Estes métodos foram desenvolvidos por EEL durante uma licença de pesquisa no laboratório de Apoio JT foi fornecido pela Universidade DePaul Research Council e um NIH / NIDCR R01 conceder ao JT (DE016678). Agradecemos os esforços de Hunter Caroline, técnico de cuidados de animais nas instalações do núcleo zebrafish CMRC e Pawluczuk Paulina, a nossa assistente de laboratório de graduação.

Zebrafish criação Peixe-zebra são alojados e criados de acordo com métodos padronizados 1. Passado o período tardio larval, o estágio de desenvolvimento de um peixe-zebra pode ser medido pelo seu comprimento padrão (SL), ou a distância em linha reta em milímetros do ponto anteriormost do lábio superior para a base da nadadeira caudal (placa hypural posteriormost) 2. Em aproximadamente um mês após a fertilização (10-12 mm SL), o barbos nasal e maxilar aparecer como transparente brotos epiteliais perto do pits olfativa e nos cantos posterior da maxila, respectivamente. Como o peixe-zebra amadurece, a estender-se barbos estreito, whisker-como apêndices. Porque o barbo maxilar é maior (2-3 mm) e mais fácil de manipular, nosso protocolo aplica-se somente a este apêndice particular; técnicas semelhantes, no entanto, poderia ser adaptada para o menor nasal barbos. Clipping Barbel <ol><li> Anestesiar zebrafish adulto na fase desejada (por exemplo., 1,5-2,5 cm SL, ~ 3-6 meses pós-fertilização) por imersão em 0,015% MS-222 (3-aminobenzoato de etilo metanossulfonato) tamponada a 7,0 pH em água do sistema. Observe os movimentos até parar de nadar e ventilação branquial torna-se lenta e regular. Dependendo do tamanho do peixe, anestesia completa demora cerca de 05/02 minutos. </li><li> Usando um arrastão aquário, peixes de transferência de 1-3 em um momento de um pedaço dobrado de papel toalha molhada em uma placa de Petri. Usando uma espátula sem corte, orientar o peixe assim que são paralelos uns aos outro lado e lateral esquerdo para cima. Parte dobra da toalha de papel molhado sobre a parte caudal do peixe, cobrindo todo o corpo até o opérculo (guelra cobre) para manter a pele e as guelras úmidas durante o procedimento. </li><li> Ver a placa de Petri sob estereomicroscópio, utilizando-se de baixo ângulo de luz incidente para iluminar a região da cabeça. Foco na base do barbo maxilar esquerdo, que se projeta a partir do canto posterior ventral da maxila (Fig. 1). <img src="/files/ftp_upload/1558/1558fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. </li><li> Firmemente segure o eixo do barbo ligeiramente para a extremidade distal da maxila. Elevar o eixo barbo e inserir as mandíbulas de uma tesoura de ponta fina de primavera apenas proximal ao fórceps. A tesoura pode ser tocado com a pinça para a estabilidade. Deslize as mandíbulas da tesoura ao longo do eixo do barbo até que a ponta se aproxima da borda da maxila. Fechar a tesoura para cortar através do eixo barbos. O barbo amputada, ainda agarrado na pinça, pode ser removido para a fixação ou observação posterior. </li><li> Transferir imediatamente o peixe para um pequeno tanque de água sistema limpo (~ 500 mL) contendo uma gota de azul de metileno para controlar a infecção fúngica superficial. Permitir que o peixe se recuperar durante a noite. Na manhã seguinte, devolver o peixe para o sistema de criação. Barbel regeneração é máxima após 2 semanas. </li></ol> Incorporação de Agar Pares Barbel <ol><li> Coletar peixes pela técnica apropriada a eutanásia e fixar em um tubo de 50 mL de paraformaldeído 4% tampão fosfato (PBS) com agitação a 4 ° C durante a noite. O volume de fixador deve ser pelo menos dez vezes o volume do tecido. Após a fixação, descarte de resíduos paraformaldeído em um recipiente aprovado e lavar o tecido completamente em diversas mudanças de PBS. </li><li> Prepare em um mL de vidro 250 ml frasco 150 de 2% agarose (T m ~ 37 ° C) em água destilada. Calor com um microondas ou chapa quente, agitando periodicamente até que esteja completamente dissolvido. Equilibrar a solução fundida em um banho de água 50-60 ° C. </li><li> Montar um equipamento de eletroforese em gel padrão, colocando um molde de gel vedado pequena (10 x 10 cm; ~ 100 mL de volume gel) firmemente contra os lados da câmara de buffer. Adicionar 2-4 pequena amostra pentes de dentes (4 x 1,5 mm). </li><li> Sobre uma superfície plana, coloque a agarose derretida no molde para cobrir apenas a base dos favos, formando poços muito superficial. Imediatamente coloque a agarose sobra volta para o banho de água morna, que será usado posteriormente para incorporar o tecido (Passos 9-12). Coloque um copo longo Pasteur pipeta no frasco para manter a pipeta para a mesma temperatura que a agarose. </li><li> Permita que o gel para endurecer por 20-30 minutos. Remover os favos, em seguida, retire o molde gel contendo o gel endurecido da câmara de buffer. Firmemente a fita lados abertos do molde gel com fita de laboratório para que o gel não deslize para fora. Esta fita deve se estender vários milímetros sobre a superfície do agarose para que agarose adicionais podem ser adicionados mais tarde (Passo 13). </li><li> Posicione o molde de gel no palco de um estereomicroscópio. Ampliar um poço vazio e trazer as bordas em foco. </li><li> Sobre a superfície do agarose ao lado do bem, pipetar uma gota de água ou tampão contendo os espécimes fixos barbo (por exemplo, regenerar, e controle). Using dobrados pinos de insetos, arraste as amostras úmidas para dentro do poço e empurrá-los para o fundo. Orientar o barbo eixos paralelos um ao outro e alinhados contra oposto bordas longas do poço. Tensão superficial vai ajudar a segurar o tecido na posição. </li><li> Quando estiver pronto para incorporar, use uma ponteira fina ou o canto de um tecido de laboratório para remover o excesso de fluido do poço. Trabalhar rapidamente para não deixar o tecido secar. </li><li> Usando a pipeta Pasteur de vidro aquecido, gentilmente pipeta fresco agarose derretida e em torno da espécimes para selar o tecido barbo no lugar. Não encha demais. Antes da agarose endurece, fazer adaptações de última hora com os pinos de insetos. </li><li> Coloque uma etiqueta numerada exemplar de papel ao lado do bem e prenda-o com uma pequena gota de agarose. </li><li> Repita os passos 6 a 10 para cada poço de espécimes. </li><li> Se desejar para a calibração da imagem, inserir um pedaço de papel com uma escala micrométrica impressos (por exemplo, <a href="http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/">http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/</a> ) no fundo de um poço vazio. Achatar o papel para o fundo do poço e cobri-lo com agarose quente. </li><li> Depois de todos os espécimes são incorporados, a superfície do gel será irregular, com gotas de agarose endurecido. Coloque o gel sobre uma superfície plana e gentilmente despeje adicionais agarose derretida até a superfície superior é uniforme. Use a menor quantidade de agarose necessário para obter uma superfície lisa; muito agarose vai obscura de luz de transmissão fotografia. Permitir que esta camada superior para endurecer. </li><li> O gel pode agora ser fotografado no palco de um estereomicroscópio para registrar morfologia bruta para cada par de barbo. Calibração da imagem é obtida por fotografar a escala micrométrica incorporado. </li><li> O gel inteiro pode ser armazenado envolto em toalhas de papel molhado e selado em um saco plástico a 4 ° por várias semanas. </li><li> Para posterior análise, blocos de ágar contendo par casado de barbos podem ser cortadas do gel com uma lâmina de bisturi ou navalha e processados ​​para exame histológico de parafina ou cryosectioning por métodos padrão 3,4. Alternativamente, barbos individuais podem ser dissecados fora da agarose com agulhas finas, lavadas em água, e processados ​​para outras aplicações a jusante (por exemplo, imuno-histoquímica todo-mount ou microscopia confocal). </li></ol>

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	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1+General+Methods+for+Zebrafish+Care.">Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Howe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+length:+Not+quite+so+standard.">Standard length: Not quite so standard.</a> Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+Embedding+Tissue+Samples+for+Sectioning.">Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+8.3+Agar+Embedding+for+Cryostat+Sectioning+of+Embryos+or+Larvae.">Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+bud+development+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio.</a> Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).</li></ol>

O peixe-zebra maxilar barbo é um sistema de tecido subutilizados para estudar o crescimento, manutenção e regeneração de vários tipos de células no zebrafish. Embora o apêndice barbel não tem analógico humanos, os tipos de células que contém são altamente conservadas, tornando possível o estudo da pele, glândulas, vasos melanócitos, circulatório e os nervos em uma estrutura opticamente clara e anatomicamente simples cilíndrico. Semelhante ao fin bem estudado caudal, tecido barbel podem ser induzidas a regenerar pela amputação. Usando a fronteira da maxila como um marco anatômico, o plano de amputação pode ser colocado com precisão, facilitando a medição de barbo rebrota. Para um operador experiente, cada cirurgia leva apenas alguns segundos. A recuperação é rápida, e nós temos até agora não detectaram efeitos a curto ou a longo prazo sobre o comportamento dos peixes. Peixe-zebra com um mergulho barbel maxilar, comer e raça de forma tão eficaz como controles não-cirúrgico, e têm a sobrevivência comparável ao momento da coleta de tecido, até 6 meses após a cirurgia. O impacto fisiológico da cirurgia prevista para ser mínimo, porque 1) o paladar extraoral transportados no barbo também são encontrados em muitas outras partes do epitélio de peixes, incluindo lábios, bochechas e cabeça 5, e 2) papilas gustativas diferenciar aparecem no o barbo regeneração dentro de 72 horas (LeClair et al., dados não publicados). Isso torna o barbo maxilar um sistema minimamente invasivo para estudar a cicatrização de feridas, a revascularização e reinervação no contexto de um vertebrado adulto. Após a indução cirúrgica de regeneração, barbos podem ser coletados em intervalos de medição morfométricas e / ou análise microscópica do tecido fixo. Convenientemente, o barbo maxilar é aproximadamente o comprimento (2-3 mm) e diâmetro (100-200 mm) de um embrião de peixe-zebra, facilitando a aplicação de muitos protocolos padrão, incluindo histologia de parafina, cryosectioning, todo-mount imuno-histoquímica, e in situ hibridização. Em conjunto, estas características tornam o barbo maxilar altamente viável em modelo in vivo para estudar reparo e regeneração tecidual.

Equipamentos microscópio Um microscópio estéreo dissecando com transmitida e iluminação incidente de fibra óptica é necessário para barbel clipping e incorporação de agar. Clipping Barbel <ul><li> Água do sistema de peixe </li><li> 2 tanques de peixe-zebra cruzamento </li><li> MS-222 (3-aminobenzoato de etilo metanossulfonato; Sigma Chemical # E10521-10G) </li><li> estéril de 120 mm placa de Petri </li><li> toalhas de papel molhado </li><li> espátula de metal sem corte </li><li> Dumont # 55 Bio Inox Pinça (Ferramentas Ciência Belas # 11255-20) </li><li> Mini-Vannas primavera tesouras (Ferramentas Ciência Belas # 15000-00) </li><li> metileno agente antifúngico azul (Drs. Foster &amp; Smith # CD-905781) </li><li> pequeno aquário fishnet </li></ul> Coleta de tecido e incorporação de agar <ul><li> 4% paraformaldeído em 1x tampão fosfato (PBS-PF), até aliquotado em tubos cônicos de 50 mL e armazenadas congeladas a -20 ° C use </li><li> 1x tampão fosfato (pH 7,27-6) </li><li> 250 mL frasco de vidro </li><li> Agarose 2% em água destilada </li><li> padrão pequena plataforma eletroforese em gel de agarose (gel tamanho = ~ 10 cm quadrado) </li><li> pequeno pente de dentes amostra de eletroforese (tamanho pente 4 x 1,5 mm) </li><li> banho de água morna (50-60 ° C) </li><li> fita de laboratório </li><li> preto esmaltado pinos de insetos, o tamanho 000 (Ferramentas Ciência Belas # 26000-25) </li><li> 02/01 retentores de pinos (ferramentas de Ciência Belas # 26016-12) </li><li> De 9 polegadas de vidro Pasteur pipeta </li><li> pipeta lâmpada ou bomba </li><li> tecidos de laboratório </li><li> pequenas etiquetas de papel </li><li> (Opcional) escala de calibração impressa </li><li> toalhas de papel molhado </li><li> zip encerramento saco plástico </li><li> bisturi / lâmina de barbear (para cortar blocos de agar) </li></ul>

methods for the study of the zebrafish maxillary barbel

Barbos são apêndices sensoriais da pele encontrados em peixes, répteis e anfíbios. O peixe-zebra, Danio rerio, desenvolve dois pares de barbos-um par de curto nasal e um par mais maxilar. Barbel tecido contém células de origem ectodérmica, mesodérmica e origem da crista neural, incluindo as células da pele, glândulas, papilas gustativas, os melanócitos, vasos circulatórios e nervos sensoriais. Diferentemente da maioria dos tecidos adultos, o barbo maxilar é opticamente clara, o que nos permite visualizar o desenvolvimento ea manutenção destes tipos de tecidos em todo o ciclo de vida. Este vídeo mostra o desenvolvimento inicial do barbo maxilar (início cerca de um mês pós-fertilização) e demonstra um protocolo cirúrgico para induzir a regeneração no apêndice adultos (&gt; 3 meses pós-fertilização). Resumidamente, o barbo maxilar esquerdo de um peixe é elevado anestesiados com pinças esterilizadas imediatamente distal à borda caudal da maxila. Uma multa, tesoura primavera estéril é posicionado contra a pinça para cortar o eixo do barbo, a este nível, estabelecendo um marco anatômico para o plano de amputação. Crescimento regenerativa pode ser medida com relação a este plano, e em comparação com o barbo contralateral. Barbel tecido se regenera rapidamente, atingindo regrowth máxima dentro de 2 semanas da lesão. Técnicas de análise do barbo regeneradas incluem dissecar e incorporação de pares de barbos (regenerar e controle) nos poços de um gel de eletroforese de DNA padrão. Espécimes incorporados são convenientemente fotografados em um estereomicroscópio para a morfologia e morfometria bruta, e pode ser armazenado durante semanas antes de aplicações a jusante como histologia parafina, cryosectioning, e / ou imuno-histoquímica montar todo. Estes métodos estabelecer o barbo maxilar como um romance no sistema de tecido vivo para estudar a capacidade de regeneração dos vários tipos de células dentro do contexto genético de peixe-zebra.

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Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

O peixe-zebra maxilar barbo é um órgão do sentido tegumentar contendo ectodérmica, mesodérmica e derivados da crista neural. Importante, o barbo adulta consegue regenerar após a amputação proximal. Este vídeo apresenta o desenvolvimento barbel maxilar e demonstra um protocolo cirúrgico para induzir a regeneração, seguido por incorporação de coleta, ea jusante de imagens de espécimes barbos.

Métodos para o Estudo do maxilar Zebrafish Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

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12.4K visualizações.  DePaul University. O peixe-zebra maxilar barbo é um órgão do sentido tegumentar contendo ectodérmica, mesodérmica e derivados da crista neural. Importante, o barbo adulta consegue regenerar após a amputação proximal. Este vídeo apresenta o desenvolvimento barbel maxilar e demonstra um protocolo cirúrgico para induzir a regeneração, seguido por incorporação de coleta, ea jusante de imagens de espécimes barbos.