Gostaríamos de agradecer junho Yamamoto por sua concepção e construção do, motorizado automático tetrode dispositivo twister retratado no vídeo. Além disso, gostaríamos de agradecer todos os membros Lab passado e do presente Wilson por suas contribuições para micro-drive e desenvolvimento tetrode tecnologia no laboratório.

1. Fabricação de tetrodes <ol><li> Iniciar a construção de um tetrode pela obtenção de um 50 cm de comprimento, poliimida isolado, ni-cromo fio com um núcleo de diâmetro 12,5 micra. Dobre o arame ao meio. Correr os dedos ao longo do par para fazê-los ficarem juntos. Verifique se o par de fios de ter um bom contato durante toda a sua extensão. </li><li> Dobre a par de novo, segurando as duas pontas. Certifique-se que o laço formado em uma extremidade não está dobrada. Corte a quatro fios na extremidade não-looped para que os quatro dicas são alinhados. </li><li> Para a próxima etapa, você vai precisar de um jacaré modificado, um dispositivo de giro motorizado, e uma barra horizontal acima do dispositivo de giro. O jacaré é modificado por colagem de uma barra de plástico à base do clipe. Onde as pontas do fio são expostos, prender a quatro fios, juntamente com o clipe de jacaré modificado. Pendurar o laço de fios por cima da barra horizontal. Coloque o jacaré para o palco motorizado. </li><li> Aplicar 80 clock-wise torce seguida de 40 voltas dos ponteiros do relógio contra o conjunto de cabo ao longo de aproximadamente três minutos. Estes parâmetros podem ser variados de acordo com suas necessidades. </li><li> Após a torção tetrode estiver concluída, fundir os fios juntos por aquecimento a partir de três ângulos diferentes, com uma pistola de calor (420 ° C ou 790 ° F), utilizando média-baixa vazão. Para cada ângulo, comece 1-2 cm abaixo de onde o conjunto de cabo divide, execute o injetor de calor para baixo e para cima a uma distância de 2 cm dos fios por cerca de 5 segundos. Tenha cuidado as altas temperaturas vão derreter completamente o isolamento e provocar curto-circuitos. </li><li> Agora que os fios têm fundidos, remova o tetrode do aparelho torcer suavemente levantar o jacaré para aliviar a tensão sobre o tetrode, e cortar o tetrode perto do jacaré. Na outra ponta, corte o laço de tal forma que existem quatro eixos não-ligado de fio de comprimento igual. </li><li> Em seguida, separe os fios de cabelo no topo por dobrando os fios com uma pinça com ponta macia. </li><li> O tetrode está agora pronto para carregar na matriz micro-drive. Faça 21-25 mais tetrodes e armazená-los em uma caixa livre de poeira até que seja tempo para o processo de carregamento tetrode. </li></ol> 2. Carregando o tetrodes e fios de aterramento na matriz micro-drive <ol><li> Para continuar, você precisará de um conjunto de micro-drive completo. Se você ainda não construiu um, consulte o vídeo &#39;array drive-Micro para doenças crônicas in-vivo gravação:. Fabricação drive&#39; Em nosso plano de design, o tetrode será anexado em uma extremidade para hardware de conexão, e será executado através do tubo transportador poliimida na unidade de micro-tal forma que as pontas de eletrodos se estendem abaixo da base da unidade matriz-micro. </li><li> Antes de começar, construir uma unidade de suporte que pode ser conectada à placa conector em uma extremidade e na outra extremidade, podem ser fixadas por um Panavise. Neste exemplo, o titular da unidade é um conector de moinho-max colada a uma extremidade de um cabo da faca X-Acto (Figura 1c). </li><li> Segurando o tetrode com pinças com ponta macia e usando um estereoscópio, empurre a ponta do tetrode no poliimida tubo transportador de uma das unidades de micro-. Empurrar o tetrode no tubo até que o eletrodo fios individuais estão perto do conector da placa no topo da unidade matriz. Tenha cuidado para não torcer ou dobrar os fios, pois isso fará com que o tetrode para entrar no cérebro em um ângulo, em vez de perpendicular, e vai enfraquecer a integridade do tetrode. </li><li> Suavemente alimentar o outro lado dos quatro fios em seus respectivos furos na placa de interface eletrodo usando uma pinça com ponta macia. Novamente, evite torcer ou dobrar os fios. Com todos os quatro fios no lugar, empurre os pinos de ouro em seus buracos com um par de alicates que possuem uma mandíbula inferior encurtado. Quando os pinos são empurrados para dentro do buraco, eles vão retirar o isolamento de fios e criar uma conexão elétrica. </li><li> Para posterior referência, manter o controle do mapeamento entre o micro-drives e posição do pino na placa de interface eletrodo. </li><li> Continuar a carregar um total de 18 tetrodes. Os três restantes micro-drives no array serão usados ​​para abrigar os eletrodos de referência. Cada eletrodo de referência é feita de um tetrode que usa apenas uma das quatro extremidades dos fios não colados. Para prender os eletrodos de referência, siga o procedimento de carregamento, mas anexar apenas um dos quatro eletrodos para o pino de referência respectivos eletrodo na placa do conector. </li><li> Se você está planejando gravações multi-site, pode ser útil para planejar as conexões do tetrodes ao conector da placa antes do tempo. Isso deve minimizar a possibilidade de ajustar o tetrode errado durante as experiências. </li><li> Após o carregamento tetrode estiver concluída, fazer dois fios de aterramento, um para o animal e uma para o cone de proteção. Cortar uma 6 &#39;fio de aço longo isolados (texto: 0,005 &quot;de diâmetro) e remover 3 mm de isolamento, usando uma pinça de metal, de cada extremidade do fio. Em seguida, corte a 4&#39;Fio de aço longo isolados (texto: 0,005 &quot;de diâmetro). Remover 3 mm de isolamento de um lado e 1 cm na outra extremidade. </li><li> Route fio 6 &#39;chão através do buraco do lado da unidade matriz micro-e até para a placa de interface. Ligue o fio exposto à placa de interface eletrodo com um alfinete de ouro para o buraco terreno designado. Este fio vai ligar ao crânio do animal. </li><li> Encaminhar a 4 &#39;paralela fio terra para o fio terra instalado anteriormente. Conecte a extremidade 3 milímetros despido até a placa de interface eletrodo usando um alfinete de ouro em outro buraco terreno designado. Este fio será posteriormente ligado a um cone de proteção, que funcionará como uma gaiola de Faraday pequenos para reduzir a captação de ruídos. Estamos agora a terminar fios de ligação e pode continuar com o nosso tetrodes refino. </li></ol> 3. Ajuste o comprimento do tetrodes <ol><li> Nosso objetivo neste processo é cortar todas as tetrodes de modo que sejam um pouco mais do que a profundidade da estrutura do cérebro alvo. No nosso exemplo, as unidades de micro-são projetados para uma viagem máximo de 5-6 mm, suficiente para chegar a muitas áreas neocortical e do hipocampo dorsal de um rato adulto. Primeiro, baixar todas as unidades de micro-para que o máximo tetrodes são expostos. Simultaneamente cortar todas as tetrodes aos comprimentos que são cerca de 5 mm mais comprido do que o comprimento final desejado usando um par de tesouras afiadas bem. </li><li> Para o corte final, preparar um par de tesouras serrilhadas em um Panavise. Grampo uma alça com um ligeiro ângulo para baixo e com serrilhas virado para cima, deixando a outra alça balançando. </li><li> Agora retirar completamente todas as tetrodes em suas cânula guia, transformando as unidades de micro-up. </li><li> Utilizando um estereoscópio, estender completamente um tetrode fora de sua cânula. Usando uma régua posição, a tesoura serrilhada na distância desejada da cânula guia. Lenta e suavemente cortar o tetrode com um movimento suave. Após este tetrode foi cortada, retirar o micro-drive por 3-4mm. Repita esse processo para cada tetrode até que todos tenham sido cortadas. Neste ponto você está pronto para revestimento de ouro. </li></ol> 4. Revestimento de ouro de tetrodes e verificar a qualidade Chapeamento de ouro os fios tetrode nichrome é fundamental para gravações de longa duração estável. Ela impede a corrosão e biocompatibilidade melhora. <ol><li> Instalação do medidor de impedância no modo externo eo gerador de corrente DC no modo de verificação com saída de áudio (Figura 1d). Toque os dois terminais do gerador de corrente aos seis possíveis pares de canais dentro de cada tetrode, e usar o feedback de áudio para determinar se existem calções entre pares. Se existe um curto, re-cortar o tetrode com tesoura serrilhada e teste novamente. Se o problema persistir, descarte o tetrode e substituí-lo. </li><li> Quando não existem bermuda dentro de todos os tetrodes, mover todas as unidades micro-down, estendendo-se todos os tetrodes tão longe quanto possível. </li><li> Modificar a configuração do equipamento para verificação de impedância do eletrodo (Figura 1e). Agora mergulhe as pontas de todos os tetrodes em um banho de solução sobre-padrão. O banho de ouro é eletricamente conectada ao terminal positivo do medidor de impedância. Verifique a impedância do eletrodo tocando o polo negativo do medidor de impedância para o pino correspondente na placa do conector. </li><li> Medir e registrar a impedância de cada fio na matriz de micro-drive. Valores normais variam de MOhm 1-3. </li><li> No gerador de corrente, ajuste a corrente entre 1-3 mA. Em seguida, fixar firmemente o cabo negativo do medidor de impedância para o pino do conector da placa. Coloque o equipamento na configuração de galvanoplastia (Figura 1f). No medidor de impedância, rapidamente alternar entre o modo normal, no modo bypass, e nas costas. Enquanto estiver no modo bypass, atual vai passar pelo tetrode e solução de ouro, e ouro será revestida para a ponta do eletrodo. A impedância após cada rodada do chapeamento deve ser menor do que antes. Repita o pulso de corrente se a impedância não caia abaixo de 1 MOhm. Uma gama de impedâncias conservadora aceitáveis ​​são 250kOhm a 350 kOhm. Se a impedância cai abaixo de 200 kOhm, isso pode indicar um curto-circuito. </li><li> Se depois de pulsos repetidos a impedância não cai bastante, a ponta do eletrodo pode ser obstruído. Re-corte a tetrode, verifique se há shorts, e repita o processo de ouro-plating. Se re-corte não ajudar, substituir o tetrode e começar de novo. </li><li> Após o plaqueamento todos tetrodes, mergulhe as pontas tetrode brevemente em etanol, e deixe-os secar durante 3-5 minutos. </li><li> Teste de curto-circuito dentro tetrodes usando o gerador de corrente com as pontas tetrode exposto ao ar. Se uma conexão DC existe entre dois ou mais eletrodos de um tetrode, re-cortar o tetrode, e placa de ouro novamente. </li><li> Depois de cosmética de todos os tetrodes está completo, adicionar uma gota de meio de espessura cola ciano-acrilato para a interface entre cada tetrode poliimida e sua tubulação. Isto irá assegurar a tetrode à sua unidade de micro-e manter o comprimento do tetrode. </li><li> Como etapa final, mova todos os tetrodes na unidade, transformando-se todos os parafusos. </li></ol> 5. Colocar o cone de proteção O propósito do cone de proteção é para proteger micro-drives eo fio tetrode expostos a partir do ambiente. Ele também fornece suporte para manipulação durante um experimento e reduz o ruído elétrico. Nós usamos um 3-D cone de plástico impresso (Parte Referência I: a fabricação de carro). No entanto, é possível fazer o cone de outros materiais, como um pedaço dobrado de lata de refrigerante. <ol><li> Pegue o cone de plástico e corrigir alguns fita de alumínio para a superfície interna ou externa. </li><li> Em seguida, faça um furo pequeno (1,5 mm de diâmetro), através do cone e vagamente anexar um parafuso com uma arruela e porca dentro do cone. Isso servirá como uma passagem elétrica para o fio terra. Recomendamos a utilização de um parafuso de tamanho 00-80 e combinação de máquina de lavar. </li><li> Primeiro, insira e parcialmente volta de três parafusos 1-72 tamanho (3 / 16 polegadas de comprimento) nos lados do cone. Com a unidade matriz suspensos, insira o cone sobre a unidade. Certifique-se de ambos os fios terra se estendem desde o fundo da unidade matriz. Enrole a parte exposta do fio a 4 &#39;do solo em torno de um dos parafusos 1-72 várias vezes e aperte o parafuso firmemente. Garantir o cone à base da unidade, apertando os dois parafusos restantes cone. </li><li> Por fim, pegue a 1 centímetro extremidade desencapada do fio-terra de curto e vento ao redor do parafuso, entre a fita de alumínio e máquina de lavar. Segura no chão, apertando o parafuso. Agora temos um array micro-drive que está no último pronto para implantação cirúrgica. </li></ol> 6. Resultados representativos <ol><li> Micro-drive de produção da matriz é agora completa. Sua matriz de micro-drive é carregado com 18 tetrodes e 3 canais de referência. É envolto em um cone de proteção e tampa para maior durabilidade. A matriz micro-drive terminou com cone de proteção pesa 20g para 25g, em média. </li><li> A unidade matriz final é implantado com o procedimento cirúrgico padrão. Como você pode ver, o drive é conectado a um chip pré-amplificador e um conjunto de fios que transportam o sinal de dados de aquisição de hardware e software. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1098/CompositeFigure1_highqualityn.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1: Esquema A) de tetrode configuração de torção. Uma barra horizontal suspende os fios não colados eletrodo do tetrode acima do dispositivo automático tetrode torção. B) de configuração para medição da impedância tetrode e revestimento do eletrodo. Quando a verificação de curtos-circuitos, o circuito é diferente:. O fio preto é ligado a um outro canal de eletrodo no conector da placa C) Um close-up de uma custom made ​​drive-micro ferramenta titular matriz. A barra cilíndrica é um cabo da faca X-Acto. O conector é uma linha de 26 pinos, duplo, Mill-max conector. As duas peças são unidas usando o acrílico dental. D Configuração) para verificar a curto prazo. Canal X e Y estão Canal quaisquer dois canais diferentes dos quatro canais tetrode. E) de configuração para medição da impedância do eletrodo. A fonte atual é &#39;off&#39;. O medidor de impedância é definida como &#39;on&#39; e &#39;teste&#39;. F) de configuração para revestimento de ouro das pontas dos eletrodos. A fonte atual é definida como &#39;on&#39;, o áudio é &#39;on&#39;, o modo é &quot;unipolar&quot;, Teste de DC é &#39;on&#39;, a corrente é definido como 2 microampères.

<ol>
	<li>Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrodes+markedly+improve+the+reliability+and+yield+of+multiple+single-unit+isolation+from+multi-unit+recordings+in+cat+striate+cortex.">Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex.</a> J. Neurosci. Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).</li></ol>

Este protocolo é a segunda parcela de um protocolo de duas partes: &quot;Micro drive-matriz para crônica in vivo de gravação.&quot; A combinação da unidade de micro-array e tetrode é uma ferramenta poderosa para a obtenção de gravações simultâneas de muitos neurônios em uma vigília, comportando a preparação animal. Esperançosamente, nós fornecemos-lhe com todas as informações necessárias para que você vai precisar para começar ou melhorar gravações eletrofisiológicas em seu próprio laboratóri...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Panavise</td>
<td>Tool</td>
<td>Panavise</td>
<td>Model 301</td>
<td>Holds either micro-drive array or serrated scissors</td>
</tr>
<tr>
<td>Modified Xcelite 378M Pliers</td>
<td>Tool</td>
<td>Newark</td>
<td>96F8903</td>
<td>For inserting connector board pins. To make, remove 2mm from one tip of the pliers.</td>
</tr>
<tr>
<td>Slow Cure Glue</td>
<td>Material</td>
<td>Great Planes (Champaign, IL)</td>
<td>GPMR6015</td>
<td>To glue the tetrode to the micro-drive</td>
</tr>
<tr>
<td>Gold Plating Solution</td>
<td>Material</td>
<td>Neuralynx</td>
<td>Sifco Selectron Gold NC</td>
<td>Contains gold particles for electroplating</td>
</tr>
<tr>
<td>Current Generator</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>A365D-B</td>
<td>A.K.A. Stimulus Isolator. Used to electroplate gold solution onto electrode tips.</td>
</tr>
<tr>
<td>Impedance Meter</td>
<td>Tool</td>
<td>BAK Electronics</td>
<td>IMP-1 / 6662 / 2788</td>
<td>To check impedance of electrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>Hot Air Gun</td>
<td>Tool</td>
<td>Steinel (Germany)</td>
<td>HG 3002 LCD</td>
<td>To fuse electrodes together to make tetrode</td>
</tr>
<tr>
<td>Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers</td>
<td>Tool</td>
<td>Aven (Ann Arbor, MI)</td>
<td>18768 (Pattern 304)</td>
<td>For handling tetrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>Alligator Clip</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>18050-35</td>
<td>A.K.A. Bulldog serrefine. To clip the tetrodes together during twisting</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Dissecting Scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Biomedical Research Instruments</td>
<td>25-1000</td>
<td>For general cutting of tetrode/electrode wire</td>
</tr>
<tr>
<td>Iris Toughcut Serrated Scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14058-09</td>
<td>For final cut of tetrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>Teflon Coated Stainless Steel Wire</td>
<td>Material</td>
<td>A-M Systems (Carlsborg, WA)</td>
<td>790500</td>
<td>Ground wire</td>
</tr>
<tr>
<td>12.5 micron nichrome wire</td>
<td>Material</td>
<td>Kanthal Palm Coast</td>
<td>Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING</td>
<td>Polyimide coated micro-wire for making tetrodes.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tetrode Twister</td>
<td>Tool</td>
<td>Neuralynx</td>
<td>Tetrode Assembly Station</td>
<td>Increases the speed and consistency of tetrode fabrication.

</td>
</tr>
<tr>
<td>Silver Paint</td>
<td>Material</td>
<td>GC Electronics</td>
<td>22-023</td>
<td>For connecting the micro-electrode wires of the tetrode to the connector pins (see Discussion)</td>
</tr>
<tr>
<td>X-Acto Knife Handle</td>
<td>Material</td>
<td>MSC Direct</td>
<td>X3001</td>
<td>For constructing a micro-drive holding device.</td>
</tr>
<tr>
<td>26 Pin, 2 Row Connector</td>
<td>Material</td>
<td>Mill-max</td>
<td>852-10-026-30-001000</td>
<td>For constructing a micro-drive holding device.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly

O tetrode, um pacote de quatro eletrodos, tem provado ser uma ferramenta valiosa para a gravação simultânea de múltiplos neurônios in-vivo. A amplitude diferencial de assinaturas do potencial de ação sobre os canais de um tetrode permite o isolamento da unidade única atividade da unidade de multi-sinais. A capacidade de controlar com precisão a localização estereotáxica e profundidade do tetrode é fundamental para estudar a atividade neural coordenada em todas as regiões do cérebro. Em combinação com uma matriz de unidade micro-, é possível alcançar posicionamento preciso e estável de controle tetrodes muitos ao longo de dias ou semanas. Neste protocolo, demonstramos como fabricar e tetrodes condição usando ferramentas básicas e materiais, instalar o tetrodes em uma matriz tetrode multi-disco para doenças crônicas in vivo de gravação no rato, fazer conexões fio terra para a matriz de micro-drive, e anexar um cone de proteção em série na unidade de micro-, a fim de proteger a tetrodes do contato físico com o meio ambiente.

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Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

Neste protocolo, demonstramos como fabricar e tetrodes condição para uso com uma matriz de micro-drive, que foi projetada para gravações eletrofisiológicas crônica em ratos. Além disso, ilustram as fases finais do micro-drive de construção da matriz, que inclui a instalação de fios de aterramento e um cone de proteção.

Micro-drive Array para Crônica In vivo</emGravação>: Assembléia Tetrodo

The tetrode, a bundle of four electrodes, has proven to be a valuable tool for the simultaneous recording of multiple neurons in-vivo.  The differential ...

micro-drive-array-for-chronic-in-vivo-recording-tetrode-assembly

Research

JoVE Journal

Biology

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

33.1K visualizações.  MIT - Massachusetts Institute of Technology. Neste protocolo, demonstramos como fabricar e tetrodes condição para uso com uma matriz de micro-drive, que foi projetada para gravações eletrofisiológicas crônica em ratos. Além disso, ilustram as fases finais do micro-drive de construção da matriz, que inclui a instalação de fios de aterramento e um cone de proteção.

Vídeo: Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Aplicação de Light-resina adesivo dental para Eletrodos de montagem ou Sondas microdiálise em Experimentos crônica

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Biologia

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Imuno-histoquímica em parafina da epiderme do rato utilizando anticorpos fluorescentes

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an extremely useful method, because it allows the study of the live intact brain. With appropriate preparations, this technique allows the observation of the same cortical area chronically, from minutes to months. In this video, we show a preparation for chronic in vivo imaging of the brain using two-photon microscopy. This technique was initially pioneered by Dr. Karel Svoboda, who is now a Howard Hughes Medical Institute Investigator at Janelia Farm. Preparations like the one shown here can be used for imaging of neocortical structure (e.g., dendritic and axonal dynamics),  to record neuronal activity using calcium-sensitive dyes, to image cortical blood flow dynamics, or for intrinsic optical imaging studies. Deep imaging of the neocortex is possible with optimal cranial window surgeries. Operating under the most sterile conditions possible to avoid infections, together with using extreme care to do not damage the dura mater during the surgery, will result in successful and long-lasting glass-covered cranial windows.


This video and protocol demonstrate how to implant a glass-covered cranial window in rodents. These preparations can be used for chronic in vivo two-photon imaging of the neocortex over time scales of months. It may also be used for other types of imaging, including optical intrinsic signal imaging.

Um procedimento de cirurgia Craniotomia para Brain Imaging crônica

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Vitro Assembléia Nuclear Usando Extractos Egg fracionado Xenopus

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. Lightweight recording devices carrying a high density array of tetrodes allow for the simultaneous monitoring of the activity of tens to hundreds of individual neurons. Here we describe a protocol for the fabrication of a micro-drive array with twenty one independently movable micro-drives. This device has been used successfully to record from hippocampal and cortical neurons in our lab. We show how to prepare a custom designed, 3-D printed plastic base that will hold the micro-drives. We demonstrate how to construct the individual micro-drives and how to assemble the complete micro-drive array. Further preparation of the drive array for surgical implantation, such as the fabrication of tetrodes, loading of tetrodes into the drive array and gold-plating, is covered in a subsequent video article.

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

In this protocol we demonstrate how to fabricate a micro-drive array for chronic electrophysiological recordings in rats.

Micro-drive Array para Crônica In vivo</emGravação>: Fabricação Unidade

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Montagem, de carga, e alinhamento de uma célula Analytical ultracentrífuga Amostra

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, retina-specific or conditional knockout mouse models often display early lethality or suffer from severe malformations, preventing an analysis beyond embryonic or early postnatal stages.
Primary cell culture is an alternative to investigate the effects of exogenously applied recombinant factors, overexpression of genes or siRNA-mediated gene knockdown in a controlled environment. Dissociated cell culture has the advantage that the endogenous signals reaching the target cells are reduced, thereby facilitating the identification of exogenously triggered effects after pharmacological manipulation. However, important cell-cell interactions are initially destroyed by enzymatic digestion or mechanical dissociation, even if re-aggregated retinospheroid cultures1 are used.
By contrast, organotypic retinal wholemount cultures provide a system close to the physiological in vivo situation with neuronal interactions and connections still preserved2-5.
In this video article we provide a step by step demonstration of (1) the establishment of in vivo-like organotypic retinal wholemount cultures including dissection peculiarities of embryonic, postnatal and adult murine eyes and (2) a dissociation and cytospin procedure for analysis of neuronal apoptosis and retinal cell proliferation in organotypic wholemounts, e.g. after culture in the presence of exogenously applied recombinant factors.

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

This video article demonstrates the establishment of organotypic retinal wholemount cultures and a cytospin procedure for analysis of exogenously induced effects. Organotypic retinal wholemount cultures mimic the in vivo situation and significantly facilitate the accessibility of murine retinas for experimental manipulations while circumventing the disadvantages of classical murine animal models.

In vivo como Cultura Wholemount organotípicas murino da retina

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Matriz Hibridização Genômica Comparativa (Array CGH) para a detecção de Genomic copiar o número de variantes

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Medindo danos DNA e reparar no mouse Esplenócitos Depois crônica<em&gt; In Vivo</em&gt; A exposição a doses muito baixas de beta e gama-radiação

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

Micro-drive Array para Crônica In vivo: Assembléia Tetrodo