המחברים להכיר את הסיוע הטכני של אביגיל האריס. הם גם מכירים כהן פאולה, קים הולוויי שעזרת כדי למטב את הפרוטוקול של הכנת השטח-התפשטות גרעינים של העכבר spermatocytes. המחברים גם מעריך קריאה ביקורתית של כתב היד על-ידי קארן שינדלר.
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 GM106262 כדי K.M.B.

כל השיטות מעורבים עכברים מנוצל אתיות גבוהה וסטנדרטים רווחה, אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת דרקסל.
1. הכנה של פתרונות וכלים הדרושים
<ol><li>להכין היפוטוניק החילוץ מאגר לייצוגית ב 50 מ של מים כיתה מעבדה הנדסה גנטית, pH 8.2-8.4 (טבלה 1). להפוך את הפתרון טרי כל הזמן, לשמור על הקרח, והשתמש בתוך 2 h הכנת כפולות; הדבר נחוץ למטב את הפחתת ואת פרוטאז עיכוב פעילות של DTT ושל PMSF, בהתאמה. השתמש 10 מ"ל של מצגת עבור כל זוג של העכבר האשכים.</li>
	<li>להכין פתרון סוכרוז 100 מ מ (טריים בכל פעם) על-ידי הוספת 0.342 גר' סוכרוז 10 מ"ל של הנדסה גנטית מעבדה כיתה מים. להתאים את ה-pH ל 8.2</li>
	<li>להכין פתרון מקבע (1% paraformaldehyde (PFA), 0.15% טריטון X-100, pH להתאים ל- 9.2 עם 1 N HCl או 1 N NaOH) חודשי טריים ומאגר זה בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. לדלל 16% זמינים מסחרית PFA המוצא מניה עד 4% ב- PBS 1 X לשימוש כמו מניה עבודה ולאחר מכן לאחסן 4% aliquots ב-20 ° C.<ol>
<li>כדי להכין את הפתרון מקבע, להוסיף 10 מ של פתרון PFA 4% ו- 600 µL של 10% טריטון X-100 30 מ של 1 X PBS, מערבבים היטב, ולהתאים את רמת ה-pH ל 9.2 עם 1 N HCl או 1 N NaOH. אחסן את הפתרון מקבע צינור חרוטי 50-mL עטוף בנייר אלומיניום בטמפרטורת החדר (עבור לא יותר מ 4 שבועות).</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין פתרונות כביסה (בעוד שקופיות מתייבשים על 30 דקות האחרונות) עם תמונה-פלו 200: 0.4% צילום-פלו 200/PBS (320 µL של צילום-פלו 200 ב- 80 מ של 1 X PBS) ו- 0.4%, פלו צילום 200/dH2O (160 µL של צילום-פלו 200 ב 40 מיליליטר מים כיתה מעבדה הנדסה גנטית). השתמש צנצנת Coplin 50 מ ל מלא עם 40 מ"ל של פתרונות כדי לשטוף את שקופית 10 או פחות בכל פעם.</li>
	<li>הכנת הכלים הבאים: 1. זוג מספריים כירורגיים (כדי פצעים וחתכים בעור), 1 זוג עצה בסדר מספריים כירורגיים (כדי פצעים וחתכים של הצפק), 2 זוגות של קצה ישר בסדר מלקחיים (לנתח את כל testis), 1 שוליים ישרים גילוח (כדי פצעים וחתכים כל testis), 2 זוגות של מעוקלים עצה מלקחיים (כדי לשתק כל testis) לסחוט בקוריאנית וכמה, צנצנות Coplin 50 מ ל, טפלון מודפס 3 מגלשות טבעת, האיזמל 1 עם להב מידה 11, תא humidified, צלחות פטרי 100 x 15 מ מ, סמן קבוע בסדר עצה או עיפרון, ו- a שאכר מסתובב פלטפורמה.<ol>
<li>המקום פרימיום לא טעונים precleaned שקופיות זכוכית חלבית סוף זקוף בתוך צנצנת Coplin 50 מ ל מלא עם מקבע פתרון עד השימוש. הערה: עיפרון היא עדיפה אם השקופיות ישמש לאחר מכן בהליכים הדורשים אתנול, כגון קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. spermatocyte גרעינים מתפשטת
<ol><li>המתת חסד עכבר זכר בהתאם להנחיות מוסדיים (למשל צוואר הרחם פריקה עם או בלי חנק2 CO).</li>
	<li>שימוש P10 - P20 הזכרים כדי להעריך את התאים meiotic הגל הראשון של יצירת זרע; אנו משתמשים באופן שגרתי P15 - זכרים P17 להשיג תאים של כל substages של prophase ט האשכים למבוגרים תספק תאים מחלון prophase אני יותר מדי, אבל הם גם תניב תאים postmeiotic יותר, כמו spermatids.</li>
	<li>הקציר ולשקול את האשכים (להקליט את המשקולות מזווג); ואז למקם אותם לתוך צלחת פטרי המכילות מספר טיפות של מצגת קר כדי לשמור על לחות.</li>
	<li>להחזיק בזרמה בתחתית קערה עם קצה מעוגל מלקחיים ולהשתמש תער שוליים ישרים לעשות חתך קטן קו האמצע האנכי באמצעות הקפסולה של בזרמה. בעודו מחזיק בזרמה בתחתית קערה עם מלקחיים אחד, השתמש קבוצה שנייה של קצה מעוגל מלקחיים או שוליים ישרים גילוח לסחוט בעדינות את בקוריאנית וכמה מן בזרמה.<ol>
<li>מקם את בקוריאנית לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מצגת קר, מקפיד להימנע לשים את החלקים של הקפסולה לתוך הצינור. חזור על שלבים אלה עם בזרמה השני.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה בקוריאנית וכמה את decapsulated בצינור חרוט המכילים מצגת על קרח למשך 30-60 דקות, בהתאם לגודל של האשכים. דגירה בקוריאנית וכמה מכל זוג של האשכים במשקל של 30 מ"ג או פחות במשך 30 דקות, בקוריאנית מזוג האשכים במשקל 31-50 מ"ג במשך 30-45 דקות, ועל האשכים גדולים יותר עבור 60 דקות. לא תשנה את זמני עבור מבחן יחיד. הערה: זמן הדגירה אופטימלית עשוי להשתנות בהתאם החוויה של הנסיין, ריאגנטים המשמש העכברים שעוברים ניתוח.</li>
	<li>בעוד בקוריאנית וכמה הם המקננת במצגת, השתמש הסמן או עיפרון לתייג את הקצוות עמומה של שקופיות precleaned עם העכבר מספר, מספר שקופית ותאריך. ואז למקם את השקופיות מראש נקי בתוך צנצנת Coplin המכיל את הפתרון מקבע.</li>
	<li>בעקבות דגירה, שופכים בקוריאנית, מצגת לתוך צלחת פטרי נקי, בקוריאנית נפרד לתוך כ 3 מ מ קוטר גושים. כל סבך מניב 2 מגלשות, מספר השקופיות הניב תלוי בגודל של האשכים. הערה: אנו משיגים 8 שקופיות של פראי סוג ושקופיות 6 מ- subfertile Chtf18-null P16 האשכים (שהם קטנים יותר עקב ירידה מספרים של תאי נבט meiotic ו mitotic8). Testis מבוגר אחד במשקל של 100 מ ג או יותר יהיה צפוי להניב שקופיות 16.</li>
	<li>23 מקום µL של 100 מ מ פתרון סוכרוז לתוך טבעת אחת ציפוי טפלון מודפס, 3 טבעת שקופיות ולהוסיף אחד קווצת בקוריאנית וכמה הטבעת.  ולאחר מכן שימוש מעוקל עצה מלקחיים להחזיק את סבך, מינצ בעדינות את בקוריאנית עם תער 11 גודל עד הפתרון הופך מעוננים. הערה: לא overmince כמו התוצאה תהיה כרומוזומים מפוצלים. שימו לב כי הכרומוזומים מפוצלים יכול להיות גם מעידה על הפנוטיפ המוטנטי.</li>
	<li>הסרת לכלוך, להוסיף עוד 23 µL של סוכרוז פתרון ולהשתמש micropipette כדי בעדינות pipette את התערובת למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לסייע להפריד את התאים ההשעיה.</li>
	<li>הסר שקופית תטבול את הצנצנת Coplin המכילה מקבע פתרון, להטות את השקופית מעל הצנצנת אז זה droplet נדיב אחד אוסף בפינה התחתונה של השקופית.<ol>
<li>Pipet 20 µL של סוכרוז השעיה תא מטבעת של השקופית המודפסת טבעת 3 טפלון לתוך ה-droplet מקבע על פרמיה מזוגג שקופיות זכוכית, pipet המתלים לאורך 2 - 3 פעמים. הערה: ה-droplet מקבע צריך להיות גדול מספיק באמצעי אחסון כך תוספת של 20 μL של התליה תא סוכרוז אליו מאפשרת כיסוי על פני השקופית כולה כאשר התערובת היא התפשטה (ראה 2.11 להלן).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאט לאט להטות את השקופית לצד מול ה-droplet כדי להפיץ את התליה תא לאורכו של השקופית. ואז לאט לאט להטות את השקופית בחזרה כדי להפיץ את התליה תא לרוחב השקופית כדי לכסות את זה לחלוטין. הימנע שמתפשטת ההשעיה באותו האזור של השקופית יותר מאשר פעם אחת אחרת שהתאים יחפוף אחד עם השני.</li>
	<li>מיד למקם שקופית שטוח בתוך תא humidified, חזור על השלבים 2.8 ל 2.11 עד כל גושים של בקוריאנית וכמה שימשו כדי להפוך את שקופיות. חשוב לא להעביר תא humidified במהלך תהליך הייבוש כדי למנוע קורע חופפים תאים.</li>
	<li>לאפשר שהשקופיות דגירה בתוך תא humidified מכוסה בטמפרטורת החדר במשך 2.5 h כך הם יבש לאט, לא לגמרי. לחות גבוהה, ייבוש איטי בשלב זה הם חשובים להבטיח הפצה נאותה של כרומטין. לאחר מכן להסיר את הכיסוי של התא, לאפשר את השקופיות מילה נהדרת לחלוטין מינימום 30 נוספים.</li>
	<li>מקום שקופיות (גב אל גב או בתבנית זיגזג) בתוך צנצנת Coplin המכיל פתרון צילום-פלו 200/1 X PBS 0.4% לשטוף את השקופיות פעמיים, 5 דקות כל אחד, על-ידי בעדינות לזעזע את Coplin ג'אר על פלטפורמה מסתובבת שאכר. להשתמש בפתרון טריים עבור כל כביסה, למנוע שקופיות שונים עכברים בצנצנות נפרדות עבור כל אחד שוטף.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות בצנצנת Coplin המכיל 200/dH2O 0.4% צילום-פלו לפתרון 5 דקות פעם תוך כדי לזעזע.</li>
	<li>הסר שקופיות מחלוקה Coplin ג'אר (שטיפה אחרונה), בזהירות לנגב את הקצוות ואת תחתית של השקופיות כדי להסיר עודפי נוזלים, ולמקם שקופיות במיקום זווית, כמעט זקוף יבש. נסיינית אשר בקיא בכל טכניקה זו ניתן לעבד ולהכין השטח-התפשטות גרעינים של 4 או 5 עכברים ביום אחד.</li>
	<li>פעם יבש (15-20 דקות), לעבד שקופיות מיד immunofluorescence מכתים או חנות ב-80 מעלות צלזיוס בתוך קופסת השקופיות סגורים היטב מוגן מפני אור לכל היותר 3 שבועות (בהתאם החלבונים היעד חישובו; תוצאות אופטימליות ניתן להשיג אם מוכתם באותו יום או תוך שבועיים).<ol>
<li>אם מאוחסן ב- 80 ° C, ואז אפשר שקופיות לבוא לטמפרטורת החדר, לשטוף בצנצנת Coplin המכיל 1 X PBS או בלוק במשך 5 דקות לפני צביעת. הערה: פרוטוקולים רבים מוכתמים immunofluorescence שונים תספק תוצאות טובות; מתייחסים אל ברקוביץ ואח עבור פרוטוקול immunostaining8.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Counce, S. J., Meyer, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+synaptonemal+complex+and+the+kinetochore+in+Locusta+spermatocytes+studied+by+whole+mount+electron+microscopy.">Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy.</a> Chromosoma. 44, 231-253 (1973).</li><li>Speed, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+the+foetal+mouse+ovary.+I.+An+analysis+at+the+light+microscope+level+using+surface-spreading.">Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading.</a> Chromosoma. 85, 427-437 (1982).</li><li>Ashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+Rad51+distribution+on+chromatin+during+meiosis+in+male+and+female+vertebrates.">Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates.</a> Chromosoma. 104, 19-28 (1995).</li><li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mouse+mLh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over.">Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13, 336-342 (1996).</li><li>Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+association+of+Rad51+protein+with+selected+sites+in+meiotic+chromatin.">Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).</li><li>Berkowitz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CHTF18+causes+defective+meiotic+recombination+in+male+mice.">Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice.</a> PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).</li><li>Gomez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sororin+loads+to+the+synaptonemal+complex+central+region+independently+of+meiotic+cohesin+complexes.">Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes.</a> EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).</li><li>Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+cohesins+in+mitosis,+meiosis,+and+human+health+and+disease.">The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease.</a> Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).</li><li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+in+gametogenesis.">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li><li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+elaboration:+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics.">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).</li><li>Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+CNTD1+is+critical+for+meiotic+crossover+maturation+and+deselection+of+excess+precrossover+sites.">Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites.</a> J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).</li><li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis.">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Dev Biol. 169, 557-567 (1995).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כדי לקבל מספר גבוה של איכות להפיץ. ובכן, טוב spermatocyte גרעינים, השלבים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה לכלול זמן הדגירה המתאים של בקוריאנית וכמה מצגת, המתאימה הא של וכמה בקוריאנית, והעסיק הטכניקה כדי התפזר התליה תא סוכרוז השקופיות מצופה מקבע. אנחנו דגירה בקוריאנית וכמה מן האשכים של הזכרים פראי ?...

עכברים הם בשימוש נרחב כאורגניזם מודל ללמוד מיוזה ביונקים. ניתן להעריך תהליכים התפתחותיים רגילים והן פגמים להתרחש במהלך המיוזה. ניתן לאפיין את ציר הזמן ואת ההתקדמות של תכונות בולטות להתרחש במהלך prophase ו- substages, כמו גם שפע של חלבונים ספציפיים המעורבים בתהליכים מכריע רגולציה של מיוזה פראי סוג ועכברים מוטנטים. מספר תהליכים מיוחדים המתרחשים במהלך המיוזה שניתן יהיה ללמוד בפירוט (נבדקה הנדל ו Schimenti1). אלה כוללות מערך כפול-strand break (DSB) ה-DNA ותיקון, רקומבינציה, היווצרות קומפלקס synaptonemal, ו כרומוזום סגרגציה.
היבט חשוב של הלומדים תהליכים meiotic הוא היכולת לבחון גרעינים המכילים כרומוזום הומולוגי הנפתרות חזותי, שטיחות טוב יותר להבחין ולזהות את substages של prophase אני Prophase אני מורכבת 5 substages זה מאופיינים בתכונות ספציפיות, כולל הקמת המתחם synaptonemal (SC). SC הוא חלבון ה-tripartite לגרדום המאפשר שיוך ו DNA כפול-strand break לתקן של homologs. במהלך leptonema, homologs ישר כפי צירית יסודות SC ברורים. אז מצורף של אלמנטים מרכזיים למתחם synaptonemal במהלך zygonema מקלה על שיוך ופיזית חיבור (synapsis) בין זוגות של homologs. במהלך pachynema, synapsis של homologs הופך מוחלט, הדי ג'יי ג'יי אברהמס נוצרות מתוך תיקון של אוכלוסיה בחירה של מעברי כפול-גדיל DNA באמצעות רקומבינציה הומולוגית. SC פירוק במהלך diplonema, ומאפשר homologs desynapse אבל יישארו מצורפים centromeres שלהם ועל אתרים של הדי ג'יי ג'יי אברהמס. בסופו של דבר במהלך diakinesis, homologs recondense ומתרחשת המעבר מפה של1.
מבחינה היסטורית, השמת השטח של כרומטין meiotic הניב כמה גרעינים, במיוחד אלה של שלבים המוקדמים של prophase אני2. כתוצאה מכך, שונו שיטות אלה כדי לשפר את ההפרדה של תאים ברקמות (קרי testis או שחלה), בטכניקה של כרומטין meiotic מתפשטת, את התשואה של גרעינים meiotic באיכות גבוהה עבור הערכה2,3, 4. בנוסף, שיטה זו הוכיחה להיות שימושי בשימור גרעינית, כרומטין כרוך חלבונים גרעינים meiotic כפי שמגלה immunolocalization שפורסמו טכניקות5,6,7. לכן, השיטה בתחילה מתוארת על ידי פיטרס2 והפגינו כאן תשואות הרבה גרעינים spermatocyte פרץ נפרד המכיל homologs שעברו את substages leptotene, zygotene, pachytene, diplotene ו diakinesis של prophase אני.
בטכניקה של הכנת השטח-התפשטות גרעינים (נקרא גם ניתוח התפשטות כרומטין) נעשה שימוש נרחב ללמוד מיוזה בתחומי ביולוגיה הרבייה של התא. שקופיות המכילה השטח-התפשטות הגרעינים ניתן לאחר מכן immunostained עם נוגדנים חלבונים עניין או נתון צביעת כסף, ולאחר מכן נותחו עם מיקרוסקופ. השיטה זו דומה עבור עכברים גם זכר וגם נקבה, למרות השינויים שתוארו עבור עכברים הנשי2. חשוב להימנע overmince וכמה בקוריאנית. הגרעינים חייב גם להיות להתפשט כך בעקבות immunostaining homologs, חלבונים הקשורים נראים בבירור עם מיקרוסקופ. השטח-התפשטות הגרעינים ניתן מוכן תוך שעות ספורות גם immunostained מיד או המאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס לכל היותר 3 שבועות לפני מפשיר ו- immunostaining. עם זאת, תוצאות אופטימליות מתקבלים בצורה הטובה ביותר עבור חלבונים מסוימים אם immunostaining מתבצע באופן מיידי או בתוך 2 שבועות של הכנת השטח-התפשטות גרעינים. שקופיות יכול להיות immunostained עם פרוטוקול תקני באמצעות נוגדנים חלבונים של עניין, ואחריו הדגירה עם חלבונים מצומדת כדי פלורסנט נוגדנים משניים או צבע, ולאחר מכן עם תמונה עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ8. ב 21-15 יום לאחר הלידה יש רקמות מספיקות לכל זוג של האשכים פראי סוג להניב שקופיות 6-10, עכברים בוגרים (כולל מבוגרים) תניב עוד שקופיות. עם זאת, פראי סוג עכברים 6 שבועות של גיל ומעלה גם תניב התאים יותר פוסט-meiotic (קרי spermatids) בשקופיות בעקבות immunostaining. בנוסף, כל substages של prophase אני יכול להיות שנצפו בעכברים לנוער ומבוגרים. האשכים מן הזכרים כמחנכת ימים 10 15 תניב הרבה יותר תאים leptotene ו- zygotene. עכברים שגילם יום כמחנכת 14 עד 15 תניב יותר גרעינים pachytene ו- diplotene.
כאן אנחנו מתארים ומדגימים שיטה בשימוש נרחב של הכנת השטח-התפשטות גרעינים של העכבר spermatocytes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>1464510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
			<td>Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon printed 3 ring slides</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63418-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium uncharged frosted end glass slides</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors (sharp and blunt tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip surgical scissors (sharp tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved medium tip forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16100110</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SYCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum)</td>
			<td>Antibodies Incorporated</td>
			<td>15-234-0001</td>
			<td>Use at 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscope with epifluorescence</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jars</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes

בתרבית של המיוזה היא תהליך התפתחותי דינמי כי מתרחשת בתאי הנבט, ניתן ללמוד מאופיין. באמצעות שיטה כדי להפיץ את הגרעינים על פני השטח של שקופיות (ולא לזרוק אותם מגובה), נדגים שיטת אופטימיזציה על העכבר spermatocytes אשר תוארה לראשונה בשנת 1997. בשיטה זו נעשה שימוש נרחב במעבדות ללמוד בתרבית של המיוזה כי זה מניב שפע של גרעינים איכותיים שעברו substages של prophase אני וכמה בקוריאנית ממוקמים תחילה בתמיסה היפוטוניק להתנפח spermatocytes. ואז spermatocytes משתחררים אל פתרון סוכרוז ליצירת השעיה תא, גרעינים פזורים על גבי מדרון זכוכית ספוג מקבע. בעקבות immunostaining, מגוון של חלבונים שהם נוגעים לתהליכים meiotic יכולים להיבדק. לדוגמה, חלבונים של המתחם synaptonemal, מבנה התלת-צדדי המחבר בין כרומוזום הצירים/הליבות של homologs יחד, ניתן בקלות לאבחן. רקומבינציה meiotic חלבונים, אשר מעורבים תיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA על ידי רקומבינציה הומולוגית, יכול להיות גם immunostained כדי להעריך את ההתקדמות של prophase אני. כאן אנחנו מתארים ומדגימים בפירוט טכניקה בשימוש נרחב ללמוד בתרבית של מיוזה ב spermatocytes של נער או מבוגר זכר עכברים.

היכולת של שיטה זו לספק מספר רב של השטח להפיץ גרעינים המכילים homologs שלם תלוי בשלושה גורמים עיקריים: 1) זמן הדגירה המתאים של בקוריאנית וכמה במאגר היפוטוניק (דהיינו האם) כדי להשיג שלמאחה מתנפח spermatocyte הגרעינים פרץ, אך לא מתפוררות מ ממושך דגירה של מצגת, 2) micropipetting טיפות סוכרוז של ?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes at JoVE.com

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

מיוזה הוא תהליך התפתחותי שבו נוצרות גמטות דרך סבב אחד של שכפול ה-DNA, שני סיבובים רצופים של כרומוזום סגרגציה. מיוזה יונקים יכולים להיבדק על ידי ניצול טכניקה כדי להכין ממרחים כרומוזום meiotic. . הנה, נדגים שיטה של הכנת השטח-התפשטות גרעינים של העכבר spermatocytes.

הכנה של כרומוזום Meiotic מתפשטת העכבר Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

preparation-of-meiotic-chromosome-spreads-from-mouse-spermatocytes

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

11.7K Views.  Drexel University College of Medicine. מיוזה הוא תהליך התפתחותי שבו נוצרות גמטות דרך סבב אחד של שכפול ה-DNA, שני סיבובים רצופים של כרומוזום סגרגציה. מיוזה יונקים יכולים להיבדק על ידי ניצול טכניקה כדי להכין ממרחים כרומוזום meiotic. . הנה, נדגים שיטה של הכנת השטח-התפשטות גרעינים של העכבר spermatocytes.

Video: Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

הכנת ניתק תרבויות עכבר קליפתיים Neuron

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

הכנת תא בודד השעיות מן הטחול עכבר עם Dissociator gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of dissociating whole organs requires specific parameters in order to obtain a high number of viable cells in a reproducible manner. The gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. The instrument contains pre-programmed settings that are optimized for the efficient but gentle dissociation of a variety of tissue types, including mouse lungs. In this publication the use of the gentleMACS Dissociator on lung tissue derived from mice is demonstrated.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue agitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on lung tissue is explained.

הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מתוך רקמת הריאה באמצעות עכבר Dissociator gentleMACS

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

הכנת מועכת תסיסנית Polytene כרומוזום עבור סימון נוגדן

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

הכנת כרומוזום מתאים בתרבית

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high quality plant chromosome spreads is challenging due to the rigid cell wall. One of the approved methods for the preparation of plant chromosomes is a so-called drop preparation, also known as drop-spreading or air-drying technique. Here, we present a protocol for the fast preparation of mitotic chromosome spreads suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes. This method is an improved variant of the air-dry drop method performed under a relative humidity of 50%-55%. This protocol comprises a reduced number of washing steps making its application easy, efficient and reproducible. Obvious benefits of this approach are well-spread, undamaged and numerous metaphase chromosomes serving as a perfect prerequisite for successful FISH analysis. Using this protocol we obtained high-quality chromosome spreads and reproducible FISH results for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum and Secale cereale.

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

כרומוזום מהיר האוויר יבש השמטת הכנת שיטה מתאימה לדגים בצמחים

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.