למשוך את מיקרו כונן על ידי 3-4 מ&quot;מ. חזור על תהליך זה עבור כל tetrode עד שכל קוצצו. בנקודה זו אתה מוכן ציפוי זהב. </li></ol> 4. ציפוי זהב של tetrodes לבדוק איכות זהב ציפוי את החוטים tetrode nichrome הוא קריטי עבור הקלטות ארוך טווח ויציב. הוא מונע קורוזיה biocompatibility ומשפר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מטר עכבה במצב חיצוני מחולל הנוכחי במצב לבדוק DC עם פלט השמע (איור 1d). מגע שני מוביל של הגנרטור הנוכחי של שישה זוגות אפשרי של ערוצי tetrode בתוך כל אחד, ולהשתמש משוב השמע כדי לקבוע אם קיימת בין זוגות מכנסיים קצרים. אם קיים קצר, מחדש לחתוך את tetrode במספריים משוננת ולבדוק שוב. אם הבעיה נמשכת, לבטל את tetrode ולהחליף אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מכנסיים קצרים בלי שום להתקיים בתוך כל tetrodes, להעביר את כל מיקרו כוננים למטה, הארכת כל tetrodes רחוק ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את תצורת ציוד לבדיקת עכבה אלקטרודה (איור 1e). עכשיו לטבול את קצות כל tetrodes לתוך אמבט של תמיסת ציפוי זהב סטנדרטי. אמבטיה הזהב מחובר חשמלית להוביל החיובי של מד עכבה. בדוק את העכבה של האלקטרודה ידי נגיעה להוביל שלילית של מד עכבה להצמיד המתאים על הלוח מחבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד ורשום את עכבה של חוט על כל מערך מיקרו הכונן. ערכים רגילה נע בין 1-3 MOhm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על גנרטור הנוכחי, הגדר הנוכחית בין 1-3 μA. בשלב הבא, מאובטח לצרף את ההובלה שלילית של מד עכבה להצמיד בלוח מחבר. הנח את הציוד לתוך תצורת electroplating (איור 1f). על מד עכבה, לעבור במהירות ממצב רגיל, כדי לעקוף מצב, ובחזרה. במצב לעקוף, הנוכחי יעבור tetrode פתרון זהב, זהב יהיה מצופה על קצה האלקטרודה. עכבה אחרי כל סיבוב של ציפוי צריך להיות פחות מבעבר. חזור על הדופק הנוכחי אם עכבה לא לרדת מתחת MOhm 1. מגוון השמרני של עכבות מקובל הן על 250kOhm kOhm 350. אם העכבה יורדת מתחת kOhm 200, זה עשוי להצביע על קצר חשמלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם לאחר פולסים חזר עכבה לא טיפה מספיק, קצה האלקטרודה עשוי להיות חסום. Re-לחתוך את tetrode, לחפש מכנסיים קצרים, חוזרים על תהליך ציפוי זהב. אם מחדש חיתוך לא עוזר, להחליף את tetrode ולהתחיל מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ציפוי כל tetrodes, לטבול את קצות tetrode בקצרה אתנול, ולתת להם להתייבש במשך 3 עד 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחן קצר מעגלים בתוך tetrodes באמצעות מחולל זרם בקצות tetrode חשוף לאוויר. אם חיבור DC הקיים בין שניים או יותר של אלקטרודות tetrode, מחדש לחתוך את tetrode, צלחת עם זהב שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ציפוי הזהב של כל tetrodes תושלם, להוסיף טיפה של דבק בעובי בינוני cyano-Acrylate לממשק בין כל tetrodאלקטרוני שלה polyimide צינורות. זה יהיה להבטיח את tetrode לנהוג מיקרו שלה ולשמור על אורך tetrode. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כצעד סופי, להעביר את כל tetrodes לכונן ידי הפיכת כל מפשל. </li></ol> 5. הצמדת חרוט מגן המטרה של חרוט מגן הוא מגן מיקרו כוננים חוט tetrode נחשפים מהסביבה. הוא גם מספק תמיכה לטיפול במהלך ניסוי ומפחית רעש חשמלי. אנו משתמשים 3-D קונוס פלסטי מודפס (חלק הפניה אני: ייצור הכונן). עם זאת, ניתן להפוך את הקונוס מחומרים אחרים, כמו חתיכת כפוף סודה יכול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את חרוט הפלסטיק לתקן כמה קלטות רדיד אלומיניום על משטח פנימי או חיצוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לקדוח חור קטן (1.5 מ&quot;מ קוטר) דרך חרוט ו רופף לצרף הבורג עם מכונת כביסה אגוז בתוך חרוט. זה ישמש למעבר חוט חשמל עבור הקרקע. אנו ממליצים להשתמש בורג 0-80 גודל שילוב מכונת כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להוסיף חלקית סיבוב של שלוש ברגים בגודל 1-72 (16/03 ס&quot;מ אורך) אל צידי חרוט. עם מערך הכונן מושעה, הכנס את חרוט על הכונן. ודא שני חוטים הקרקע להאריך מהחלק התחתון של מערך הכונן. לעטוף את החלק החשוף של חוט האדמה &#39;4 סביב אחד הברגים 1-72 כמה פעמים להדק את הבורג בחוזקה. אבטח את חרוט לבסס את הכונן על ידי הידוק שני הברגים הנותרים חרוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, לוקחים את 1 ס&quot;מ של חוט סוף הפשיטו את הקרקע קצר רוח אותו סביב הבורג, בין הקלטת לסכל מכונת כביסה. אבטח את הקרקע על ידי הידוק בורג. עכשיו יש לנו מערך מיקרו הכונן כי הוא סוף סוף מוכן להשתלה כירורגית. </li></ol> 6. נציג תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micro-כונן מערך הייצור הושלמה. מערך מיקרו הכונן שלכם היא עמוסה 18 tetrodes ו 3 ערוצי התייחסות. הוא עטוף חרוט כובע המגן על עמידות. מערך סיים מיקרו הכונן עם חרוט מגן שוקל 20 גרם עד 25 גרם בממוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערך הכונן סיים הוא מושתל באמצעות הליך כירורגי רגיל. כפי שניתן לראות, הכונן מחובר שבב מגבר קדם ואת צרור של חוטים שמעבירים את האות חומרה רכישת נתונים ותוכנה. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1098/CompositeFigure1_highqualityn.jpg" alt="דמות 1" /> איור 1: סכמטי) של תצורת פיתול tetrode. פס אופקי משהה את החוטים לא מחוברים אלקטרודה של tetrode מעל התקן tetrode אוטומטיות פיתול. B) הגדרת למדידת עכבה tetrode ו ציפוי האלקטרודה. כאשר בדיקת קצרים, מעגל שונה:. החוט השחור מחובר לערוץ אחר אלקטרודה על הלוח מחבר C) תקריב של מנהג עשה כונן מיקרו בעל כלי המערך. סרגל גלילי הוא לטפל X-Acto סכין. המחבר הוא 26 פינים, שורה כפולה, מיל-max מחבר. שני החלקים מחוברים יחד באמצעות אקריליק שיניים. D) תצורת לבדיקת קצר. ערוץ X ו-Y הם כל ערוץ שני ערוצים שונים של ארבעה ערוצי tetrode. E) תצורת למדידת עכבה האלקטרודה. המקור הנוכחי הוא &#39;כבוי&#39;. מטר עכבה מוגדר &#39;על&#39; ו &#39;מבחן&#39;. F) עבור תצורת ציפוי זהב של טיפים אלקטרודה. המקור הנוכחי מוגדר &#39;על&#39;, הוא שמע &quot;על&quot;, מצב זה &#39;חד קוטבי &quot;, מבחן DC היא&#39; על &#39;, הנוכחי מוגדר 2 microamps.

<ol>
	<li>Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrodes+markedly+improve+the+reliability+and+yield+of+multiple+single-unit+isolation+from+multi-unit+recordings+in+cat+striate+cortex.">Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex.</a> J. Neurosci. Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).</li></ol>

פרוטוקול זה הוא הפרק השני של פרוטוקול חלק שני: &quot;Micro-כונן מערך עבור כרוני ב-vivo ההקלטה.&quot; השילוב של מערך הכונן מיקרו tetrode הוא כלי רב עוצמה להשגת הקלטות סימולטני של נוירונים רבים ער, מתנהג הכנה של בעלי חיים. יש לקוות, סיפקנו לכם את כל המידע הדרוש תצטרך להתחיל או לשפר את ה...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Panavise</td>
<td>Tool</td>
<td>Panavise</td>
<td>Model 301</td>
<td>Holds either micro-drive array or serrated scissors</td>
</tr>
<tr>
<td>Modified Xcelite 378M Pliers</td>
<td>Tool</td>
<td>Newark</td>
<td>96F8903</td>
<td>For inserting connector board pins. To make, remove 2mm from one tip of the pliers.</td>
</tr>
<tr>
<td>Slow Cure Glue</td>
<td>Material</td>
<td>Great Planes (Champaign, IL)</td>
<td>GPMR6015</td>
<td>To glue the tetrode to the micro-drive</td>
</tr>
<tr>
<td>Gold Plating Solution</td>
<td>Material</td>
<td>Neuralynx</td>
<td>Sifco Selectron Gold NC</td>
<td>Contains gold particles for electroplating</td>
</tr>
<tr>
<td>Current Generator</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>A365D-B</td>
<td>A.K.A. Stimulus Isolator. Used to electroplate gold solution onto electrode tips.</td>
</tr>
<tr>
<td>Impedance Meter</td>
<td>Tool</td>
<td>BAK Electronics</td>
<td>IMP-1 / 6662 / 2788</td>
<td>To check impedance of electrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>Hot Air Gun</td>
<td>Tool</td>
<td>Steinel (Germany)</td>
<td>HG 3002 LCD</td>
<td>To fuse electrodes together to make tetrode</td>
</tr>
<tr>
<td>Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers</td>
<td>Tool</td>
<td>Aven (Ann Arbor, MI)</td>
<td>18768 (Pattern 304)</td>
<td>For handling tetrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>Alligator Clip</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>18050-35</td>
<td>A.K.A. Bulldog serrefine. To clip the tetrodes together during twisting</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Dissecting Scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Biomedical Research Instruments</td>
<td>25-1000</td>
<td>For general cutting of tetrode/electrode wire</td>
</tr>
<tr>
<td>Iris Toughcut Serrated Scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14058-09</td>
<td>For final cut of tetrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>Teflon Coated Stainless Steel Wire</td>
<td>Material</td>
<td>A-M Systems (Carlsborg, WA)</td>
<td>790500</td>
<td>Ground wire</td>
</tr>
<tr>
<td>12.5 micron nichrome wire</td>
<td>Material</td>
<td>Kanthal Palm Coast</td>
<td>Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING</td>
<td>Polyimide coated micro-wire for making tetrodes.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tetrode Twister</td>
<td>Tool</td>
<td>Neuralynx</td>
<td>Tetrode Assembly Station</td>
<td>Increases the speed and consistency of tetrode fabrication.

</td>
</tr>
<tr>
<td>Silver Paint</td>
<td>Material</td>
<td>GC Electronics</td>
<td>22-023</td>
<td>For connecting the micro-electrode wires of the tetrode to the connector pins (see Discussion)</td>
</tr>
<tr>
<td>X-Acto Knife Handle</td>
<td>Material</td>
<td>MSC Direct</td>
<td>X3001</td>
<td>For constructing a micro-drive holding device.</td>
</tr>
<tr>
<td>26 Pin, 2 Row Connector</td>
<td>Material</td>
<td>Mill-max</td>
<td>852-10-026-30-001000</td>
<td>For constructing a micro-drive holding device.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly

Tetrode, חבילה של ארבע אלקטרודות, הוכיחה להיות כלי רב ערך עבור הקלטה בו זמנית של מספר רב של נוירונים ב-vivo. ההפרש משרעת פוטנציאל הפעולה של חתימות על ערוצי tetrode מאפשר בידוד של פעילות יחידה אחת מיחידת רב אותות. היכולת לשלוט במדויק את המיקום ואת עומק stereotaxic של tetrode הוא קריטי לחקר פעילות עצבית מתואמת על פני אזורים במוח. בשילוב עם מערך מיקרו הכונן, ניתן להשיג את המיקום המדויק ושליטה יציבה של tetrodes רבים במשך ימים עד שבועות. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים כיצד לפברק tetrodes תנאי שימוש בכלים בסיסיים וחומרים, להתקין את tetrodes לתוך מערך רב כונן tetrode עבור כרוני ב-vivo הקלטה בחולדה, להפוך חוט קשרים הקרקע למערך כונן מיקרו, ואת לצרף חרוט מגן על מערך הכונן מיקרו על מנת להגן על tetrodes מכל מגע פיזי עם הסביבה.

Watch this Scientific Journal Video about Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly at JoVE.com

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לפברק tetrodes תנאי לשימוש עם מערך מיקרו הכונן, אשר תוכנן עבור הקלטות אלקטרו כרונית בחולדות. בנוסף, אנו ממחישים בשלבים הסופיים של הבנייה מיקרו הכונן מערך, הכולל חוטים הקרקע התקנה חרוט מגן.

Micro-Drive Array עבור כרונית In vivo</emהקלטה>: Tetrode האסיפה

The tetrode, a bundle of four electrodes, has proven to be a valuable tool for the simultaneous recording of multiple neurons in-vivo.  The differential ...

micro-drive-array-for-chronic-in-vivo-recording-tetrode-assembly

Research

JoVE Journal

Biology

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

33.1K Views.  MIT - Massachusetts Institute of Technology. בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לפברק tetrodes תנאי לשימוש עם מערך מיקרו הכונן, אשר תוכנן עבור הקלטות אלקטרו כרונית בחולדות. בנוסף, אנו ממחישים בשלבים הסופיים של הבנייה מיקרו הכונן מערך, הכולל חוטים הקרקע התקנה חרוט מגן.

Video: Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

יישום של שרף אור נרפא, דבק שיניים אלקטרודות הרכבה או בדיקות Microdialysis בניסויים כרונית

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. Lightweight recording devices carrying a high density array of tetrodes allow for the simultaneous monitoring of the activity of tens to hundreds of individual neurons. Here we describe a protocol for the fabrication of a micro-drive array with twenty one independently movable micro-drives. This device has been used successfully to record from hippocampal and cortical neurons in our lab. We show how to prepare a custom designed, 3-D printed plastic base that will hold the micro-drives. We demonstrate how to construct the individual micro-drives and how to assemble the complete micro-drive array. Further preparation of the drive array for surgical implantation, such as the fabrication of tetrodes, loading of tetrodes into the drive array and gold-plating, is covered in a subsequent video article.

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

In this protocol we demonstrate how to fabricate a micro-drive array for chronic electrophysiological recordings in rats.

Micro-Drive Array עבור כרונית In vivo</emהקלטה>: כונן ייצור

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

העצרת, טוען, ואת המערך של תא ultracentrifuge אנליטית לדוגמא

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, retina-specific or conditional knockout mouse models often display early lethality or suffer from severe malformations, preventing an analysis beyond embryonic or early postnatal stages.
Primary cell culture is an alternative to investigate the effects of exogenously applied recombinant factors, overexpression of genes or siRNA-mediated gene knockdown in a controlled environment. Dissociated cell culture has the advantage that the endogenous signals reaching the target cells are reduced, thereby facilitating the identification of exogenously triggered effects after pharmacological manipulation. However, important cell-cell interactions are initially destroyed by enzymatic digestion or mechanical dissociation, even if re-aggregated retinospheroid cultures1 are used.
By contrast, organotypic retinal wholemount cultures provide a system close to the physiological in vivo situation with neuronal interactions and connections still preserved2-5.
In this video article we provide a step by step demonstration of (1) the establishment of in vivo-like organotypic retinal wholemount cultures including dissection peculiarities of embryonic, postnatal and adult murine eyes and (2) a dissociation and cytospin procedure for analysis of neuronal apoptosis and retinal cell proliferation in organotypic wholemounts, e.g. after culture in the presence of exogenously applied recombinant factors.

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

This video article demonstrates the establishment of organotypic retinal wholemount cultures and a cytospin procedure for analysis of exogenously induced effects. Organotypic retinal wholemount cultures mimic the in vivo situation and significantly facilitate the accessibility of murine retinas for experimental manipulations while circumventing the disadvantages of classical murine animal models.

בשנת vivo, כמו תרבות Wholemount Murine Organotypic רשתית

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

Ambulatory ECG Recording in Mice

Telemetric ECG recording in mice is essential to understanding the mechanisms behind arrhythmias, conduction disorders, and sudden cardiac death. Although the surface ECG is utilized for short-term measurements of waveform intervals, it is not practical for long-term studies of heart rate variability or the capture of rare episodes of arrhythmias. Implantable ECG telemeters offer the advantages of simple surgical implantation, long-term recording of electrograms in ambulatory mice, and scalability with simultaneous recordings of multiple animals. Here, we present a step-by-step guide to the implantation of telemeters for ambulatory ECG recording in mice. Careful adherence to aseptic technique is required for favorable survival results with the possibility of implantation and recording from weeks to months. Thus, implantable ECG telemetry is a valuable tool for detection of critical information on cardiac electrophysiology in ambulatory animal models such as the mouse. 

Telemetric ECG has emerged as an essential tool in evaluating animal models for cardiac arrhythmias and sudden cardiac death. Here, we present a stepwise guide to telemetric ECG recordings for application in long-term ambulatory ECG monitoring in mice.

רישום א.ק.ג. אמבולטורי ב עכברים

Telemetric ECG recording in mice is essential to understanding the mechanisms behind arrhythmias, conduction disorders, and sudden cardiac death. Although ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

מערך השוואתי הגנום הכלאה (Array CGH) לאיתור של הגנום גרסאות מספר עותק

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

מדידת נזק לדנ&quot;א ותיקון בSplenocytes העכבר לאחר כרוני<em&gt; In vivo</em&gt; חשיפה למינונים נמוכים מאוד של בטא וגמא-קרינה

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

האסיפה והיישום של &#39;טבעות Shear&#39;: מודל האנדותל חדשני Orbital, חד-כיוונית תקופתית נוזלי זרימת מתח שאר

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Micro-Drive Array עבור כרונית In vivo: Tetrode האסיפה