Wir möchten bis Jun Yamamoto für seinen Entwurf und Bau von automatischen, motorisierte Tetrode twister Gerät im Video dargestellt anzuerkennen. Darüber hinaus möchten wir alle ehemaligen und derzeitigen Wilson Lab Mitgliedern für ihre Beiträge zur Mikro-Laufwerk und Tetrode Technologieentwicklung im Labor bestätigen.

1. Herstellung von Tetroden <ol><li> Beginnen Sie mit dem Bau eines Tetrode durch den Erwerb einer 50 cm langen, Polyimid isoliert, ni-Chrom-Draht mit einem 12,5 Mikron Durchmesser Kern. Klappen Sie den Draht in die Hälfte. Lassen Sie Ihre Finger entlang der Paar, um sie miteinander zu verkleben. Achten Sie darauf, die beiden Drähte haben einen guten Kontakt über die gesamte Länge. </li><li> Falten Sie das Paar wieder, indem Sie die beiden Enden zusammen. Stellen Sie sicher, dass die Schlaufe an einem Ende gebildet wird, nicht geknickt werden. Schneiden Sie die vier Adern auf der nicht-Schleife Ende so, dass die vier Spitzen ausgerichtet sind. </li><li> Für den nächsten Schritt benötigen Sie eine modifizierte Krokodilklemme, ein motorisiertes Wendeeinrichtung und eine horizontale Leiste oberhalb der Drehvorrichtung. Die Krokodilklemme wird durch Aufkleben eines Kunststoff-bar an der Basis des Clips geändert. Wo die Drahtspitzen ausgesetzt sind, spannen die vier Drähte zusammen mit dem modifizierten Krokodilklemme. Hängen Sie die Schlaufe von Drähten über der horizontalen Leiste. Legen Sie die Krokodilklemme in die motorisierte Bühne. </li><li> Übernehmen 80 im Uhrzeigersinn verdreht um 40 gegen den Uhrzeigersinn verdreht, um das Kabelbündel im Laufe von etwa drei Minuten. Diese Parameter können nach Ihren Bedürfnissen variiert werden. </li><li> Nach Tetrode Verdrehen abgeschlossen ist, verschmelzen die Drähte durch Erhitzen aus drei verschiedenen Blickwinkeln mit einer Heißluftpistole (420 ° C oder 790 ° F), mit mittel-niedrigen Durchfluss. Für jeden Winkel, beginnt 1-2 cm unterhalb der Stelle, das Kabelbündel spaltet, führen Sie die Heißluftpistole nach unten und oben mit einer 2 cm Abstand von den Drähten für ca. 5 Sekunden. Seien Sie vorsichtig bei hohen Temperaturen vollständig schmelzen wird die Isolierung und führen zu Kurzschlüssen. </li><li> Nun, da die Drähte miteinander verschmolzen, entfernen Sie die Tetrode aus dem Verdrehen Gerät durch leichtes Anheben der Krokodilklemme Spannung auf der Tetrode zu entlasten, und schneiden Sie die Tetrode in der Nähe der Krokodilklemme. Am anderen Ende, schneiden Sie die Schleife so, dass es vier nicht-gebundene Drähte von gleicher Länge. </li><li> Anschließend trennen die einzelnen Stränge an der Spitze durch leichtes Biegen der Drähte mit einem weichen Spitze Pinzette. </li><li> Die Tetrode ist nun bereit zum Laden in den Mikro-Drive Array. Machen Sie 21 bis 25 mehr Tetroden und speichert sie in einer staubfreien Box, bis es Zeit für die Tetrode Ladevorgang. </li></ol> 2. Lädt die Tetroden und Erdungskabel in die Mikro-Laufwerk-Array <ol><li> Um fortzufahren, müssen Sie eine komplette Mikro-Drive Array. Wenn Sie noch nicht ein gebaut haben, um das Video zu beziehen &#39;Micro-Drive-Array für chronische in-vivo-Aufnahme:. Laufwerk Fertigung &quot; In unserem Design-Plan wird die Tetrode an einem Ende an den Anschluss-Hardware angeschlossen werden und wird durch die Ausführung Polyimid Trägerrohr in der Mikro-Laufwerk, so dass die Elektrode Tipps unterhalb der Basis der Mikro-Laufwerk-Array erweitern. </li><li> Bevor Sie beginnen, bauen ein Laufwerk Halter, der an den Anschluss Bord an einem Ende befestigt werden kann, und am anderen Ende, kann durch eine Panavise geklemmt werden. In diesem Beispiel ist das Laufwerk Inhaber einer Mühle-max-Anschluss geklebt, um ein Ende des X-ACTO Messergriff (Abbildung 1c). </li><li> Halten Sie die Tetrode mit weichen Spitze Pinzette und mit einem Stereoskop, drücken Sie die Spitze des Tetrode in das Polyimid Trägerrohr eines der Mikro-Laufwerke. Drücken Sie die Tetrode in die Röhre, bis die einzelnen Elektrodendrähte in der Nähe der Stecker Bord stehen an der Spitze des Drive Array. Achten Sie darauf, nicht zu knicken und biegen Sie die Drähte, wie die Tetrode verursachen wird, um das Gehirn in einem Winkel, anstatt senkrecht geben, und wird die Integrität der Tetrode schwächen. </li><li> Gently feed das andere Ende der vier Drähte in ihre jeweiligen Löcher in die Elektrode Schnittstellenkarte mit weichen Spitzen einer Pinzette. Wieder zu vermeiden Knicken oder Biegen der Drähte. Bei allen vier Adern vorhanden, drücken Sie die goldenen Nadeln in ihre Löcher mit einer Zange, die eine verkürzte Unterkiefer haben. Wenn die Stifte in das Loch geschoben werden, werden sie Abisolieren der Leitung und schaffen eine elektrische Verbindung. </li><li> Für den späteren Gebrauch auf, verfolgen die Zuordnung zwischen Mikro-Laufwerke und Pin-Position auf der Elektrode Interface-Karte. </li><li> Weiter loading insgesamt 18 Tetroden. Die drei verbleibenden Mikro-Laufwerke im Array wird benutzt, um die Referenz-Elektroden Haus. Jede Referenz-Elektrode besteht aus einer Tetrode, dass nur einer der vier ungebundenen Drahtenden verwendet hat. Um die Referenz-Elektroden anbringen, folgen Sie den Ladevorgang, sondern legen nur eine der vier Elektroden an die jeweilige Referenzelektrode Pin am Stecker Bord. </li><li> Wenn Sie planen, Multi-Site-Aufnahmen sind, kann es sinnvoll sein, planen Sie die Verbindungen von der Tetroden an den Anschluss Bord vor der Zeit. Dies sollte um die Möglichkeit einer Anpassung der falschen Tetrode während der Experimente. </li><li> Sobald Tetrode Laden abgeschlossen ist, machen zwei Masseleitungen, eine für das Tier und einen für die schützende Membran. Cut eine 6 &quot;lange isolierten Draht (Text: 0,005&quot; Durchmesser) und entfernen Sie 3 mm Isolierung, mit Metall-Pinzette, von jedem Ende des Drahtes. Dann schneiden Sie ein 4&quot;Langen isolierten Draht (Text: 0,005&quot; Durchmesser). Entfernen 3 mm der Isolierung an einem Ende und 1 cm am anderen Ende. </li><li> Führen Sie das 6 &#39;Erdungskabel durch das Loch an der Seite des Mikro-Laufwerk-Array und bis auf die Interface-Karte. Schließen Sie das freiliegende Drähte der Elektrode Schnittstellenkarte mit einer goldenen Nadel an den dafür vorgesehenen Boden-Loch. Dieser Draht wird das Tier den Schädel zu verbinden. </li><li> Verlegen Sie die 4 &#39;Erdungskabel parallel zu den bereits installierten Erdleitung. Verbinden Sie die 3 mm abisolierte Ende der Elektrode Schnittstellenkarte mit einer goldenen Nadel an einem anderen benannten Ort Loch. Dieser Draht wird später eine schützende Membran, die als kleine Faraday-Käfig wirken wird Rauschaufnahme reduzieren angeschlossen werden. Wir sind jetzt Anschlussdrähte fertig und kann mit der Verfeinerung unserer Tetroden gehen. </li></ol> 3. Einstellen der Länge des Tetroden <ol><li> Unser Ziel in diesem Prozess ist es, alle Tetroden so geschnitten, dass sie etwas länger als die Tiefe des Ziels der Struktur des Gehirns sind. In unserem Beispiel sind die Mikro-Antriebe für eine maximale Verfahrweg von 5-6 mm ausreichend, um viele neokortikalen Gebiete und der dorsalen Hippocampus von einer erwachsenen Ratte erreichen ausgelegt. Zunächst unteren all die Mikro-Laufwerke, so dass die Tetroden maximal ausgesetzt sind. Gleichzeitig schneiden alle Tetroden um Längen, die ca. 5 mm länger als die gewünschte endgültige Länge mit einer scharfen feinen Schere. </li><li> Für den letzten Schnitt, bereiten ein Paar gezahnte Schere in einem Panavise. Clamp einem Griff mit einem leichten Winkel nach unten und mit Zacken nach oben, während die anderen Griff baumelt. </li><li> Jetzt komplett zurückziehen alle Tetroden in ihre Führungskanüle durch Drehen der Mikro-Laufwerke auf. </li><li> Mit einem Stereoskop, vollständig strecken Sie ein Tetrode aus seiner Kanüle. Mit einem Lineal, positionieren Sie den gezackten Schere in der gewünschten Entfernung von der Führungskanüle. Langsam und sanft schneiden die Tetrode mit einer fließenden Bewegung. Nach diesem Tetrode geschnitten worden ist, ziehen Sie den Mikro-Antrieb von 3-4mm. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Tetrode, bis alle geschnitten wurden. An diesem Punkt sind Sie bereit für Vergoldung. </li></ol> 4. Vergoldung von Tetroden und Qualitäts-Check Vergoldung der Nichrom Tetrode Drähte ist entscheidend für die langfristige stabile Aufnahmen. Es verhindert Korrosion und verbessert Biokompatibilität. <ol><li> Richten Sie die Impedanzmeter im externen Modus und den Stromgenerator in DC Prüfmodus mit Audio-Ausgang (Abbildung 1d). Berühren Sie die beiden Adern des Stromgenerator, um die sechs möglichen Paaren von Kanälen in jedem Tetrode, und verwenden Sie die Audio-Feedback, um festzustellen, ob Kurzschlüsse zwischen Paaren bestehen. Wenn eine kurze existiert, neu geschnitten die Tetrode mit Wellenschliff Schere und erneut testen. Wenn das Problem weiterhin besteht, entsorgen Sie die Tetrode und ersetzen Sie es. </li><li> Wenn keine Shorts in allen Tetroden existieren, verschieben Sie alle Mikro-Laufwerke ab, Verlängerung alle Tetroden so weit als möglich. </li><li> Ändern Sie die Konfiguration der Geräte für die Kontrolle Elektrodenimpedanz (Abbildung 1e). Jetzt tauchen die Spitzen aller Tetroden in ein Bad von Standard-Vergoldung Lösung. Das Goldbad ist elektrisch mit dem Pluspol der Impedanzmeter verbunden. Überprüfen Sie die Impedanz der Elektrode durch Berühren der negativen Steigung der Impedanz-Meter zu den entsprechenden Pin am Stecker Bord. </li><li> Messen und notieren die Impedanz eines jeden Draht auf der Mikro-Drive Array. Normale Werte liegen im Bereich von 1 bis 3 MOhm. </li><li> Auf die aktuelle Generator, stellen Sie die aktuelle zwischen 1-3 uA. Als nächstes sichere Befestigung der negativen Steigung der Impedanz-Meter, um den Stift auf dem Stecker Bord. Platzieren Sie die Geräte in der Galvanik-Konfiguration (Abbildung 1f). Auf der Impedanzmeter, schnell von den normalen Modus zu wechseln, um den Bypass-Modus und wieder zurück. Während in den Bypass-Modus wird Strom durch die Tetrode und Gold Lösung gehen, und Gold wird auf die Spitze der Elektrode beschichtet werden. Die Impedanz nach jeder Runde der Beschichtung sollte weniger als zuvor. Wiederholen Sie den aktuellen Puls, wenn die Impedanz nicht unter 1 MOhm fallen. Eine konservative Bereich der akzeptablen Impedanzen sind 250kOhm bis 350 kOhm. Wenn die Impedanz sinkt unter 200 kOhm, kann dies auf einen Kurzschluss. </li><li> Wenn nach wiederholter Impulse die Impedanz nicht ausreichend fallen, kann die Spitze der Elektrode behindert werden. Re-Cut der Tetrode, auf Kurzschlüsse überprüfen, und wiederholen Sie die Vergoldung Prozess. Wenn Nachschneiden nicht hilft, ersetzen Sie die Tetrode und erneut starten. </li><li> Nach dem Plattieren alle Tetroden, tauchen die Tetrode Tipps kurz in Ethanol, und lassen Sie sie für 3 bis 5 Minuten trocknen lassen. </li><li> Test für Kurzschlüsse innerhalb Tetroden mit dem Stromgenerator mit der Tetrode Tipps der Luft ausgesetzt. Wenn ein DC-Verbindung zwischen zwei oder mehr Elektroden eines Tetrode, wieder schneiden die Tetrode, und die Platte mit Gold wieder. </li><li> Nach Vergoldung aller Tetroden abgeschlossen ist, einen Tropfen von mittlerer Dicke Cyano-Acrylat-Klebstoff, um die Schnittstelle zwischen den einzelnen tetrode und seine Polyimidschlauch. Dies wird die Tetrode an ihre mikro-Laufwerk zu sichern und zu erhalten die Länge der Tetrode. </li><li> Als letzter Schritt, verschieben Sie alle Tetroden in das Laufwerk ein, indem Sie alle Schrauben auf. </li></ol> 5. Anbringen des Schutztrichter Die schützende Membran Zweck ist die Mikro-Laufwerke und die exponierte Tetrode Draht aus der Umwelt abschirmen. Es bietet auch Unterstützung für den Umgang während eines Experiments und reduziert elektrische Störungen. Wir verwenden eine 3-D gedruckt Kunststoffkonus (Reference Part I: Laufwerk Fertigung). Allerdings ist es möglich, den Kegel aus anderen Materialien zu machen, wie ein gebogenes Stück von Soda kann. <ol><li> Nehmen Sie die Kunststoffmembran und behebt einige Aluminiumfolienband der inneren oder äußeren Oberfläche. </li><li> Als nächstes ein kleines Loch bohren (1,5 mm im Durchmesser) durch den Kegel und lose Schraube mit einer Unterlegscheibe und Mutter innerhalb des Kegels. Dies wird als elektrischer Durchgang für die Erdleitung dienen. Wir empfehlen die Verwendung eines 0-80 Größe Schraube und Unterlegscheibe Kombination. </li><li> Legen Sie zuerst und teilweise wiederum drei 1-72 Schrauben der Größe (16.3 cm in der Länge) in die Seiten des Kegels. Mit dem Laufwerk-Array ausgesetzt, legen Sie die Kegel über den Antrieb. Achten Sie darauf, beide Masseleitungen erstrecken sich von der Unterseite des Laufwerks-Array. Wickeln Sie das freiliegende Teil der 4 &#39;Erdungskabel an einem der 1-72 Schrauben mehrmals und festschrauben fest. Sichern Sie die Kegel, um das Laufwerk Basis durch Anziehen der restlichen zwei Kegel Schrauben. </li><li> Schließlich nehmen Sie die 1 cm abisoliert Ende des kurzen Erdungskabel und wickeln Sie es um die Schraube, zwischen den Folienstreifen und Unterlegscheibe. Sichern Sie den Boden durch Anziehen der Schraube. Jetzt haben wir ein Mikro-Laufwerk-Array, das ist endlich bereit für die chirurgische Implantation. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse <ol><li> Micro-Drive-Array Produktion ist nun abgeschlossen. Ihre Mikro-Laufwerk-Array ist mit 18 Tetroden und 3 Sollwertkanäle geladen. Es ist eingehüllt in eine schützende Membran und Kappe für Langlebigkeit. Die fertigen Mikro-Laufwerk-Array mit Schutztrichter wiegt 20g bis 25g im Durchschnitt. </li><li> Das fertige Laufwerk-Array wird implantiert mit Standard-chirurgischen Eingriffs. Wie Sie sehen können, ist das Laufwerk mit einem Vorverstärker-Chip und ein Bündel von Drähten, die das Signal tragen, um die Datenerfassung Hard-und Software verbunden. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1098/CompositeFigure1_highqualityn.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: A) Schematische Darstellung der Tetrode Verdrehen Konfiguration. Ein horizontaler Balken unterbricht die ungebundenen Elektrodendrähte der Tetrode über den automatisierten Tetrode Verdreheinrichtung. B) Setup für Tetrode Impedanzmessung und Elektrode beschichtet. Bei der Überprüfung auf Kurzschlüsse, ist der Stromkreis:. Das schwarze Kabel an einen anderen Elektrode Kanal auf dem Connector Board befestigt C) Eine Nahaufnahme eines maßgeschneiderten Micro-Drive-Array Halter Werkzeug. Die zylindrische Stange ist ein X-Acto Messergriff. Der Stecker ist ein 26-poliges, zweireihig, Mill-Max-Anschluss. Die beiden Teile sind zusammen mit dental Acryl verklebt. D)-Konfiguration für kurze Überprüfung. Channel X und Y-Kanal werden alle zwei unterschiedliche Kanäle der vier Tetrode Kanäle. E)-Konfiguration für Messelektrode Impedanz. Die Stromquelle ist &#39;off&#39;. Die Impedanz-Meter wird auf &#39;on&#39; und &#39;test&#39; gesetzt. F)-Konfiguration für Vergoldung von Elektrodenspitzen. Die Stromquelle eingestellt ist &#39;on&#39;, wird das Audiosignal &#39;on&#39;, mode &#39;unipolar&#39; ist, DC-Test &#39;on&#39; ist, wird derzeit auf 2 Mikroampere.

<ol>
	<li>Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrodes+markedly+improve+the+reliability+and+yield+of+multiple+single-unit+isolation+from+multi-unit+recordings+in+cat+striate+cortex.">Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex.</a> J. Neurosci. Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).</li></ol>

Dieses Protokoll ist die zweite Tranche eines zweiteiligen Protokoll: &quot;Micro-Drive-Array für chronische in-vivo Aufnahme.&quot; Die Kombination von Mikro-Laufwerk-Array und Tetrode ist ein leistungsfähiges Werkzeug für den Erhalt von simultanen Aufnahmen von vielen Neuronen in einem wachen, verhalten Tier Vorbereitung. Hoffentlich haben wir Sie mit allen notwendigen Informationen für die Sie benötigen, um zu beginnen oder zu verbessern elektrophysiologischen Ableitungen in Ihrem eigenen Labor. <p class="jo...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Panavise</td>
<td>Tool</td>
<td>Panavise</td>
<td>Model 301</td>
<td>Holds either micro-drive array or serrated scissors</td>
</tr>
<tr>
<td>Modified Xcelite 378M Pliers</td>
<td>Tool</td>
<td>Newark</td>
<td>96F8903</td>
<td>For inserting connector board pins. To make, remove 2mm from one tip of the pliers.</td>
</tr>
<tr>
<td>Slow Cure Glue</td>
<td>Material</td>
<td>Great Planes (Champaign, IL)</td>
<td>GPMR6015</td>
<td>To glue the tetrode to the micro-drive</td>
</tr>
<tr>
<td>Gold Plating Solution</td>
<td>Material</td>
<td>Neuralynx</td>
<td>Sifco Selectron Gold NC</td>
<td>Contains gold particles for electroplating</td>
</tr>
<tr>
<td>Current Generator</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>A365D-B</td>
<td>A.K.A. Stimulus Isolator. Used to electroplate gold solution onto electrode tips.</td>
</tr>
<tr>
<td>Impedance Meter</td>
<td>Tool</td>
<td>BAK Electronics</td>
<td>IMP-1 / 6662 / 2788</td>
<td>To check impedance of electrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>Hot Air Gun</td>
<td>Tool</td>
<td>Steinel (Germany)</td>
<td>HG 3002 LCD</td>
<td>To fuse electrodes together to make tetrode</td>
</tr>
<tr>
<td>Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers</td>
<td>Tool</td>
<td>Aven (Ann Arbor, MI)</td>
<td>18768 (Pattern 304)</td>
<td>For handling tetrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>Alligator Clip</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>18050-35</td>
<td>A.K.A. Bulldog serrefine. To clip the tetrodes together during twisting</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Dissecting Scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Biomedical Research Instruments</td>
<td>25-1000</td>
<td>For general cutting of tetrode/electrode wire</td>
</tr>
<tr>
<td>Iris Toughcut Serrated Scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14058-09</td>
<td>For final cut of tetrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>Teflon Coated Stainless Steel Wire</td>
<td>Material</td>
<td>A-M Systems (Carlsborg, WA)</td>
<td>790500</td>
<td>Ground wire</td>
</tr>
<tr>
<td>12.5 micron nichrome wire</td>
<td>Material</td>
<td>Kanthal Palm Coast</td>
<td>Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING</td>
<td>Polyimide coated micro-wire for making tetrodes.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tetrode Twister</td>
<td>Tool</td>
<td>Neuralynx</td>
<td>Tetrode Assembly Station</td>
<td>Increases the speed and consistency of tetrode fabrication.

</td>
</tr>
<tr>
<td>Silver Paint</td>
<td>Material</td>
<td>GC Electronics</td>
<td>22-023</td>
<td>For connecting the micro-electrode wires of the tetrode to the connector pins (see Discussion)</td>
</tr>
<tr>
<td>X-Acto Knife Handle</td>
<td>Material</td>
<td>MSC Direct</td>
<td>X3001</td>
<td>For constructing a micro-drive holding device.</td>
</tr>
<tr>
<td>26 Pin, 2 Row Connector</td>
<td>Material</td>
<td>Mill-max</td>
<td>852-10-026-30-001000</td>
<td>For constructing a micro-drive holding device.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly

Die Tetrode, ein Bündel von vier Elektroden, hat sich als wertvolles Tool für die gleichzeitige Aufzeichnung mehrerer Neuronen in-vivo werden. Die differentielle Amplitude der Aktionspotentiale Signaturen über die Kanäle einer Tetrode ermöglicht die Isolierung von Single-Unit-Aktivität von Multi-Unit-Signale. Die Fähigkeit zur präzisen Steuerung der stereotaktischen Lage und Tiefe der Tetrode ist von entscheidender Bedeutung für die Untersuchung koordiniert neuronale Aktivität in Hirnregionen. In Kombination mit einem Mikro-Laufwerk-Array, ist es möglich, eine präzise Platzierung und stabile Regelung von vielen Tetroden im Laufe von Tagen bis Wochen zu erreichen. In diesem Protokoll, zeigen wir, wie in der Herstellung und dem Zustand Tetroden mit einfachen Werkzeugen und Materialien, installieren Sie die Tetroden in eine Multi-Laufwerk Tetrode Array für chronische in-vivo Aufnahme in die Ratte, machen Erdungskabel Verbindungen zu den Mikro-Laufwerk-Array, und legen einen schützenden Kegel auf der Mikro-Laufwerk-Array, um die Tetroden von physischen Kontakt mit der Umwelt zu schützen.

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Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

In diesem Protokoll zeigen wir, wie in der Herstellung und dem Zustand Tetroden für die Verwendung mit einem Mikro-Laufwerk-Array, das für die chronische elektrophysiologischen Ableitungen in Ratten entworfen wurde. Darüber hinaus zeigen wir die Endphase der Mikro-Laufwerk-Array Konstruktion, die Installation Erdungskabel und eine schützende Membran enthält.

Micro-Drive-Array für chronische In vivo Recording: Tetrode Assembly

The tetrode, a bundle of four electrodes, has proven to be a valuable tool for the simultaneous recording of multiple neurons in-vivo.  The differential ...

micro-drive-array-for-chronic-in-vivo-recording-tetrode-assembly

Research

JoVE Journal

Biology

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

33.1K Aufrufe.  MIT - Massachusetts Institute of Technology. In diesem Protokoll zeigen wir, wie in der Herstellung und dem Zustand Tetroden für die Verwendung mit einem Mikro-Laufwerk-Array, das für die chronische elektrophysiologischen Ableitungen in Ratten entworfen wurde. Darüber hinaus zeigen wir die Endphase der Mikro-Laufwerk-Array Konstruktion, die Installation Erdungskabel und eine schützende Membran enthält.

Serie: Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Anwendung von Licht-gehärteten Dental Adhesive Resin für Montage-Elektroden oder Mikrodialysesonden in Chronic Experimente

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Forschung

Biologie

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Immunhistochemie auf Paraffinschnitten von Mouse Epidermis unter Verwendung von fluoreszierenden Antikörper

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an extremely useful method, because it allows the study of the live intact brain. With appropriate preparations, this technique allows the observation of the same cortical area chronically, from minutes to months. In this video, we show a preparation for chronic in vivo imaging of the brain using two-photon microscopy. This technique was initially pioneered by Dr. Karel Svoboda, who is now a Howard Hughes Medical Institute Investigator at Janelia Farm. Preparations like the one shown here can be used for imaging of neocortical structure (e.g., dendritic and axonal dynamics),  to record neuronal activity using calcium-sensitive dyes, to image cortical blood flow dynamics, or for intrinsic optical imaging studies. Deep imaging of the neocortex is possible with optimal cranial window surgeries. Operating under the most sterile conditions possible to avoid infections, together with using extreme care to do not damage the dura mater during the surgery, will result in successful and long-lasting glass-covered cranial windows.


This video and protocol demonstrate how to implant a glass-covered cranial window in rodents. These preparations can be used for chronic in vivo two-photon imaging of the neocortex over time scales of months. It may also be used for other types of imaging, including optical intrinsic signal imaging.

Ein Kraniotomie Chirurgie Verfahren für chronische Brain Imaging

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Vitro Nuclear Assembly mit Fraktionierte Xenopus Egg Auszüge

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. Lightweight recording devices carrying a high density array of tetrodes allow for the simultaneous monitoring of the activity of tens to hundreds of individual neurons. Here we describe a protocol for the fabrication of a micro-drive array with twenty one independently movable micro-drives. This device has been used successfully to record from hippocampal and cortical neurons in our lab. We show how to prepare a custom designed, 3-D printed plastic base that will hold the micro-drives. We demonstrate how to construct the individual micro-drives and how to assemble the complete micro-drive array. Further preparation of the drive array for surgical implantation, such as the fabrication of tetrodes, loading of tetrodes into the drive array and gold-plating, is covered in a subsequent video article.

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

In this protocol we demonstrate how to fabricate a micro-drive array for chronic electrophysiological recordings in rats.

Micro-Drive-Array für chronische In vivo Recording: Drive Fabrication

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Montage-, Lade-und Alignment einer analytischen Ultrazentrifuge Messkammerdirektanschluss

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, retina-specific or conditional knockout mouse models often display early lethality or suffer from severe malformations, preventing an analysis beyond embryonic or early postnatal stages.
Primary cell culture is an alternative to investigate the effects of exogenously applied recombinant factors, overexpression of genes or siRNA-mediated gene knockdown in a controlled environment. Dissociated cell culture has the advantage that the endogenous signals reaching the target cells are reduced, thereby facilitating the identification of exogenously triggered effects after pharmacological manipulation. However, important cell-cell interactions are initially destroyed by enzymatic digestion or mechanical dissociation, even if re-aggregated retinospheroid cultures1 are used.
By contrast, organotypic retinal wholemount cultures provide a system close to the physiological in vivo situation with neuronal interactions and connections still preserved2-5.
In this video article we provide a step by step demonstration of (1) the establishment of in vivo-like organotypic retinal wholemount cultures including dissection peculiarities of embryonic, postnatal and adult murine eyes and (2) a dissociation and cytospin procedure for analysis of neuronal apoptosis and retinal cell proliferation in organotypic wholemounts, e.g. after culture in the presence of exogenously applied recombinant factors.

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

This video article demonstrates the establishment of organotypic retinal wholemount cultures and a cytospin procedure for analysis of exogenously induced effects. Organotypic retinal wholemount cultures mimic the in vivo situation and significantly facilitate the accessibility of murine retinas for experimental manipulations while circumventing the disadvantages of classical murine animal models.

In vivo-ähnlichen Organotypische Murine Retinal Wholemount Kultur

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Array Comparative Genomic Hybridization (Array-CGH) zum Nachweis von Genomic Copy Number Varianten

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Mess DNA-Schädigung und -Reparatur in Maus-Splenozyten nach chronischer<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Exposition gegenüber sehr niedrigen Dosen von Beta- und Gamma-Strahlung

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...