Nos gustaría agradecer junio Yamamoto por su diseño y construcción del dispositivo automático, motor tornado tetrodo se muestra en el video. Además, nos gustaría agradecer a todos los miembros de Wilson pasado y el presente de laboratorio, por sus contribuciones a la micro-drive y el desarrollo de la tecnología tetrodo en el laboratorio.

1. Fabricación de tetrodos <ol><li> Iniciar la construcción de un tetrodo obteniendo una longitud de 50 cm, con aislamiento de poliamida, ni cromo alambre con un núcleo de 12,5 micrones de diámetro. Doble el alambre a la mitad. Corra sus dedos a lo largo de la pareja para que se peguen entre sí. Asegúrese de que el par de hilos de tener un buen contacto en toda su longitud. </li><li> Veces el par de nuevo por la celebración de los dos extremos. Asegúrese de que el bucle formado en un extremo no está doblado. Cortar los cuatro cables en el extremo no bucle de modo que las cuatro extremidades están alineados. </li><li> Para el siguiente paso, se necesita una pinza modificada, un dispositivo de giro de motor, y una barra horizontal sobre el dispositivo de giro. La pinza se ve modificada por una barra de plástico pegado a la base del gancho. Donde las puntas de alambre se exponen, pinza de los cuatro cables con la pinza modificada. Colgar el circuito de los cables sobre la barra horizontal. Coloque la pinza en la etapa motorizada. </li><li> Aplicar 80 sabios reloj giros seguidos de 40 vueltas en sentido horario contrario al conjunto de cable a lo largo de aproximadamente tres minutos. Estos parámetros pueden variar de acuerdo a sus necesidades. </li><li> Después de girar tetrodo se ha completado, se fusionan los cables juntos por el calentamiento desde tres ángulos diferentes con una pistola de aire caliente (420 ° C o 790 º F), el uso medio-bajo flujo. Para cada ángulo, empezar a 1-2 cm por debajo de donde el conjunto de cable se divide, ejecute la pistola de calor hacia arriba y abajo a una distancia de 2 cm de los cables durante unos 5 segundos. Tenga cuidado como las altas temperaturas se derrita por completo el aislamiento y provocar cortocircuitos. </li><li> Ahora que los cables se han fusionado, retire el tetrodo del aparato girando con cuidado, levantando la pinza para aliviar la tensión en el tetrodo, y cortar el tetrodo cerca de la pinza. En el otro extremo, corte el lazo de tal manera que hay cuatro líneas no en condiciones de servidumbre de cables de igual longitud. </li><li> A continuación, separar las hebras individuales en la parte superior con cuidado doblar los cables con unas pinzas de punta suave. </li><li> El tetrodo ya está listo para la carga en la matriz de micro-drive. Haga 21 para 25 más tetrodos y guárdelas en una caja libre de polvo hasta que es hora de que el proceso de carga tetrodo. </li></ol> 2. Carga de la tetrodos y cables de tierra en la matriz de micro-disco <ol><li> Para continuar, se necesita un total de micro-array de unidades. Si usted todavía no ha construido una, consulte el vídeo de &quot;micro-array de unidades para la crónica en vivo de grabación:. Fabricación de la unidad&quot; En nuestro plan de diseño, el tetrodo se adjuntará en un extremo al conector de hardware, y se ejecutarán a través del tubo portador de poliamida en la unidad de micro-tal que la punta del electrodo se extienden por debajo de la base de la matriz de micro-drive. </li><li> Antes de comenzar, crear un soporte de unidad que se puede conectar a la tarjeta de conexión en un extremo, y en el otro extremo, se pueden fijar por un Panavise. En este ejemplo, el titular de la unidad es un conector de Mill-Max pegado a un extremo de un mango de cuchilla tipo cutter (Figura 1c). </li><li> La celebración de la tetrodo con unas pinzas de punta suave y utilizando un estereoscopio, empuje la punta de la tetrodo en la poliimida tubo portador de una de las unidades micro. Empuje el tetrodo en el tubo hasta que los cables de electrodos individuales están cerca de la tarjeta de conexión en la parte superior de la matriz unidad. Tenga cuidado de no doblar o doblar los alambres, lo que hará que el tetrodo para entrar en el cerebro en un ángulo, en lugar de perpendicular, y se debilita la integridad de la tetrodo. </li><li> Suavemente alimentar al otro extremo de los cuatro cables en sus respectivos agujeros en la placa de interfaz electrodo usando pinzas de punta suave. Una vez más, evitar torceduras o doblar los alambres. Con los cuatro cables en su lugar, empuje los pines de oro en sus agujeros con un par de pinzas que tienen una mandíbula inferior acortado. Cuando se aprietan en el agujero, se tira el aislamiento del cable y crear una conexión eléctrica. </li><li> Para referencia posterior, realizar un seguimiento de la correspondencia entre micro-unidades y la posición del pasador de la tarjeta de interfaz de los electrodos. </li><li> Continuar cargando un total de 18 tetrodos. Las otras tres micro-unidades de la matriz se utilizará para alojar a los electrodos de referencia. Cada electrodo de referencia es de un tetrodo que utiliza sólo uno de los cuatro extremos de los cables no adherentes. Para conectar los electrodos de referencia, siga el procedimiento de carga, pero sólo conectar uno de los cuatro electrodos a la clavija del electrodo de referencia correspondiente en la tarjeta de conexión. </li><li> Si usted está planeando grabaciones multi-sitio, puede ser útil para planificar las conexiones de los tetrodos al conector de la tarjeta antes de tiempo. Esto debería reducir al mínimo la posibilidad de ajustar el tetrodo mal durante los experimentos. </li><li> Una vez que carga tetrodo se ha completado, hacer dos cables de tierra, uno de los animales y otra para el cono de protección. Corte un 6 pies de largo cable aislado de acero (texto: 0,005 &quot;de diámetro) y eliminar 3 mm de aislamiento, con unas pinzas de metal, desde cada extremo del cable. A continuación, corte de 4&quot;Aceros largos cables aislados (texto: 0,005&quot; de diámetro). Eliminar 3 mm de aislamiento en un extremo y 1 cm en el otro extremo. </li><li> Ruta de cable de 6 &#39;del suelo a través del agujero en el lado de la unidad matriz de micro-y hacia la tarjeta de interfaz. Conecte el cable expuesto a la tarjeta de interfaz electrodo con un broche de oro en el hoyo de tierra designado. Este cable se conecta al cráneo del animal. </li><li> Ruta paralela de tierra de 4 &#39;de cable al cable de tierra instalado previamente. Conecte el extremo 3 mm despojado de la tarjeta de interfaz electrodo con un broche de oro a otro hoyo de tierra designado. Este cable luego se conecta a un cono de protección, que actuará como una jaula de Faraday pequeña para reducir la captación de ruido. Ahora estamos terminados los cables de conexión y se puede proceder a refinar nuestra tetrodos. </li></ol> 3. Ajuste de la longitud de la tetrodos <ol><li> Nuestro objetivo en este proceso es cortar todos los tetrodos para que sean ligeramente más largo que la profundidad de la estructura del cerebro de destino. En nuestro ejemplo, las unidades de micro-están diseñados para un recorrido máximo de 6.5 mm, suficiente para llegar a muchas áreas neocorticales y del hipocampo dorsal de una rata adulta. En primer lugar, reducir todas las unidades de micro-para que los tetrodos son máximamente expuesta. Al mismo tiempo cortar todos los tetrodos de longitudes que son aproximadamente 5 mm más largo que la longitud final deseada usando un par de afiladas tijeras finas. </li><li> Para el corte final, preparar un par de tijeras dentadas en un Panavise. Abrazadera de un mango con una ligera inclinación hacia abajo y con dientes hacia arriba, dejando la manija otra colgando. </li><li> Ahora retirarse completamente todas las tetrodos en la cánula guía girando los discos micro-up. </li><li> El uso de un estereoscopio, extienda completamente un tetrodo fuera de su cánula. Con una regla, la posición de las tijeras dentadas a la distancia deseada de la cánula guía. Lenta y suavemente cortar el tetrodo con un movimiento suave. Después de este tetrodo se ha reducido, retirar el micro-disco por 3 a 4 mm. Repita este proceso para cada tetrodo hasta que todos hayan sido cortadas. En este punto, usted está listo para chapado en oro. </li></ol> 4. Oro chapado de tetrodos y control de calidad Blindaje de los cables tetrodo nicrom es fundamental para largas grabaciones de estable a largo plazo. Se evita la corrosión y mejora la biocompatibilidad. <ol><li> Configuración del medidor de impedancia en el modo externo y el generador de corriente en modo de comprobación de CC con salida de audio (Figura 1d). Tocar los dos cables del generador de corriente de los seis posibles pares de canales dentro de cada tetrodo, y utilizar la retroalimentación de audio para determinar si existen cortocircuitos entre pares. Si existe un cortocircuito, vuelva a cortar el tetrodo con tijeras dentadas y prueba de nuevo. Si el problema persiste, deseche el tetrodo y reemplazarlo. </li><li> Cuando no existen cortocircuitos dentro de todos los tetrodos, mover todos los discos micro-down, que se extiende a todos los tetrodos tan lejos como sea posible. </li><li> Modificar la configuración del equipo para el control de impedancia del electrodo (Figura 1e). Ahora moje la punta de todos los tetrodos en un baño de estándar dorado solución. El baño de oro está conectado eléctricamente con el polo positivo del medidor de impedancia. Compruebe la impedancia del electrodo tocando el cable negativo del medidor de impedancia para el correspondiente pin de la tarjeta de conexión. </li><li> Medir y registrar la impedancia de cada cable en la matriz de micro-drive. Los valores normales van de 1.3 Mohm. </li><li> En el generador de corriente, ajuste la corriente entre 3.1 mA. A continuación, fije firmemente el cable negativo del medidor de impedancia para el pin en el conector de la tarjeta. Coloque el equipo en la configuración de galvanoplastia (Figura 1f). En el medidor de impedancia, cambiar rápidamente de modo normal, a modo de bypass, y la espalda. Mientras que en el modo de derivación, la corriente pasará a través del tetrodo y disolución de oro y el oro se sembraron en la punta del electrodo. La impedancia después de cada ronda de las planchas debe ser menor que antes. Repita el impulso de corriente si la impedancia de no caer por debajo de 1 MOhm. Una gran conservador de impedancias aceptables 250kOhm a 350 kOhm. Si la impedancia cae por debajo de 200 kOhm, esto puede indicar un corto circuito. </li><li> Si después de repetidos pulsos de la impedancia no baja lo suficiente, la punta del electrodo puede ser obstruida. Vuelva a cortar el tetrodo, compruebe si hay pantalones cortos, y repetir el proceso de dorado. Si re-corte no resuelve el problema, reemplace el tetrodo y empezar de nuevo. </li><li> Después de sembrar todos los tetrodos Sumerja la punta tetrodo brevemente en etanol, y déjelos secar durante 3 a 5 minutos. </li><li> Prueba de cortocircuitos en tetrodos utilizando el generador de corriente con las puntas tetrodo se expone al aire. Si una conexión de CC existe entre dos o más electrodos de un tetrodo, vuelva a cortar el tetrodo, y la placa de oro de nuevo. </li><li> Después de sobrerregulación de todos los tetrodos es completa, agregar una gota de espesor medio de ciano-acrilato de cola a la interfaz entre cada tetrode y su tubo de poliamida. Esto asegurará la tetrodo a su micro-drive y mantener la longitud de la tetrodo. </li><li> Como paso final, se mueven todos los tetrodos en la unidad girando todos los tornillos de arriba. </li></ol> 5. Colocación del cono de protección El propósito del cono de protección es para proteger a las micro-unidades y el cable tetrodo expuestos desde el medio ambiente. También proporciona soporte para el manejo durante un experimento y reduce el ruido eléctrico. Utilizamos un 3-D cono de plástico impresas (Parte I Referencia: fabricación de la unidad). Sin embargo, es posible hacer el cono de otros materiales, como una parte inclinada de la lata de refresco. <ol><li> Tome el cono de plástico y fijar un poco de cinta de papel de aluminio a la superficie interna o externa. </li><li> A continuación, un agujero pequeño (1,5 mm de diámetro) a través del cono y libremente fijar un tornillo con una arandela y tuerca en el interior del cono. Esto servirá como un paso eléctrico para el conductor de tierra. Le recomendamos que utilice un tornillo de tamaño de 00 a 80 y una combinación de lavadora. </li><li> En primer lugar, insertar y en parte a su vez tres tornillos de tamaño 1-72 (3 / 16 pulgadas de largo) en los lados del cono. Con el array de unidades suspendidas, inserte el cono sobre la unidad. Asegúrese de que tanto los cables de tierra se extienden desde la parte inferior de la matriz unidad. Envuelva la parte expuesta del cable de tierra de 4 &#39;en torno a uno de los tornillos de 1-72 en varias ocasiones y apriete el tornillo firmemente. Fije el cono a la base de la unidad apretando los dos tornillos restantes cono. </li><li> Por último, tome la 1 cm extremo pelado del cable de tierra de corto y el viento que todo el tornillo, en medio de la cinta de papel de aluminio y lavadora. Asegure el suelo apretando el tornillo. Ahora tenemos una serie de micro-unidad que está por fin listo para su implantación quirúrgica. </li></ol> 6. Los resultados representativos <ol><li> Micro-drive de producción conjunto se ha completado. Su micro-array de unidades se ha cargado con 18 tetrodos y 3 canales de referencia. Éste queda encerrado en un cono de protección y la tapa para una mayor durabilidad. El acabado micro-array de unidades con el cono de protección pesa 20 gramos a 25 gramos en promedio. </li><li> La Orden unidad de disco terminado se implanta mediante el procedimiento quirúrgico estándar. Como puede ver, la unidad está conectada a un chip de preamplificador y un manojo de cables que transportan la señal de hardware de adquisición de datos y software. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1098/CompositeFigure1_highqualityn.jpg" alt="la figura 1" /> Figura 1: Esquema) de la configuración de torsión tetrodo. Una barra horizontal suspende los cables de los electrodos no adherentes de la tetrodo por encima del dispositivo tetrodo giro automático. B) La instalación de medición de la impedancia tetrodo y las planchas del electrodo. Al verificar si hay cortocircuitos, el circuito es diferente:. El cable negro se conecta a otro canal de electrodos en la placa de conexión C) Un primer plano de un encargo a micro-disco portaherramientas matriz. La barra cilíndrica es un mango de un cuchillo de X-Acto. El conector es de 26 pines, de dos hileras, Mill-Max conector. Las dos piezas se unen con acrílico dental. D) de configuración para el control de corto plazo. Canal X e Y son dos canales diferentes canales de los cuatro canales tetrodo. E) Configuración para la medición de impedancia del electrodo. La fuente de corriente es &#39;off&#39;. El medidor de impedancia está en &#39;on&#39; y &#39;test&#39;. F) de configuración para chapado en oro de puntas de los electrodos. La fuente actual se establece en &quot;on&quot;, el audio es &quot;on&quot;, el modo es &quot;unipolar&quot;, de prueba de CC está &quot;encendido&quot;, la corriente se establece en 2 microamperios.

<ol>
	<li>Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrodes+markedly+improve+the+reliability+and+yield+of+multiple+single-unit+isolation+from+multi-unit+recordings+in+cat+striate+cortex.">Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex.</a> J. Neurosci. Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).</li></ol>

Este protocolo es la segunda entrega de un protocolo de dos partes: &quot;Micro-array de unidades de las enfermedades crónicas en vivo la grabación.&quot; La combinación de la matriz de la unidad de micro-y tetrodo es una poderosa herramienta para la obtención de registros simultáneos de muchas neuronas en una vigilia, comporta la preparación de los animales. Esperemos que le hemos proporcionado toda la información necesaria para que usted tendrá que iniciar o mejorar los registros electrofisiológicos en su pro...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Panavise</td>
<td>Tool</td>
<td>Panavise</td>
<td>Model 301</td>
<td>Holds either micro-drive array or serrated scissors</td>
</tr>
<tr>
<td>Modified Xcelite 378M Pliers</td>
<td>Tool</td>
<td>Newark</td>
<td>96F8903</td>
<td>For inserting connector board pins. To make, remove 2mm from one tip of the pliers.</td>
</tr>
<tr>
<td>Slow Cure Glue</td>
<td>Material</td>
<td>Great Planes (Champaign, IL)</td>
<td>GPMR6015</td>
<td>To glue the tetrode to the micro-drive</td>
</tr>
<tr>
<td>Gold Plating Solution</td>
<td>Material</td>
<td>Neuralynx</td>
<td>Sifco Selectron Gold NC</td>
<td>Contains gold particles for electroplating</td>
</tr>
<tr>
<td>Current Generator</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>A365D-B</td>
<td>A.K.A. Stimulus Isolator. Used to electroplate gold solution onto electrode tips.</td>
</tr>
<tr>
<td>Impedance Meter</td>
<td>Tool</td>
<td>BAK Electronics</td>
<td>IMP-1 / 6662 / 2788</td>
<td>To check impedance of electrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>Hot Air Gun</td>
<td>Tool</td>
<td>Steinel (Germany)</td>
<td>HG 3002 LCD</td>
<td>To fuse electrodes together to make tetrode</td>
</tr>
<tr>
<td>Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers</td>
<td>Tool</td>
<td>Aven (Ann Arbor, MI)</td>
<td>18768 (Pattern 304)</td>
<td>For handling tetrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>Alligator Clip</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>18050-35</td>
<td>A.K.A. Bulldog serrefine. To clip the tetrodes together during twisting</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Dissecting Scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Biomedical Research Instruments</td>
<td>25-1000</td>
<td>For general cutting of tetrode/electrode wire</td>
</tr>
<tr>
<td>Iris Toughcut Serrated Scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14058-09</td>
<td>For final cut of tetrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>Teflon Coated Stainless Steel Wire</td>
<td>Material</td>
<td>A-M Systems (Carlsborg, WA)</td>
<td>790500</td>
<td>Ground wire</td>
</tr>
<tr>
<td>12.5 micron nichrome wire</td>
<td>Material</td>
<td>Kanthal Palm Coast</td>
<td>Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING</td>
<td>Polyimide coated micro-wire for making tetrodes.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tetrode Twister</td>
<td>Tool</td>
<td>Neuralynx</td>
<td>Tetrode Assembly Station</td>
<td>Increases the speed and consistency of tetrode fabrication.

</td>
</tr>
<tr>
<td>Silver Paint</td>
<td>Material</td>
<td>GC Electronics</td>
<td>22-023</td>
<td>For connecting the micro-electrode wires of the tetrode to the connector pins (see Discussion)</td>
</tr>
<tr>
<td>X-Acto Knife Handle</td>
<td>Material</td>
<td>MSC Direct</td>
<td>X3001</td>
<td>For constructing a micro-drive holding device.</td>
</tr>
<tr>
<td>26 Pin, 2 Row Connector</td>
<td>Material</td>
<td>Mill-max</td>
<td>852-10-026-30-001000</td>
<td>For constructing a micro-drive holding device.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly

El tetrodo, un paquete de cuatro electrodos, ha demostrado ser una valiosa herramienta para la grabación simultánea de múltiples neuronas in vivo. La amplitud de la diferencia de las firmas del potencial de acción sobre los canales de un tetrodo permite el aislamiento de la actividad de una sola unidad de las señales de múltiples unidades. La capacidad de controlar con precisión la localización estereotáxica y la profundidad de la tetrodo es fundamental para el estudio de la actividad neuronal coordinada en todas las regiones del cerebro. En combinación con un array de micro-, es posible lograr una colocación precisa y un control estable de tetrodos muchos a lo largo de días o semanas. En este protocolo, se demuestra cómo fabricar y tetrodos condición usando las herramientas básicas y materiales, instalar el tetrodos en una matriz de tetrodo de varias unidades de las enfermedades crónicas en vivo la grabación en la rata, hacer conexiones cable a tierra a la matriz de micro-drive, y colocar un cono de protección en serie de la unidad de micro-con el fin de proteger a los tetrodos de contacto físico con el medio ambiente.

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Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

En este protocolo, se muestra cómo fabricar y tetrodos condición para su uso con una amplia micro-drive, que fue diseñado para la crónica registros electrofisiológicos en las ratas. Además, se ilustran las etapas finales de construcción de micro-array de unidad, que incluye la instalación de cables de tierra y un cono de protección.

Micro-array de unidades de crónicos In vivo Grabación: Tetrodo Asamblea

The tetrode, a bundle of four electrodes, has proven to be a valuable tool for the simultaneous recording of multiple neurons in-vivo.  The differential ...

micro-drive-array-for-chronic-in-vivo-recording-tetrode-assembly

Research

JoVE Journal

Biology

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

33.1K vistas.  MIT - Massachusetts Institute of Technology. En este protocolo, se muestra cómo fabricar y tetrodos condición para su uso con una amplia micro-drive, que fue diseñado para la crónica registros electrofisiológicos en las ratas. Además, se ilustran las etapas finales de construcción de micro-array de unidad, que incluye la instalación de cables de tierra y un cono de protección.

Video: Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Aplicación de curado con luz Resina Adhesivo Dental para los electrodos de montaje o sondas de microdiálisis en experimentos crónica

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Investigación

Biología

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. Lightweight recording devices carrying a high density array of tetrodes allow for the simultaneous monitoring of the activity of tens to hundreds of individual neurons. Here we describe a protocol for the fabrication of a micro-drive array with twenty one independently movable micro-drives. This device has been used successfully to record from hippocampal and cortical neurons in our lab. We show how to prepare a custom designed, 3-D printed plastic base that will hold the micro-drives. We demonstrate how to construct the individual micro-drives and how to assemble the complete micro-drive array. Further preparation of the drive array for surgical implantation, such as the fabrication of tetrodes, loading of tetrodes into the drive array and gold-plating, is covered in a subsequent video article.

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

In this protocol we demonstrate how to fabricate a micro-drive array for chronic electrophysiological recordings in rats.

Micro-array de unidades de crónicos In vivo Grabación: Unidad de Fabricación

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Registro electrofisiológico en el Drosophila Embrión

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Concentración, la carga, y la alineación de una célula de ultracentrifugación analítica de muestras

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, retina-specific or conditional knockout mouse models often display early lethality or suffer from severe malformations, preventing an analysis beyond embryonic or early postnatal stages.
Primary cell culture is an alternative to investigate the effects of exogenously applied recombinant factors, overexpression of genes or siRNA-mediated gene knockdown in a controlled environment. Dissociated cell culture has the advantage that the endogenous signals reaching the target cells are reduced, thereby facilitating the identification of exogenously triggered effects after pharmacological manipulation. However, important cell-cell interactions are initially destroyed by enzymatic digestion or mechanical dissociation, even if re-aggregated retinospheroid cultures1 are used.
By contrast, organotypic retinal wholemount cultures provide a system close to the physiological in vivo situation with neuronal interactions and connections still preserved2-5.
In this video article we provide a step by step demonstration of (1) the establishment of in vivo-like organotypic retinal wholemount cultures including dissection peculiarities of embryonic, postnatal and adult murine eyes and (2) a dissociation and cytospin procedure for analysis of neuronal apoptosis and retinal cell proliferation in organotypic wholemounts, e.g. after culture in the presence of exogenously applied recombinant factors.

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

This video article demonstrates the establishment of organotypic retinal wholemount cultures and a cytospin procedure for analysis of exogenously induced effects. Organotypic retinal wholemount cultures mimic the in vivo situation and significantly facilitate the accessibility of murine retinas for experimental manipulations while circumventing the disadvantages of classical murine animal models.

En vivo-como organotípicos Cultura murino wholemount retina

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

Ambulatory ECG Recording in Mice

Telemetric ECG recording in mice is essential to understanding the mechanisms behind arrhythmias, conduction disorders, and sudden cardiac death. Although the surface ECG is utilized for short-term measurements of waveform intervals, it is not practical for long-term studies of heart rate variability or the capture of rare episodes of arrhythmias. Implantable ECG telemeters offer the advantages of simple surgical implantation, long-term recording of electrograms in ambulatory mice, and scalability with simultaneous recordings of multiple animals. Here, we present a step-by-step guide to the implantation of telemeters for ambulatory ECG recording in mice. Careful adherence to aseptic technique is required for favorable survival results with the possibility of implantation and recording from weeks to months. Thus, implantable ECG telemetry is a valuable tool for detection of critical information on cardiac electrophysiology in ambulatory animal models such as the mouse. 

Telemetric ECG has emerged as an essential tool in evaluating animal models for cardiac arrhythmias and sudden cardiac death. Here, we present a stepwise guide to telemetric ECG recordings for application in long-term ambulatory ECG monitoring in mice.

Ambulatorio de grabación ECG en ratones

Telemetric ECG recording in mice is essential to understanding the mechanisms behind arrhythmias, conduction disorders, and sudden cardiac death. Although ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Matriz de hibridación genómica comparada (CGH array) para la detección de número de copias genómicas variantes

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Medición de daños y reparación del ADN en esplenocitos de ratón Después crónica<em&gt; En Vivo</em&gt; La exposición a dosis muy bajas de beta y gamma Radiación

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

La Asamblea y la Aplicación de &#39;Shear Anillos&#39;: A Novel endotelial Modelo de Orbital, unidireccional y periódica flujo de fluido y la tensión de cizallamiento

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...