המחברים מודים כריס Chartrand, HT (ASCP) עבור הוכחת את סעיף החנית של לחסום את התא עם הסמן AV.

מבוא: זהו וידאו המתאר שיטה של ​​Shidham להכנת תא לחסום מנוזל הדגימה מבוסס (LBC) ציטולוגיה באמצעות HistoGelTM (Thermo Scientific) (ג&#39;). בהשוואה לגישות אחרות אקראי, להלן שתי תכונות קריטיות של פרוטוקול זה להכנת קוביות התא דגימות hypocellular יחסית רופף עם תאים מפוזרים ביחידות (1-5). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול זה כולל צעדים כדי לרכז את התאים במישור המקביל לפני החנית של לחסום את התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה כולל גם הכללת מגדלור כמו האפל של AV-הסמן (איור 1b), אשר משרתת שתי המטרות הבאות: <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את הרמה שבה התאים מרוכזים. שטח לחסום את התא עם התאים של עניין עכשיו יכול להיות דמיינו ידי histotechnologist כאשר המשואה כהה נחשף במהלך החיתוך. זו היכולת לפקח שימנע אחד מן חיתוך דרך ברמה עם רוב התאים, או לא גזירה שטחית מדי את רמת עם הריכוז הגבוה ביותר של תאים המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמש כנקודת התייחסות לאיתור בסעיף לחסום סדרתי תא בשקופיות שונים. זו נקודת ייחוס מעשים כמו מגדלור כדי לאתר תאים מסוימים או קבוצות של תאים להערכת דפוס immunoreactivity לתאם עם הגישה SCIP (6,7). </li></ol></li></ol> Protocol (איור 2) הכנת המדגם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הדגימה שיורית LBC צוואר הרחם ציטולוגיה אל צינור זכוכית שטוחה בתחתית (בקוטר 15mm x 45mm) (איור 2.1 עד 2.4). מניחים את שפופרת זכוכית לתוך צינור פלסטיק גדול המוביל (28 x 85mm) ו צנטריפוגות. הסר את הצינור התחתון זכוכית מהצינור המוביל ויוצקים את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור הזכוכית הוא הכתיר אז (כדי למנוע דליפה של מים לחימום בשלב הבא) והניח פנימה הספק גדול יותר שטוח הצינור התחתון מפלסטיק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסטיק המוביל צינור המכיל את שפופרת זכוכית הוא הכתיר אז, להציב צנטריפוגה (מסתובב עם כוסות ולא כוסות זווית קבועה כך התאים ליפול בניצב לתחתית שטוחה של צינור זכוכית), וסובב ב 1805 G (3000 rpms, רדיוס-17cm הרוטור) במשך חמש דקות (איור 2.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות יוסרו אז אנכית צנטריפוגה ואת שפופרת זכוכית קטנה יוסר עם מלקחיים של צינור פלסטיק גדול המוביל מבלי להפריע גלולה משקעים עם תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שפופרת זכוכית עם הדגימה הוא הסיר את המיכסה ואת supernatant היא ניגרה נזהרת שלא להפריע שכבה שטוחה של תאים משקעים בתחתית (איור 2.6). </li></ol> הכללה של לתאם התייחסות AV-סמן והוספת ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגדלור כהה AV-הסמן (כ 2 מ&quot;מ x 2 גודל מ&quot;מ, על פני השטח שטוח, שבר של חומר אפל, בצבע sectionable) (איור 3) מתווסף כמו תמרור על צינור זכוכית (איור 2.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנזל aliquot של HG על ידי המסת אותו במיקרוגל למשך 10 שניות בהספק בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל של HG מותכת לערבב את הצינור, עם המשקע במהירות, לסכם אותו (איור 2.8) (המשך לשלב הבא מהר מבלי לאפשר HG להתחיל לחיזוק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף על 2.5 מ&quot;ל של חמה (45 ° C) מים בצינור פלסטיק המוביל (איור 2.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שפופרת זכוכית קטנה כתרים ממוקם בתוך צינור פלסטיק עם מים חמים. (שלב זה הוא הכרחי כדי לשמור על HG מן לחיזוק במהלך הצעדים הבאים) (איור 2.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור הפלסטיק המוביל ממוקם בצנטריפוגה (עם כוסות מסתובב ולא כוסות זווית קבועה כך התאים ליפול בניצב לתחתית שטוחה של צינור זכוכית), וסובב ב 1805 G (3000 rpms, רדיוס-17cm הרוטור) במשך חמש דקות. מטרת צעד זה צנטריפוגה היא לדחוף את הסמן AV-ולרכז את התאים בשכבה קרוב לפני השטח חיתוך של בלוק התא הסופי מוטבע פרפין (איור 1d). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות יוסרו ואז בעדינות אנכית בצנטריפוגה נזהרת שלא להפריע שכבה דקה משקעים עם תאים מדגם בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור פלסטיק גדול הוא הסיר את המיכסה ואת שפופרת זכוכית קטנה מוסר אנכית מבלי להפריע את שכבת משקעים של תאים הדגימה על ידי מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שפופרת זכוכית קטנה בקירור במצב אנכי למשך 15 דקות להתקרר לחזק את HG (איור 2.11). </li></ol> הסרת לחסום את התא כלחצן של ג&#39;ל עם הדגימה לעיבוד הסופי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדיסק HG הקרושה, עם שכבה של הדגימה מרוכז / משקעים בתחתית הוא סולק מן הצינור התחתון שטוח זכוכית על ידי התזת 10% פורמלין באמצעות מחט מד 23 עם מזרק (איור 2.12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המחט מוחדרת בצד של הצינור בשולי הדיסק HG הקרושה עם הדגימה (איור 2.12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Needlדואר הוא הסתובב לצד של הצינור תוך פורמלין הוא דחף לאט דרך המזרק. התוצאה היא הפרדה של הלחצן HG יחד עם משואה כהה AV-סמן את הדגימה מרוכז בו מלמטה השטוח של צינור זכוכית (איור 2.12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גוש תאים (כפתור ג&#39;ל עם תאים הדגימה) ממוקם אז קלטת שכותרתו הגיש עבור עיבוד רקמות להכין מוטבע פרפין תא אבני (איור 2.13). </li></ol> הטבעה חיתוך של הדגימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדיסק מוטבע פרפין עם הצד האפל סמן המשואה למטה כמו משטח חיתוך (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבלוק מחולק עד הסמן-AV בצבע כהה כמו מגדלור הוא חשוף לעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה עד ארבעה מקטעים מיקרון נחתכים מרמה זו אשר צריכה להכיל רוב של תאים מפוזרים ביחידות מן הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפים נאספים בשקופית זכוכית מכתים נוספת, מכתים immunohistochemical, או בדיקות אחרות כפי שצוין. הפרוטוקולים של בדיקות אלה לרבות סוג של שקופיות לשימוש הגובר בסעיפים עשוי להשתנות. בדרך כלל עבור immunostaining, מגלשות מצופה משמשים כדי למנוע הצפה ואובדן חלקים מן השקופיות במהלך השלבים immunostaining. </li></ol> קיצורים המשמשים (לפי סדר אלפביתי): CISH, chromogenic ב-situ הכלאה בדיקות, דגים, פלורסנט ב-situ הכלאה בדיקות; FFPE, פורמלין, קבוע פרפין, מוטבע, FNA, השאיפה מחט דקה, HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, ציטולוגיה המבוססת נוזלי; PCR תגובת שרשרת פולימרז; <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig1.jpg" alt="דמות 1" /> באיור 1. מבנה התא לחסום שהוכן על ידי פרוטוקול של Shidham. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig2.jpg" alt="דמות 2" /> איור 2. סיכום של צעדים שונים להכנת לחסום התא הדגימה LBC על ידי פרוטוקול של Shidham. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig3.jpg" alt="דמות 3" /> איור 3. הכנת סמן-AV מן קליפות בננה. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig4.jpg" alt="דמות 4" /> איור 4. השוואה של בלוקים של תאים חלקים עם או בלי AV-הסמן. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig5.jpg" alt="דמות 5" /> איור 5. השוואה בין תאיות סעיפים של גוש תאים עם ובלי סמן-AV.

<ol>
	<li>Shidham, V. B., Epple, J., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14,+Appendix+I:+Collection+and+processing+of+effusion+fluids+for+cytopathologic+evaluation.">Chapter 14, Appendix I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , .</li><li>Varsegi, G., D'Amore, K., Shidham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p16INK4a+Immunocytochemistry+as+an+Adjunct+to+Cervical+Cytology+-+Potential+Reflex+Testing+on+Specially+Prepared+Cellblocks+from+Residual+Liquid+Based+Cytology+(LBC)+Specimens.">p16INK4a Immunocytochemistry as an Adjunct to Cervical Cytology - Potential Reflex Testing on Specially Prepared Cellblocks from Residual Liquid Based Cytology (LBC) Specimens.</a> Modern Pathology 22: 98th Annual Meeting of United States and Canadian Academy of Pathology. , 97a-97a (2009).</li><li>Nigro, K., Tynski, Z., Wasman, J., Abdul-Karim, F., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell+block+preparation+methods+for+nongynecologic+ThinPrep+specimens.">Comparison of cell block preparation methods for nongynecologic ThinPrep specimens.</a> Diagn Cytopathol. 35, 640-643 (2007).</li><li>Saleh, H. A., Hammoud, J., Zakaria, R., Khan, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Thin-Prep+and+cell+block+preparation+for+the+evaluation+of+Thyroid+epithelial+lesions+on+fine+needle+aspiration+biopsy.">Comparison of Thin-Prep and cell block preparation for the evaluation of Thyroid epithelial lesions on fine needle aspiration biopsy.</a> CytoJournal. 5, 3-3 (2008).</li><li>Kyroudi, A., Paefthimiou, M., Symiakaki, H., Mentzelopoulou, P., Voulgaris, Z., Karakitsos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+diagnostic+accuracy+with+a+cell+block+preparation+from+thin-layer+endometrial+cytology:+a+feasibility+study.">Increasing diagnostic accuracy with a cell block preparation from thin-layer endometrial cytology: a feasibility study.</a> Acta Cytol. 50, 63-69 (2006).</li><li>Atkinson, B. F., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Immunocytochemistry+of+effusion+fluids:+introduction+to+SCIP+approach+(Chapter+5.">Chapter 5: Immunocytochemistry of effusion fluids: introduction to SCIP approach (Chapter 5.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li><li>Shidham, V. B., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+15,+Appendix+II:+Immunocytochemistry+of+effusions+processing+and+commonly+used+immunomarkers.">Chapter 15, Appendix II: Immunocytochemistry of effusions processing and commonly used immunomarkers.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li></ol>

בלוקים סלולריים הם כלי רב ערך לצורך הערכה של דגימות ציטולוגיה שונים (1). והכי חשוב, בנוסף את הפרטים האדריכליים של הדגימה, בלוקים תא לאפשר הערכה של מחקרים נלווים כגון immunocytochemistry, ניאון / chromogenic ב-situ הכלאה בדיקות (דגים / CISH) ו-situ PCR. מגוון שיטות להכנת לחסום התא מתוארים. עם זאת, רוב אלה מתאימים לא גניקולוגיים דגימות ציטולוגיה אשר מכילים תאים רבים יחסית עם microfragments רקמות כגון FNA aspirates וכמה נוזלים כגון השתפכויות הצפק (1,3,4,5). מכיוון רחובות התא בעיקר לספק הזדמנות להערכה immunocytochemical, עיבוד שלהם רצוי להיות דומה לזה של פורמלין-קבוע פרפין, מוטבע (FFPE) ברקמות. בסופו של דבר התוצאות שהתקבלו לאחר הערכה immunocytochemical סעיפים לחסום סלולריים הם בהשוואה לאלו עם שפורסמו בספרות המדעית ובהם מבוצע בעיקר על קטעי רקמה FFPE. כל השינויים בפרוטוקול פוטנציאל פשרה לבטל את תוקפו של התוצאות שהושגו על בלוקים תא מעובד באמצעות fixatives שונים רצפים מגיב אחרת מזו המשמש FFPE שגרתית. כמה טכניקות מסחרי יכול להיות החיסרון של עיבוד באמצעות פרוטוקול החשיפה חשיפה מקבע, מגיב אחרת. שיטות שונות של הכנה לחסום תא זמינים עבור דגימות עם כמות משמעותית של משקעים ושברי רקמות. בעיקר, במשקעים מרוכז נתמכים על ידי ג&#39;ל חלק או עקרון קרישה. כפתור תמרון מוטבע אז לאחר עיבוד כמו דגימות לפתולוגיה / ביופסיה כירורגית פרפין. ג&#39;ל המשמש כוללים אגר ג&#39;לטין, פיברינוגן / פלזמה תרומבין, וג&#39;ל מסחריים אחרים כגון HG. שיטות ריכוז להשתנות pelleting פשוט המשקע על ידי צנטריפוגה ריכוז של תאים לאורך סוגים שונים של ממברנות. דוגמאות כוללות: Milipore, collodin (Celloidin) שקיות או מגרדים את התאים מן מריחות ציטולוגיה בשקופיות זכוכית (1). החוקרים העריכו גם מגוון רחב של ג&#39;לים ידי מנסה שילובים שונים של אגר ואת הג&#39;לטין. אף אחד השילובים להשיג את העקביות חברה מספיק כדי להשיג יכולת תמרון בקלות דיסק של ג&#39;ל הקרושה עם תאים מוטבע מן הדגימה בחתיכה אחת. HG הראו עקביות המתאים בחוויה שלנו את התוצאות immunostaining על לחסום חלקים HG התא היה מעולה. נוזלי מבוסס ציטולוגיה (LBC) דגימות עבור ציטולוגיה cervicovaginal הסלולר הם בדרך כלל פחות מאשר הלא גניקולוגיים דגימות כאמור לעיל. בנוסף, LBC דגימות גניקולוגיים בעיקר מכילים תאים בודדים פזורים שטחי מודבק מתוך רירית cervicovaginal. בגלל זה, תאיות המתאים בתוך התא לחסום חלקים לא ניתן להשיג ללא גישה מיוחדת. כמו אלה הפזורים ביחידות רכיבים סלולריים בבלוק לא ניתן לראות על ידי histotechnologist במהלך חיתוך קטע, ברמה שבה התאים יתחילו להופיע בחלקים לא יכול להיות מוערך ועלול לפספס, או על ידי חיתוך בעבר ברמה עם רוב התאים או לא חיתוך עמוק מספיק לתוך הרמה עם הריכוז הגבוה ביותר של תאים מדגם (איור 4). פרוטוקול של Shidham כתובות שתי בעיות אלה באמצעות HG כמו הטבעה ציוד מעבדה בינוני קונבנציונאלי (2) (איור 2). פרוטוקול זה כרוך הבאים שתי תכונות עיקריות (איור 1): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריכוז מערך של תאים מפוזרים ביחידות במטוס צר סמוך ובמקביל משטח חיתוך של גוש תא (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכללה של סמן-AV מגדלור כמו כהה כמו תמרור. זה קריטי להשגת התכונות הבאות: <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי וניטור הרמה שבה התאים מרוכזים לחסום את התא. חשיפת שלט בצבע כהה מדגיש את הרמה שבה רוב התאים מפוזרים ביחידות בבלוק תא צפויים להיות ממוקם (איור 4). הדבר מונע overcutting (חיתוך בעבר ברמה עם רוב התאים) או undercutting (לא לחתוך עמוק מספיק לתוך הרמה עם הריכוז הגבוה ביותר של תאים לדוגמה) כדי לחסום את התא ולאפשר מבחר קטעים מן הרמה הממוצעת של לחסום את התא המתאים עם הריכוז הגבוה ביותר של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמרור כהה בחלקים משמש גם כנקודת התייחסות לסקר ולזהות בדיוק את אותם תאים בחלקים שונים של סידורי לחסום את התא על שקופיות שונות (איור 4). זה קריטי תוך פרשנות והערכה של מאפייני לתאם immunoprofile כזה של תאים מסוימים על ידי הגישה SCIP לעקוב אחר תאים אותו בחלקים שונים (6,7). </li></ol></li></ol> למרות our הוא פרוטוקול סטנדרטי דיווח על בסיס דגימות נוזל ציטולוגיה צוואר הרחם, הוא גם יכול לשמש כדי לשפר את התשואה של אבחון רבים שאינם גניקולוגיים דגימות אחרות כגון נוזלים תפליט, FNA, כמברשות, תוכן הציסטה וכו &#39;בנוסף את הסמן AV יקל משופרת היישום של הגישה SCIP במהלך הערכה immunohistochemical סעיפים בלוק של דגימות תאים אלה. המדיום הטבעה עשוי להיות מוחלף על ידי חומרים כימיים אחרים עם שינויים מתאימים בכל הצעדים הרלוונטיים. HG עשוי להיות מוחלף על ידי פלזמה (פיברינוגן) להיות בג&#39;ל על ידי טרומבין בטמפרטורת החדר (1).

cell block preparation from cytology specimen with predominance of individually scattered cells

וידאו זה מדגים שיטה של ​​Shidham להכנת קוביות התא מבוסס דגימות נוזל המכיל תאים ציטולוגיה cervicovaginal מפוזרים באופן פרטני ובקבוצות תאים קטנים. טכניקה זו משתמשת HistoGel (Thermo Scientific) עם ציוד מעבדה קונבנציונאלי. השימוש בסעיפים לחסום התא הוא כלי עזר רב ערך לצורך הערכה של אי - גניקולוגיים ציטולוגיה. הם מאפשרים cytopathologist ללמוד הדגימה נוספים פרט מורפולוגיים כולל הארכיטקטורה של הנגע. והכי חשוב, הם מאפשרים הערכה של מחקרים נלווים כגון immunocytochemistry, ב-situ הכלאה בדיקות (דגים / CISH) ו-situ שרשרת פולימראז התגובה (PCR). מסורתית לחסום תא טכניקות הכנה יש בעיקר הוחל הלא גניקולוגיים דגימות ציטולוגיה, בדרך כלל נוזל השתפכויות הגוף בסדר השאיפה ביופסיות מחט. דגימות נוזל cervicovaginal מבוססות יחסית הסלולר פחות מאשר עמיתיהם הלא גניקולוגיים שלהם עם הרבה תאים מפוזרים בודדים. בגלל זה, תאיות הולם בתוך התא לחסום חלקים קשה להשיג. בנוסף, histotechnologist חתך את גוש לא יכול לדמיין את הרמה שבה התאים הם בריכוז הגבוה ביותר. לכן, קשה לפקח על רמת המתאים שבו ניתן לזהות קטעים נבחרים שיועברו השקופיות זכוכית לבדיקה. כתוצאה מכך, באזור גוש תא עם התאים של עניין עלול לפספס, או על ידי חיתוך בעבר או לא לחתוך עמוק מספיק. פרוטוקול נוכחי השיטה של ​​Shidham כתובות בנושאים אלה. אף על פי פרוטוקול זה טופל ודווח על גניקולוגיים דגימות נוזלי המבוסס ציטולוגיה, זה יכול להיות מיושם גם לא גניקולוגיים דגימות כגון נוזלים תפליט, FNA, כמברשות, תוכן וכו &#39;ציסטה עבור שיפור איכות החומר אבחון בסעיפים לחסום התא.

Watch this Scientific Journal Video about Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells at JoVE.com

Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Shidham של שיטה להכנת קוביות תא עם סמן-AV מתוך דגימות ציטולוגיה המכיל תאים מפוזרים באופן פרטני ובקבוצות תאים קטנים.

בלוק תא הכנה מן הדגימה ציטולוגיה עם דומיננטיות של תאים פזורים בנפרד

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually ...

cell-block-preparation-from-cytology-specimen-with-predominance

Research

JoVE Journal

Biology

73.2K Views.  University of Wisconsin - Milwaukee. Shidham של שיטה להכנת קוביות תא עם סמן-AV מתוך דגימות ציטולוגיה המכיל תאים מפוזרים באופן פרטני ובקבוצות תאים קטנים.

Video: Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  approximately one (to two) million irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells is rinsed with HuES media to remove residual serum and cell debris, and then HuES media added and left to equilibrate in the cell culture incubator.  A frozen vial of cells from long term liquid nitrogen storage or a -80C freezer is sourced and quickly submerged in a 37C water bath for quick thawing.  Cells in freezing media are then removed from the vial and placed in a large volume of HuES media.  The large volume of HuES media facilitates removal of excess serum and DMSO, which can cause HuES human embryonic stem cells to differentiate.  Cells are gently spun out of suspension, and then re-suspended in a small volume of fresh HuES media that is then used to seed the MEF plate.  It is considered important to seed the MEF plate by gently adding the HuES cells in a drop wise fashion to evenly disperse them throughout the plate.  The newly established HuES culture plate is returned to the incubator for 48 hrs before media is replaced, then is fed every 24 hours thereafter.

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.

ES תאים אנושיים: תרבות החל מ תאים קפואים

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

הכנת תא בודד השעיות מן הטחול עכבר עם Dissociator gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

הכנת תסיסנית תאים S2 עבור במיקרוסקופ אור

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Inositol pyrophosphates play an important role in human pathologies such cancer, diabetes and obesity; however, the exact mechanism of action is a matter of dispute. The lack of commercially available inositol pyrophosphates renders detailed studies problematic. Here we describe a simple protocol to produce and isolate milligrams of inositol pyrophosphates.

הכנת Pyrophosphates אינוסיטול איכות

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

הכנת כרומוזום מתאים בתרבית

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

הכנת תא / תרבויות והיצמדות למנגנון הראשי myogenic מבשר משושלות חוליות בסל

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Cryo-אלקטרון מתכוון בהכנה מיקרוסקופית דגימה של אלומת יונים ממוקדת

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...