שיטות אלו פותחו על ידי צלופח במהלך חופשת מחקר במעבדה של JT תמיכה סופק על ידי אוניברסיטת DePaul המועצה למחקר NIH / NIDCR R01 להעניק JT (DE016678). אנו בתודה להכיר את המאמצים של האנטר קרוליין, טיפול בבעלי חיים טכנאי במתקן גרעין דג הזברה CMRC ופאולינה Pawluczuk, לבורנטית ראשון שלנו.

בעלי דג הזברה דג הזברה הם שוכנו וגודלו על פי שיטות סטנדרטיות 1. עבר תקופת הזחל מאוחר, בשלב ההתפתחותי של דג הזברה ניתן למדוד לפי אורך הסטנדרטי שלה (SL), או את המרחק במילימטרים קו ישר מנקודת anteriormost של השפה העליונה לבסיס של סנפיר הזנב (צלחת hypural posteriormost) 2. בשלב ההפריה כחודש פוסט (10-12 מ&quot;מ SL), את barbels האף לסתי מופיעים ניצנים אפיתל שקוף כמו ליד בורות חוש הריח ועל הפינות האחורי של maxillae, בהתאמה. כמו דג הזברה מתבגר, barbels להאריך לתוך צרה, זיף כמו הנספחים. מכיוון בינית לסתי גדול (2-3 מ&quot;מ), קל יותר לתמרן, פרוטוקול שלנו חלה רק על תוספת זו בפרט; בטכניקות דומות, לעומת זאת, יכול להיות מותאם קטן האף בינית. בינית Clipping <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את דג הזברה בשלב הבוגר הרצוי (למשל., 1.5-2.5 ס&quot;מ SL, ~ 3-6 חודשים לאחר ההפריה) על ידי טבילה% 0.015 MS-222 (אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate) שנאגרו עד 7.0 pH במים המערכת. שימו לב עד תנועות לשחות לעצור אוורור הזימים הופך איטי וקבוע. בהתאם לגודל הדגים, הרדמה מלאה לוקח כ 2-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת רשת דייגים אקווריום, להעביר דגים 1-3 בכל פעם כדי פיסת מגבת נייר מקופל של רטוב בצלחת פטרי. בעזרת מרית בוטה, לכוון את הדגים ולכן הם מקבילים לרוחב כל צד שמאל אחרים למעלה. חלק מקפלים מגבת נייר רטובה על החלק הזנב של הדג, מכסה את כל הגוף עד operculum (מכסה הזימים) כדי לשמור על עור לח זימים במהלך ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג את צלחת פטרי תחת stereomicroscope, באמצעות זווית נמוכה לאור התקרית כדי להאיר את אזור הראש. פוקוס על בסיס של בינית לסתי משמאל, אשר הבולטת מזווית הגחון האחורי של maxilla (איור 1). <img src="/files/ftp_upload/1558/1558fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזק לתפוס את פיר של בינית דיסטלי מעט לקצה maxilla. הגבהה של פיר בינית והכנס מלתעותיו של קנס שקצהו מספריים באביב הפרוקסימלי רק כדי מלקחיים. מספריים ניתן נגע אל מלקחיים ליציבות. החלק את הלסתות של המספריים לאורך הפיר של בינית עד חוד החנית גישות קצה maxilla. סגור את המספריים לחתוך דרך הפיר בינית. בינית קטוע, עדיין אחז ב מלקחיים, ניתן להסיר את קיבוע או תצפית נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את הדגים לאקווריום קטן של מים מערכת נקייה (~ 500 מ&quot;ל) המכילה טיפה אחת של מתילן כחול לשלוט זיהום פטרייתי שטחי. אפשר הדגים להתאושש במהלך הלילה. למחרת בבוקר, להחזיר את הדגים למערכת גידול. בינית התחדשות היא מקסימאלית לאחר 2 שבועות. </li></ol> אגר והטבעה של זוגות בהתאמה בינית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף הדגים על ידי המתת חסד טכניקה מתאימה לתקן בצינור 50 מ&quot;ל של 4% paraformaldehyde-שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) בהתרגשות על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. נפח מקבע צריך להיות לפחות עשר פעמים את נפח הרקמה. לאחר קיבוע, להשליך פסולת paraformaldehyde במיכל מאושר ולשטוף את הרקמה ביסודיות כמה שינויים של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו זכוכית 250 מ&quot;ל 150 מ&quot;ל בקבוק של 2% agarose (T מ ~ 37 ° C) במים מזוקקים. מחממים עם מיקרוגל או צלחת חמה, התססה מעת לעת עד נמס לגמרי. לאזן את הפתרון מותך בתוך אמבט מים 50-60 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מתקן סטנדרטי ג&#39;ל אלקטרופורזה ידי הצבת עובש קטן ג&#39;ל gasketed (10 x 10 ס&quot;מ, נפח ~ 100 מ&quot;ל ג&#39;ל) בתקיפות נגד צידי החדר חיץ. הוספת 2-4 קטן שיניים מדגם מסרקים (4 x 1.5 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על משטח ישר, ויוצקים את agarose נמס לתוך התבנית רק כדי לכסות את הבסיס של מסרקים, להרכיב בארות רדוד מאוד. מיד לשים את שאריות agarose בחזרה לתוך האמבט במים חמים, זה ישמש מאוחר יותר להטביע את הרקמה (שלבים 9-12). שים זכוכית ארוכה פסטר פיפטה לתוך הבקבוק כדי לשמור על פיפטה לטמפרטורה זהה agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר ג&#39;ל להתקשות במשך 20-30 דקות. הסר את מסרקים, ולאחר מכן להסיר את התבנית ג&#39;ל המכיל את ג&#39;ל מוקשה מן החדר חיץ. קלטת היטב את הצדדים לפתוח את הג&#39;ל של עובש עם הקלטת מעבדה כך הג&#39;ל אינו מחליק החוצה. סרט זה אמור להאריך כמה מילימטרים מעל פני השטח של agarose כך agarose נוסף ניתן להוסיף מאוחר יותר (שלב 13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את תבנית ג&#39;ל על הבמה של stereomicroscope. הגדלה באר מים ריקה ולהביא את הקצוות אל המוקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על פני השטח של agarose סמוך לבאר, פיפטה טיפת מים או חיץ המכילה את דגימות קבוע בינית (למשל, להתחדש ובקרה). USIng כפוף סיכות חרקים, גרור את דגימות לחות לתוך הבאר ולדחוף אותם לתחתית. המזרח פירים בינית מקבילים זה לזה מיושר נגד קצוות מנוגדים של ארוך היטב. מתח פנים יעזור להחזיק את הרקמה בעמדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מוכן להטביע, השתמש קצה פיפטה קנס או את הפינה של רקמות במעבדה כדי להסיר את הנוזלים העודפים מן הבאר. עבודה במהירות, כדי לא לתת הרקמה להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בזכוכית חימם פיפטה פסטר, בעדינות פיפטה agarose מותכת טרי סביב דגימות כדי לאטום את רקמת בינית במקום. אל תמלא יותר מדי. לפני agarose מתקשה, לעשות שינויים של הרגע האחרון עם סיכות חרקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום הדגימה ממוספרת תווית נייר ליד הבאר לאבטח אותו עם טיפה קטנה של agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 6 עד 10 עבור כל טוב של דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה לצורך כיול התמונה, להוסיף פיסת נייר עם בקנה מידה מיקרומטר מודפס (לדוגמה, <a href="http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/">http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/</a> ) לתוך החלק התחתון של ריק היטב. שטחו את הנייר לתחתית הבאר לכסות את זה עם agarose חם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל הדגימות הם מוטבעים, את פני השטח של ג&#39;ל יהיה לא סדיר, עם טיפות של מוקשה agarose. מניחים את הג&#39;ל על משטח שטוח בעדינות ויוצקים פנימה agarose נמס נוספים עד משטח עליון אחיד. השתמש הסכום הקטן ביותר של agarose הכרחי כדי לקבל משטח חלק, יותר מדי agarose יהיה מעורפל מועבר אור בצילום. אפשר זו השכבה העליונה להתקשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הג&#39;ל יכול להצטלם על הבמה של stereomicroscope להקליט מורפולוגיה ברוטו עבור כל זוג בינית. כיול תמונה מתקבלת על ידי מצלם את היקף מיקרומטר מוטבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;ל כולו ניתן לאחסן עטופים במגבות נייר רטוב אטום בשקית ניילון ב 4 מעלות למשך מספר שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניתוח נוסף, קוביות אגר המכיל זוג מתאימים של barbels ניתן לגזור מתוך הג&#39;ל עם להב סכין מנתחים או סכין גילוח ומעובד היסטולוגיה פרפין או cryosectioning על ידי שיטות סטנדרטיות 3,4. לחלופין, barbels הפרט יכול להיות גזור מתוך agarose עם מחטים דקות, לשטוף במים, ומעובדים עבור יישומים במורד אחרים (למשל, כל הר או אימונוהיסטוכימיה מיקרוסקופיה confocal). </li></ol>

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1+General+Methods+for+Zebrafish+Care.">Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Howe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+length:+Not+quite+so+standard.">Standard length: Not quite so standard.</a> Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+Embedding+Tissue+Samples+for+Sectioning.">Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+8.3+Agar+Embedding+for+Cryostat+Sectioning+of+Embryos+or+Larvae.">Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+bud+development+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio.</a> Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).</li></ol>

לסתי דג הזברה בינית היא מערכת רקמות מנוצלים לחקר גדילה, תחזוקה, התחדשות של תאים מסוגים כמה דג הזברה. למרות תוספת בינית אין אנלוגי האנושי, סוגי התאים שהוא מכיל הם שמור ביותר, כך שניתן ללמוד, בלוטות בעור, מלנוציטים, כלי הדם והעצבים במבנה גלילי ברור אופטית פשוטה מבחינה אנטומית. בדומה סנפיר היטב למד את הזנב, רקמה בינית יכול להיגרם להתחדש על ידי קטיעה. שימוש גבול maxilla כמו ציון דרך אנטומיים, המטוס קטיעה ניתן למקם במדויק, להקל על המדידה של בינית לצמיחה מחודשת. עבור מפעיל מנוסה, כל הניתוח לוקח רק כמה שניות. החלמה מהירה, ויש לנו זוהה עד כה ללא תופעות קצרות או ארוכות טווח על התנהגות הדגים. דג הזברה עם לשחות one בינית לסתי, לאכול להתרבות בצורה יעילה כמו ניתוחי שולטת, יש להשוות את זמן ההישרדות של אוסף רקמות, עד 6 חודשים לאחר הניתוח. ההשפעה הפיזיולוגית של ניתוח זה צפוי להיות מינימלי, כי 1) את בלוטות הטעם extraoral נישא על בינית נמצאים גם על חלקים רבים אחרים של האפיתל דגים, כולל שפתיים, לחיים וראש 5, 2) בלוטות הטעם להבדיל להופיע בינית התחדשות בתוך 72 שעות (LeClair et al., נתונים שלא פורסמו.) זה הופך את בינית לסתי מערכת פולשנית ללימוד ריפוי הפצע, revascularization ו reinnervation בהקשר של החולייתנים מבוגר. לאחר אינדוקציה כירורגית של התחדשות, barbels ניתן לאסוף במרווחים למדידת morphometric ו / או ניתוח מיקרוסקופי של רקמת קבוע. נוח, בינית לסתי כ אורך (2-3 מ&quot;מ) קוטר (100-200 מ&quot;מ) של עובר דג הזברה, להקל את היישום של פרוטוקולים סטנדרטיים רבים, כולל היסטולוגיה פרפין, cryosectioning, כל הר אימונוהיסטוכימיה ו באתרו הכלאה. יחדיו, תכונות אלו להפוך את בינית לסתי ריאלי מאוד במודל vivo ללימוד ולתיקון רקמות והתחדשות.

מיקרוסקופ ציוד מיקרוסקופ סטריאו לנתח עם מועבר סיב אופטי תאורה האירוע נדרש גזיר בינית והטבעה אגר. בינית Clipping <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת דג במים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 דג הזברה מעבר טנקים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MS-222 (אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate; כימית Sigma # E10521-10G) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטרילי 120 מ&quot;מ צלחת פטרי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נייר מגבות רטובות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרית מתכת קהה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דומון # 55 ביו Inox מלקחיים (כלים המדע פיין # 11255-20) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-Mini-Vannas באביב מספריים (כלים המדע פיין # 15000-00) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כחול מתילן פטריות סוכן (Drs. פוסטר &amp; Smith # CD-905781) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשת דייגים קטן באקווריום </li></ul> רקמות אוסף והטבעה אגר <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 paraformaldehyde% ב 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PF-PBS), aliquoted לתוך 50 מ&quot;ל צינורות חרוטי ומאוחסנים קפוא ב -20 ° C עד השימוש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1x פוספט בופר (pH 7.27-6) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מ&quot;ל בבקבוק זכוכית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2% agarose במים מזוקקים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן קטנה agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה לבוש (גודל ג&#39;ל = ~ 10 ס&quot;מ מרובע) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטן שיניים מדגם אלקטרופורזה מסרק (גודל מסרק 4 x 1.5 מ&quot;מ) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המים באמבטיה חמימים (50-60 מעלות צלזיוס) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבדה קלטת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחור אמייל סיכות חרקים, בגודל 000 (כלים המדע פיין # 26000-25) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1-2 פינים בעלי (כלי מדעי פיין # 26016-12) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 9 אינץ&#39; זכוכית פיפטה פסטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה הנורה או משאבה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במעבדה רקמת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נייר תוויות קטנות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (לא חובה) כיול מודפסים בקנה מידה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נייר מגבות רטובות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם רוכסן, סגירת תיק פלסטיק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזמל / גילוח להב (לחתוך קוביות אגר) </li></ul>

methods for the study of the zebrafish maxillary barbel

Barbels הם הנספחים העור חושית למצוא דגים, זוחלים ודו. דג הזברה, Danio rerio, מפתחת שני זוגות זוג barbels האף קצר וזוג לסתי יותר. בינית מכיל רקמות תאים של ectodermal, mesodermal ומוצא הרכס העצבי, כולל בתאי העור, בלוטות, בלוטות הטעם, מלנוציטים, כלי הדם והעצבים התחושתיים. שלא כמו רקמות הבוגר ביותר, בינית לסתי ברור אופטית, ומאפשר לנו לחזות את פיתוח ותחזוקה של אלו סוגי רקמות לאורך כל מחזור החיים. וידאו זה מציג את התפתחות מוקדמת של בינית לסתי (החל כחודש לאחר ההפריה) ומדגים פרוטוקול כירורגי כדי לעורר התחדשות בתוך תוספת הבוגרת (&gt; 3 חודשים לאחר ההפריה). בקצרה, בינית לסתי השמאלי של דגים הרדים מוגבה עם מלקחיים סטריליות דיסטלי רק עד קצה הזנב של maxilla. בסדר, מספריים באביב סטרילי ממוקם נגד מלקחיים כדי לחתוך את פיר בינית ברמה זו, הקמת נקודת ציון אנטומיות למטוס קטיעה. צמיחה הרגנרציה ניתן למדוד ביחס למישור זה, בהשוואה בינית הנגדי. רקמה בינית מחדש במהירות, להגיע לצמיחה מחודשת מקסימלי בתוך 2 שבועות של פציעה. טכניקות לניתוח בינית מחדש כוללים לנתח והטבעה תואמים barbels (להתחדש ובקרה) של בארות של תקן ה-DNA ג&#39;ל אלקטרופורזה. דגימות Embedded מצולמים בנוחות תחת stereomicroscope עבור מורפולוגיה morphometry ברוטו, והוא יכול להיות מאוחסן במשך שבועות לפני יישומים במורד כגון היסטולוגיה פרפין, cryosectioning, ו / או אימונוהיסטוכימיה הר שלם. שיטות אלה להקים בינית לסתי כרומן במערכת רקמות vivo לחקר יכולת ההתחדשות של סוגי תאים מרובים בתוך ההקשר הגנטי של דג הזברה.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel at JoVE.com

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

לסתי דג הזברה בינית הוא איבר חוש הכסות המכיל ectodermal, mesodermal ונגזרות הרכס העצבי. חשוב לציין, בינית מבוגר יכול להתחדש לאחר כריתה הפרוקסימלי. וידאו זה מציג לסתי פיתוח בינית ומדגים פרוטוקול כירורגי כדי לעורר התחדשות, ואחריו הדמיה, אוסף הטבעה במורד דגימות בינית.

שיטות מחקר של דג הזברה לסתי בינית

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

methods-for-the-study-of-the-zebrafish-maxillary-barbel

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K Views.  DePaul University. לסתי דג הזברה בינית הוא איבר חוש הכסות המכיל ectodermal, mesodermal ונגזרות הרכס העצבי. חשוב לציין, בינית מבוגר יכול להתחדש לאחר כריתה הפרוקסימלי. וידאו זה מציג לסתי פיתוח בינית ומדגים פרוטוקול כירורגי כדי לעורר התחדשות, ואחריו הדמיה, אוסף הטבעה במורד דגימות בינית.

Video: Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

מחשב שנוצר מודל החיה גירויים

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

שימוש בתגובה optokinetic ללמוד לתפקד החזותי של דג הזברה

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

הזרקה לתוך intraperitoneal דג הזברה למבוגרים

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך למבוגרים התחדשות זנב סנפיר דג הזברה

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

עשה זאת בעצמך התקן להבראת דוגמאות Cryopreserved בטעות ירד לתוך טנקים אחסון קריוגני

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging דג הזברה למבוגר

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to study the functions and evolution of bacterial symbionts in their host. As most symbionts cannot be cultured in vitro, methods to isolate an adequate quantity of bacteria for genome sequencing are very important. In the whitefly Bemisia tabaci, a number of endosymbionts have been identified and are predicted to be of importance in the development and reproduction of the pests through multiple approaches. However, the mechanism underpinning the associations remains largely unknown. The obstacle partially comes from the fact that the endosymbionts in whitefly, mostly restrained in bacteriocytes, are hard to separate from the host cells. Here we report a step-by-step protocol for the identification, extraction and purification of endosymbionts from the whitefly B. tabaci mainly by dissection and filtration. Endosymbiont samples prepared by this method, although still a mixture of different endosymbiont species, are suitable for subsequent genome sequencing and analysis of the possible roles of endosymbionts in B. tabaci. This method may also be used to isolate endosymbionts from other insects.

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Here, we present a protocol to isolate endosymbionts from the whitefly Bemisia tabaci through dissection and filtration. After amplification, the DNA samples are suitable for subsequent sequencing and study of the mutualism between endosymbionts and whitefly.

שיטות להפקת endosymbionts מן Whitefly<em&gt; Bemisia Tabaci</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...