Nous tenons à souligner juin Yamamoto pour son design et la construction de l&#39;automatique, dispositif motorisé tétrode twister dépeint dans la vidéo. En outre, nous tenons à remercier tous les membres passés et présents Lab Wilson pour leur contribution à la micro-disque et le développement technologique tétrode dans le laboratoire.

1. Fabrication de tétrodes <ol><li> Commencer la construction d&#39;une tétrode par l&#39;obtention d&#39;une longueur de 50 cm, polyimide isolés, ni chrome-fil avec un noyau 12,5 microns de diamètre. Plier le fil en demi. Passez vos doigts le long de la paire pour les faire coller ensemble. Assurez-vous que la paire de fils ont un bon contact sur toute leur longueur. </li><li> Pliez à nouveau la paire en tenant les deux extrémités ensemble. Assurez-vous que la boucle formée sur une extrémité n&#39;est pas plié. Coupez les quatre fils sur l&#39;extrémité non bouclé afin que les quatre pointes sont alignées. </li><li> Pour la prochaine étape, vous aurez besoin d&#39;une pince crocodile modifié, un dispositif de retournement motorisé, et une barre horizontale au-dessus du dispositif de retournement. La pince crocodile est modifié par collage d&#39;une barre en plastique à la base de la pince. Lorsque les conseils de fil sont exposés, pince les quatre fils avec la pince crocodile modifié. Accrochez la boucle de fils sur la barre horizontale. Placez la pince crocodile dans la platine motorisée. </li><li> Appliquer 80 aiguilles d&#39;une montre rebondissements, suivis de 40 tours dans le sens horaire à l&#39;encontre des faisceau de fils au cours d&#39;environ trois minutes. Ces paramètres peuvent être modifiés selon vos besoins. </li><li> Après tordant tétrode est terminée, fusionner les fils ensemble en chauffant à partir de trois angles différents avec un pistolet thermique (420 ° C ou 790 ° F), en utilisant moyenne-faible débit. Pour chaque angle, commencent à 1-2 cm en dessous, où le faisceau de fils se sépare, exécutez le canon à chaleur haut et bas à une distance de 2 cm les fils pendant environ 5 secondes. Faites preuve de prudence car les températures élevées seront complètement fondre l&#39;isolation et conduire à des courts-circuits. </li><li> Maintenant que les fils ont fusionné, retirez la tétrode de l&#39;appareil torsion en soulevant doucement la pince crocodile pour soulager la tension sur la tétrode, et couper la tétrode à proximité de la pince crocodile. À l&#39;autre extrémité, couper la boucle de telle sorte que, il ya quatre brins non-collé de fil de longueur égale. </li><li> Ensuite, séparer les brins individuels au sommet par flexion délicatement les fils avec une pince molle basculé. </li><li> La tétrode est maintenant prêt pour le chargement dans le tableau des micro-disque. 21 pour faire 25 de plus tétrodes et les stocker dans une boîte sans poussière jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit temps pour le processus de chargement tétrode. </li></ol> 2. Chargement de la tétrodes et les fils de terre dans le tableau des micro-disque <ol><li> Pour continuer, vous aurez besoin d&#39;un micro-disque complète de tableau. Si vous n&#39;avez pas encore construit un, reportez-vous à la vidéo «Micro-drive array pour les maladies chroniques in vivo d&#39;enregistrement:. Entraînement de fabrication &#39; Dans notre plan de la conception, la tétrode sera attachée à une extrémité du connecteur du matériel, et se poursuivra à travers le polyimide tube porteur dans le lecteur de micro-tels que les pointes d&#39;électrodes s&#39;étendent en dessous de la base de la matrice de micro-disque. </li><li> Avant de commencer, de construire un porte-disque qui peut être fixé à la carte du connecteur sur une extrémité, et sur l&#39;autre extrémité, peut être serrée par un Panavise. Dans cet exemple, le détenteur du disque est un connecteur Mill-Max collé à une extrémité d&#39;un manche de couteau X-Acto (figure 1c). </li><li> En tenant la tétrode avec une pince à épiler pointe douce et en utilisant un stéréoscope, poussez la pointe de la tétrode dans le polyimide tube porteur d&#39;un des lecteurs de micro-. Poussez la tétrode dans le tube jusqu&#39;à ce que le fils électrodes individuelles sont proches de la carte de connexion au haut de la baie de disques. Attention à ne pas tordre ou plier le fils, comme qui causera la tétrode à entrer dans le cerveau, à un angle, plutôt que perpendiculaire, et va affaiblir l&#39;intégrité de la tétrode. </li><li> Doucement nourrir l&#39;autre extrémité des quatre fils dans leurs trous respectifs au sein du conseil d&#39;interface électrode en utilisant une pince à épiler pointe molle. Encore une fois, éviter de le déformer ou plier les fils. Avec les quatre fils en place, poussez les broches d&#39;or dans leurs trous avec une paire de pinces qui ont une mâchoire inférieure raccourcie. Lorsque les broches sont poussés dans le trou, ils se dénuder de fil et de créer une connexion électrique. </li><li> Pour référence ultérieure, de garder trace de la correspondance entre les micro-disques et position des broches sur la carte d&#39;interface électrode. </li><li> Poursuivre le chargement d&#39;un total de 18 tétrodes. Les trois autres micro-disques sur le tableau sera utilisé pour loger les électrodes de référence. Chaque électrode de référence est faite d&#39;une tétrode qui n&#39;utilise qu&#39;un seul des quatre extrémités des fils non adhérents. Pour attacher les électrodes de référence, suivez la procédure de chargement mais attachent une seule des quatre électrodes à la broche électrode de référence respectives sur le connecteur de carte. </li><li> Si vous êtes planification multi-site des enregistrements, il peut être utile pour planifier les connexions de la tétrodes au conseil connecteur d&#39;avance. Cela devrait minimiser la possibilité d&#39;ajuster la tétrode mal lors des expériences. </li><li> Une fois le chargement tétrode est terminée, faire deux fils de terre, un pour les animaux et un pour le cône de protection. Coupez un 6 &#39;long fil d&#39;acier isolée (texte: 0,005 m de diamètre) et enlever 3 mm d&#39;isolant, en utilisant une pince à épiler en métal, à partir de chaque extrémité du fil. Puis couper un 4«Fil d&#39;acier à long isolé (texte: 0.005&quot; de diamètre). Retirer 3 mm d&#39;isolant à une extrémité et 1 cm à l&#39;autre bout. </li><li> Route fil de terre du 6 &#39;à travers le trou sur le côté de la matrice de micro-disque et remontée vers la carte d&#39;interface. Connectez le fil exposé à la carte d&#39;interface électrode avec une épingle d&#39;or dans le trou au sol désigné. Ce fil se connecte à crâne de l&#39;animal. </li><li> Route de la 4 &#39;en parallèle le fil de terre au fil de terre préalablement installé. Connectez l&#39;extrémité 3 mm dépouillé de la carte d&#39;interface électrode en utilisant une épingle d&#39;or à un autre trou-chaussée désignée. Ce fil sera ensuite connecté à un cône de protection, qui agira comme une cage de Faraday faible pour réduire les bruits parasites. Nous sommes maintenant terminé et les fils de raccordement peuvent procéder à affiner notre tétrodes. </li></ol> 3. Réglage de la longueur de la tétrodes <ol><li> Notre objectif dans ce processus est de couper tous les tétrodes afin qu&#39;ils soient légèrement plus long que la profondeur de la structure du cerveau cible. Dans notre exemple, les disques micro-sont conçus pour une course maximale de 5-6 mm, suffisante pour atteindre de nombreuses zones du néocortex et l&#39;hippocampe dorsal d&#39;un rat adulte. Premièrement, la baisse tous les disques micro-afin que le maximum tétrodes sont exposés. Couper simultanément tous les tétrodes aux longueurs qui sont d&#39;environ 5 mm plus long que la longueur finale désirée à l&#39;aide d&#39;une paire de ciseaux pointus bien. </li><li> Pour le montage final, préparer une paire de ciseaux crantés dans un Panavise. Clamp une poignée avec un léger angle vers le bas et vers le haut avec des dentelures, tout en laissant l&#39;autre poignée ballants. </li><li> Maintenant retirer complètement toutes les tétrodes dans leur canule guide en tournant les disques micro-up. </li><li> Utilisation d&#39;un stéréoscope, totalement étendre une tétrode à partir de sa canule. En utilisant une règle, la position du ciseaux crantés à la distance souhaitée de la canule guide. Lentement et doucement coupé la tétrode avec un mouvement fluide. Après cette tétrode a été coupé, retirer le micro-disque en hausse de 3-4mm. Répétez ce processus pour chaque tétrode jusqu&#39;à ce que tous ont été coupés. A ce point vous êtes prêt pour le placage or. </li></ol> 4. Dorure sur tétrodes et vérifier la qualité Dorure des fils de nichrome tétrode est critique pour les enregistrements à long terme stable. Il empêche la corrosion et la biocompatibilité s&#39;améliore. <ol><li> Configuration de l&#39;impédancemètre en mode externe et le générateur de courant en mode de contrôle continu avec une sortie audio (figure 1d). Touchez les deux fils du générateur de courant pour les six paires possibles de canaux au sein de chaque tétrode, et utiliser le feedback audio pour déterminer si des shorts existent entre les paires. Si un court existe, recoupez la tétrode aux ciseaux crantés et tester à nouveau. Si le problème persiste, jeter la tétrode et de le remplacer. </li><li> Lorsque les shorts existent dans tous les tétrodes, déplacer tous les disques micro-bas, s&#39;étendant tous les tétrodes aussi loin que possible. </li><li> Modifier la configuration de l&#39;équipement pour vérifier l&#39;impédance de l&#39;électrode (figure 1e). Maintenant tremper le bout de toutes les tétrodes dans un bain d&#39;étalon-or-placage solution. Le bain d&#39;or est relié électriquement à la borne positive de l&#39;impédancemètre. Vérifiez l&#39;impédance de l&#39;électrode en touchant le fil négatif de l&#39;impédancemètre à la broche correspondante sur le connecteur de carte. </li><li> Mesurer et enregistrer l&#39;impédance de chaque fil sur le réseau de micro-disque. Les valeurs normales vont de MOhm 1-3. </li><li> Sur le générateur de courant, réglez le courant entre 1-3 uA. Ensuite, attacher solidement le fil négatif de l&#39;impédancemètre à la broche sur le connecteur de carte. Placer l&#39;équipement dans la configuration de galvanoplastie (Figure 1f). Sur l&#39;impédancemètre, basculer rapidement du mode normal, en mode bypass, et le dos. Alors en mode bypass, le courant va passer par la tétrode et la solution de l&#39;or et l&#39;or sera plaqué sur la pointe de l&#39;électrode. L&#39;impédance après chaque tour de placage devrait être moins qu&#39;avant. Répétez l&#39;impulsion de courant si l&#39;impédance ne descend pas en dessous de 1 MOhm. Une gamme conservatrice des impédances acceptables sont 250kOhm à 350 kOhm. Si l&#39;impédance est inférieure à 200 kOhm, cela peut indiquer un court-circuit. </li><li> Si après impulsions répétées de l&#39;impédance ne chute pas suffisamment, l&#39;extrémité de l&#39;électrode peut être obstrué. Recoupez les tétrode, vérifiez pour les courts métrages, et répétez le processus dorure. Si re-coupe ne vous aide pas, remplacer la tétrode et recommencer. </li><li> Après étalement tous les tétrodes, tremper les conseils tétrode brièvement dans l&#39;éthanol, et les laisser sécher pendant 3 à 5 minutes. </li><li> Test de courts-circuits au sein tétrodes utilisant le générateur de courant avec les conseils tétrode exposés à l&#39;air. Si une connexion cc existe entre deux ou plusieurs électrodes d&#39;une tétrode, recoupez la tétrode, et la plaque avec de l&#39;or à nouveau. </li><li> Après la dorure de tous les tétrodes est terminée, ajouter une goutte d&#39;épaisseur de la colle cyano-acrylate moyenne à l&#39;interface entre chaque tetrode et son tube de polyimide. Cela assurera la tétrode à ses micro-disque et de maintenir la longueur de la tétrode. </li><li> Comme dernière étape, déplacez tous les tétrodes dans le lecteur en tournant toutes les vis en place. </li></ol> 5. Fixation du cône de protection Le cône de protection objectif est de protéger les micro-disques et le fil tétrode exposés à partir de l&#39;environnement. Il fournit également un soutien pour la manipulation lors d&#39;une expérience et réduit le bruit électrique. Nous utilisons un 3-D cône en plastique imprimés (Partie I de référence: la fabrication d&#39;entraînement). Cependant, il est possible de faire le cône d&#39;autres matériaux, comme un morceau plié de canette de soda. <ol><li> Prenez le cône en plastique et corriger certains ruban d&#39;aluminium à la surface intérieure ou extérieure. </li><li> Ensuite, percer un petit trou (1,5 mm de diamètre) à travers le cône et vaguement attachent une vis avec une rondelle et un écrou à l&#39;intérieur du cône. Ce sera un passage électrique pour le fil de terre. Nous vous recommandons d&#39;utiliser une vis de 00 à 80 la taille et la combinaison rondelle. </li><li> D&#39;abord, insérez et partiellement virage trois vis 1-72 de taille (3 / 16 pouces de longueur) dans les côtés du cône. Avec la baie de disques suspendus, insérez le cône sur le disque. Assurez-vous que les fils de terre s&#39;étend à partir du bas du tableau d&#39;entraînement. Enveloppez la partie exposée de fil de terre du 4 &#39;autour d&#39;une des vis 1-72 à plusieurs reprises et serrer la vis serrée. Fixez le cône à la base d&#39;entraînement en serrant les deux vis restantes cône. </li><li> Enfin, prendre la 1 cm extrémité dénudée du fil de terre à court et enroulez-le autour de la vis, entre le ruban métallique et une rondelle. Fixez le sol en serrant la vis. Maintenant nous avons une gamme de micro-lecteur qui est enfin prêt pour l&#39;implantation chirurgicale. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs <ol><li> La production de micro-array disque est maintenant terminée. Votre micro-array disque est chargé avec 18 tétrodes et 3 chaînes de référence. Il est enfermé dans un cône de protection et une casquette pour la longévité. Le fini de la micro-voiture tableau avec cône de protection pèse 20g à 25g en moyenne. </li><li> Le tableau d&#39;entraînement fini est implanté en utilisant la norme procédure chirurgicale. Comme vous pouvez le voir, le lecteur est connecté à une puce préamplificateur et d&#39;un faisceau de fils qui transportent le signal vers un matériel d&#39;acquisition de données et logiciels. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1098/CompositeFigure1_highqualityn.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1: Un Schéma) de configuration tordant tétrode. Une barre horizontale suspend le fils électrodes non adhérents de l&#39;tétrode dessus de l&#39;appareil tordant tétrode automatisés. B) Installation pour la mesure d&#39;impédance tétrode et le placage de l&#39;électrode. Lors de la vérification pour les courts-circuits, le circuit est différent:. Le fil noir est attaché à un autre canal d&#39;électrodes sur le connecteur de carte C) Un gros plan d&#39;une coutume fait des micro-disque porte-outil de tableau. La barre cylindrique est une manche du couteau X-Acto. Le connecteur est un 26 broches, double rangée, Mill-Max connecteur. Les deux pièces sont collées ensemble en utilisant l&#39;acrylique dentaire. D) de configuration pour vérifier court. Canal X et Y sont les canaux de deux canaux différents des quatre canaux tétrode. E) de configuration pour la mesure de l&#39;impédance de l&#39;électrode. La source de courant est &#39;off&#39;. L&#39;impédancemètre est réglé sur &#39;on&#39; et &#39;test&#39;. F) de configuration pour placage d&#39;or de conseils électrode. La source de courant est réglé sur &quot;on&quot;, l&#39;audio est «on», le mode est «unipolaire», Test DC est «on», le courant est fixé à 2 microampères.

<ol>
	<li>Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrodes+markedly+improve+the+reliability+and+yield+of+multiple+single-unit+isolation+from+multi-unit+recordings+in+cat+striate+cortex.">Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex.</a> J. Neurosci. Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).</li></ol>

Ce protocole est la deuxième tranche d&#39;un protocole en deux parties: «Les micro-disque array pour les maladies chroniques in vivo d&#39;enregistrement.&quot; La combinaison de la gamme du lecteur de micro-et la tétrode est un outil puissant pour obtenir des enregistrements simultanés de nombreux neurones dans un éveillé, comporte la préparation des animaux. J&#39;espère que nous vous avons fourni toutes les informations nécessaires pour vous aurez besoin pour commencer ou améliorer les enregistrements éle...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Panavise</td>
<td>Tool</td>
<td>Panavise</td>
<td>Model 301</td>
<td>Holds either micro-drive array or serrated scissors</td>
</tr>
<tr>
<td>Modified Xcelite 378M Pliers</td>
<td>Tool</td>
<td>Newark</td>
<td>96F8903</td>
<td>For inserting connector board pins. To make, remove 2mm from one tip of the pliers.</td>
</tr>
<tr>
<td>Slow Cure Glue</td>
<td>Material</td>
<td>Great Planes (Champaign, IL)</td>
<td>GPMR6015</td>
<td>To glue the tetrode to the micro-drive</td>
</tr>
<tr>
<td>Gold Plating Solution</td>
<td>Material</td>
<td>Neuralynx</td>
<td>Sifco Selectron Gold NC</td>
<td>Contains gold particles for electroplating</td>
</tr>
<tr>
<td>Current Generator</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>A365D-B</td>
<td>A.K.A. Stimulus Isolator. Used to electroplate gold solution onto electrode tips.</td>
</tr>
<tr>
<td>Impedance Meter</td>
<td>Tool</td>
<td>BAK Electronics</td>
<td>IMP-1 / 6662 / 2788</td>
<td>To check impedance of electrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>Hot Air Gun</td>
<td>Tool</td>
<td>Steinel (Germany)</td>
<td>HG 3002 LCD</td>
<td>To fuse electrodes together to make tetrode</td>
</tr>
<tr>
<td>Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers</td>
<td>Tool</td>
<td>Aven (Ann Arbor, MI)</td>
<td>18768 (Pattern 304)</td>
<td>For handling tetrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>Alligator Clip</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>18050-35</td>
<td>A.K.A. Bulldog serrefine. To clip the tetrodes together during twisting</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Dissecting Scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Biomedical Research Instruments</td>
<td>25-1000</td>
<td>For general cutting of tetrode/electrode wire</td>
</tr>
<tr>
<td>Iris Toughcut Serrated Scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14058-09</td>
<td>For final cut of tetrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>Teflon Coated Stainless Steel Wire</td>
<td>Material</td>
<td>A-M Systems (Carlsborg, WA)</td>
<td>790500</td>
<td>Ground wire</td>
</tr>
<tr>
<td>12.5 micron nichrome wire</td>
<td>Material</td>
<td>Kanthal Palm Coast</td>
<td>Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING</td>
<td>Polyimide coated micro-wire for making tetrodes.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tetrode Twister</td>
<td>Tool</td>
<td>Neuralynx</td>
<td>Tetrode Assembly Station</td>
<td>Increases the speed and consistency of tetrode fabrication.

</td>
</tr>
<tr>
<td>Silver Paint</td>
<td>Material</td>
<td>GC Electronics</td>
<td>22-023</td>
<td>For connecting the micro-electrode wires of the tetrode to the connector pins (see Discussion)</td>
</tr>
<tr>
<td>X-Acto Knife Handle</td>
<td>Material</td>
<td>MSC Direct</td>
<td>X3001</td>
<td>For constructing a micro-drive holding device.</td>
</tr>
<tr>
<td>26 Pin, 2 Row Connector</td>
<td>Material</td>
<td>Mill-max</td>
<td>852-10-026-30-001000</td>
<td>For constructing a micro-drive holding device.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly

La tétrode, un faisceau de quatre électrodes, s&#39;est avéré être un outil précieux pour l&#39;enregistrement simultané de plusieurs neurones in vivo. L&#39;amplitude différentielle de signatures du potentiel d&#39;action sur les canaux d&#39;une tétrode permet l&#39;isolement d&#39;une seule unité d&#39;activité d&#39;unités multiples signaux. La capacité de contrôler avec précision l&#39;emplacement stéréotaxique et la profondeur de la tétrode est essentielle pour l&#39;étude de l&#39;activité neurale coordonnée entre les régions du cerveau. En combinaison avec une matrice de lecteur de micro-, il est possible de réaliser un placement précis et un contrôle stable des tétrodes nombreuses au cours des jours à plusieurs semaines. Dans ce protocole, nous démontrons comment fabriquer et tétrodes condition en utilisant des outils et matériaux de base, installez le tétrodes dans un tableau tétrode multi-disques pour les maladies chroniques in vivo chez le rat d&#39;enregistrement, faire les raccordements câble de terre à la baie de micro-disque, et joignez un cône de protection sur la matrice du disque micro-afin de protéger l&#39;tétrodes du contact physique avec l&#39;environnement.

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Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

Dans ce protocole, nous montrer comment fabriquer et tétrodes condition pour une utilisation avec un éventail de micro-disque, qui a été conçu pour les enregistrements électrophysiologiques chroniques chez le rat. De plus, nous illustrons les étapes finales de la construction de micro-array disque, qui comprend l&#39;installation de câbles de terre et d&#39;un cône de protection.

Micro-drive tableau pour les maladies chroniques In vivo Enregistrement: Assemblée Tétrode

The tetrode, a bundle of four electrodes, has proven to be a valuable tool for the simultaneous recording of multiple neurons in-vivo.  The differential ...

micro-drive-array-for-chronic-in-vivo-recording-tetrode-assembly

Research

JoVE Journal

Biology

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

33.1K vues.  MIT - Massachusetts Institute of Technology. Dans ce protocole, nous montrer comment fabriquer et tétrodes condition pour une utilisation avec un éventail de micro-disque, qui a été conçu pour les enregistrements électrophysiologiques chroniques chez le rat. De plus, nous illustrons les étapes finales de la construction de micro-array disque, qui comprend l'installation de câbles de terre et d'un cône de protection.

Vidéo: Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Application de résine photopolymérisable adhésif dentaire pour les électrodes de montage ou des sondes de microdialyse dans les expériences chroniques

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Recherche

Biologie

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. Lightweight recording devices carrying a high density array of tetrodes allow for the simultaneous monitoring of the activity of tens to hundreds of individual neurons. Here we describe a protocol for the fabrication of a micro-drive array with twenty one independently movable micro-drives. This device has been used successfully to record from hippocampal and cortical neurons in our lab. We show how to prepare a custom designed, 3-D printed plastic base that will hold the micro-drives. We demonstrate how to construct the individual micro-drives and how to assemble the complete micro-drive array. Further preparation of the drive array for surgical implantation, such as the fabrication of tetrodes, loading of tetrodes into the drive array and gold-plating, is covered in a subsequent video article.

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

In this protocol we demonstrate how to fabricate a micro-drive array for chronic electrophysiological recordings in rats.

Micro-drive tableau pour les maladies chroniques In vivo Enregistrement: Disque de fabrication

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Enregistrement électrophysiologique dans le Drosophile Embryon

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Assemblée, de chargement, et l&#39;alignement d&#39;une cellule échantillon ultracentrifugation analytique

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, retina-specific or conditional knockout mouse models often display early lethality or suffer from severe malformations, preventing an analysis beyond embryonic or early postnatal stages.
Primary cell culture is an alternative to investigate the effects of exogenously applied recombinant factors, overexpression of genes or siRNA-mediated gene knockdown in a controlled environment. Dissociated cell culture has the advantage that the endogenous signals reaching the target cells are reduced, thereby facilitating the identification of exogenously triggered effects after pharmacological manipulation. However, important cell-cell interactions are initially destroyed by enzymatic digestion or mechanical dissociation, even if re-aggregated retinospheroid cultures1 are used.
By contrast, organotypic retinal wholemount cultures provide a system close to the physiological in vivo situation with neuronal interactions and connections still preserved2-5.
In this video article we provide a step by step demonstration of (1) the establishment of in vivo-like organotypic retinal wholemount cultures including dissection peculiarities of embryonic, postnatal and adult murine eyes and (2) a dissociation and cytospin procedure for analysis of neuronal apoptosis and retinal cell proliferation in organotypic wholemounts, e.g. after culture in the presence of exogenously applied recombinant factors.

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

This video article demonstrates the establishment of organotypic retinal wholemount cultures and a cytospin procedure for analysis of exogenously induced effects. Organotypic retinal wholemount cultures mimic the in vivo situation and significantly facilitate the accessibility of murine retinas for experimental manipulations while circumventing the disadvantages of classical murine animal models.

In vivo-like organotypiques Culture Wholemount murin rétiniennes

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

Ambulatory ECG Recording in Mice

Telemetric ECG recording in mice is essential to understanding the mechanisms behind arrhythmias, conduction disorders, and sudden cardiac death. Although the surface ECG is utilized for short-term measurements of waveform intervals, it is not practical for long-term studies of heart rate variability or the capture of rare episodes of arrhythmias. Implantable ECG telemeters offer the advantages of simple surgical implantation, long-term recording of electrograms in ambulatory mice, and scalability with simultaneous recordings of multiple animals. Here, we present a step-by-step guide to the implantation of telemeters for ambulatory ECG recording in mice. Careful adherence to aseptic technique is required for favorable survival results with the possibility of implantation and recording from weeks to months. Thus, implantable ECG telemetry is a valuable tool for detection of critical information on cardiac electrophysiology in ambulatory animal models such as the mouse. 

Telemetric ECG has emerged as an essential tool in evaluating animal models for cardiac arrhythmias and sudden cardiac death. Here, we present a stepwise guide to telemetric ECG recordings for application in long-term ambulatory ECG monitoring in mice.

Ambulatoires enregistrement de l&#39;ECG chez des souris

Telemetric ECG recording in mice is essential to understanding the mechanisms behind arrhythmias, conduction disorders, and sudden cardiac death. Although ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canal cellulaire attaché patch-clamp enregistrement

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Tableau hybridation génomique comparative (CGH array) pour la détection des variantes génomiques du nombre de copies

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Mesure de dommages et réparation de l&#39;ADN dans les splénocytes de souris Après chronique<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;exposition à de très faibles doses de bêta et gamma Rayonnement

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

L&#39;Assemblée et l&#39;application des «Shear Anneaux»: A Novel Endothelial Modèle pour Orbital, unidirectionnel et périodique Fluid débit et contrainte de cisaillement

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...