מימון חלקי עבור עבודה זו סופק על ידי קריירה NSF 0744556 (Rao) וכן מלגה דרך VCU-HHMI המדע החינוך תוכנית המחקר (פסקואל).

חלק 1: מכתים השעיה Immunocytochemical <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נקצרים לתוך ההשעיה תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים מועברים לאחר מכן לתוך 1.5-2ml צינורות microcentrifuge ו centrifuged ב 200 גרם במשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נשטפים החוצה על ידי aspirating supernatant, מחדש תלויה 1mL של PBS - (ללא Mg 2 + ו - Ca 2 +) ולאחר מכן centrifuged שוב למשך 4 דקות 200 גרם. זה צריך להיעשות פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כביסה, תאים מקובעים אז paraformaldehyde 1mL של 4% (PFA) בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות על ידי השעיית אותם מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נשטפים שוב פעמיים עם 1mL של PBS -. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר, על ידי שטיפת התאים לחסום מחדש השעיית אותם 1mL הפתרון בלוק (6% serum/94 PBS% -). דגירה אלה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר, צנטריפוגה צינורות ב 200 גרם במשך 4 דקות לשאוב את הפתרון חסום. Re-להשעות תאים 1mL הפתרון נוגדן ראשוני (עשה עם פתרון בלוק בדילול מומלץ). תאים יכולים להיות מודגרות בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 או 4 ° C למשך הלילה לפני שתמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נשטפים לאחר מכן פעמיים עם 1mL הפתרון חסום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר, מחדש תאים להשעות 1mL של פתרון נוגדנים משני (עשה עם פתרון בלוק בדילול מומלץ) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, תאים אמור להיות שטף שוב פעמיים עם 1mL הפתרון חסום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כביסה עם הפתרון בלוק, לכבס שוב עם תאים 1mL של PBS -. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שוטף שונים, מחדש תאים להשעות 1mL של DAPI גרעיני כתם (1:10,000 דילול DAPI ב PBS -) ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 5 דקות, צנטריפוגה צינורות ב 200 גרם במשך 4 דקות. לשאוב את הפתרון גרעיני DAPI כתם מחדש להשעות תאים 1mL של PBS -. </li></ol> חלק 2: התאגדות של hPSCs בשקופיות שנוצר באמצעות מנגנון cytospin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות פלסטיק מוכנים ידי הפיכת הסכום הרצוי בהם חורים עם העיתונות תרגיל. הקוטר צריך להיות לכל היותר 1 מ&quot;מ גדול יותר בקוטר הרחב ביותר של קצה micropipette (ים) לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נייר מסנן לחתוך את הפרמטרים של השקופית פלסטיק עם מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חורים נעשים אז בעיתון הסינון. גודלו של החור (ים) צריך להיות גדול מספיק, כי את קצה micropipette (ים) מתאים מלבב דרכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי אחד שקופיות פלסטיק מוכנים ממוקם על גבי שקופיות הזכוכית ממוקם בחלק התחתון של הנייר לסנן בסלע (איור 1). השכבות מובטחות עם הקלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקסימום של 100μL (תלוי בצפיפות monolayer הרצוי) של ההשעיה תא מוכתם חלק 1 ממוקם מכן לתוך החלק העליון של קצה micropipette (ים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, המנגנון עם פתרון התא יכול להיות שקל ומאזן נגדית של משקל דומה נוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנגנון cytospin ו לאזן יכול ממוקמות אז בצנטריפוגה שולחניים centrifuged ב 200 גרם במשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, המנגנון cytospin הוא מפורק בזהירות באופן doesn&#39;t לסלק את התאים מן שקופיות הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך, PBS שמסביב עודף - בצד זכוכית aspirated החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לאחר מכן ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבדוק אם monolayer תא הרצויה הושגה. </li></ol> חלק 3: שקופיות הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ירידה של התקשורת הרכבה הרצוי ממוקם ישירות במרכז של כל אזור המכיל תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר, להחליק כיסוי הוא הוריד בעדינות על גבי שקופיות מנסה להימנע בועות אוויר אם זה אפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקשורת הרכבה עודף מוסר אז משקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי, צד של תלושי לכסות חתומות עם מסמר לכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השקופיות יכולים להישמר בשטח אחסון כהה עד התוצאות הם נצפו ותועדו. </li></ol>

<ol>
	<li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells.">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).</li><li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homemade+cytospin+apparatus.">A homemade cytospin apparatus.</a> Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

לענין במעבדה שלנו, צלחת 35mm של תא גזע תרבויות גדל על fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) הוא המוקצב ההליך מכתים immunocytochemical לשימוש עם מנגנון cytospin. התאים נאספים אז באמצעות האנזימטית passaging, הסרת כמה שכבת MEF ככל האפשר, תוך השעיית תא בודד. אם גזע יותר יעיל תא הבידוד מהשכבה MEF הוא הרצוי, מו?...

<table><tbody><tr><td>Lab Tek Permanox Chamber Slide</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>117437</td><td>Material for re-used plastic slides</td></tr><tr><td>Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>0.1-10&amp;mu;L Filter Tips</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1121-3810</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>120542-B</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8311-4</td><td>Mounting Medium</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4304</td><td>Primary Antibody for SSEA-4 staining</td></tr><tr><td>Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>Primary Antibody for SSEA-3 staining</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>Secondary Antibody for SSEA-4 staining</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG </td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>Secondary Antibody for SSEA-3 staining</td></tr><tr><td>DAPI, Dihydrochloride</td><td>Calbiochem</td><td>268298</td><td></td></tr></tbody></table>

immunocytochemical analysis of human pluripotent stem cells using a self-made cytospin apparatus

אדם בתאי גזע pluripotent (hPSCs) הכוללים בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) האדם הנגרמת גזע pluripotent תאים (hiPSCs) הם מקורות תא מרגש עקב התחדשות עצמית שלהם יכולות בלתי מוגבלות הפוטנציאל שלהם להתמיין לסוגי תאים שונים. המדינה pluripotent של hPSCs נבחנת בדרך כלל על ידי טכניקות כגון qPCR, immunocytochemistry, ועל ידי אחרים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em&gt; בידול אסטרטגיות לתוך תאים מסוגים שונים. בין אלה, טכניקות immunocytochemical פותחו לאפיון שגרתית של המדינה מובחן של hPSCs מבוסס על ניתוח של סמנים ביולוגיים המועמד תאיים על פני קרום התא. בהתחשב בעובדה hPSCs לגדול מושבות, בעיות המתעוררות לכימות ביטוי של סמנים אלה ברמת התא היחיד על בסיס שגרתי. Cytometry ניתוח תזרים לשמש כדי לטפל בבעיה זו אך דורשים מספרים סלולריים השימוש ריאגנטים כי הם לא תורם בדרך כלל הערכה מלאה שגרתית איכות של תרבויות hPSC. לפיכך, פיתוח של אמצעים מעשיים לשעתקו של יצירת תאים בדגימות monolayer עם יושרה נשמרים לצורך הערכה סמן יש יתרונות רבים במחקר בתאי גזע. זה מאוד יתרונות ניתוח immunocytochemical כי תאים בודדים מתוך monolayer ניתן להבחין בקלות לכמת ביטוי של סמנים ספציפיים. לקראת מטרה זו, מנגנון מתוצרת עצמית cytospin נבנה מותאם לשימוש עם מכתים immunocytochemical. שני סמנים על פני קרום התא (SSEA3/SSEA4) ביטוי נותחו קו גרסה BG01 תא גזע לצורך פרוטוקול זה.

Watch this Scientific Journal Video about Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus at JoVE.com

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

מכתים השעיה immunocytochemical בתאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) על פני קרום התא סמנים (SSEA-3/SSEA-4) הושג על בסיס השימוש במנגנון cytospin מתוצרת עצמית כדי ליצור monolayer של תאים להסתכלות וכימות.

ניתוח Immunocytochemical של בתאי גזע האדם pluripotent באמצעות מנגנון מתוצרת עצמית Cytospin

Human pluripotent stem cells (hPSCs) that include human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are exciting cell ...

immunocytochemical-analysis-human-pluripotent-stem-cells-using-self

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K Views.  Virginia Commonwealth University. מכתים השעיה immunocytochemical בתאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) על פני קרום התא סמנים (SSEA-3/SSEA-4) הושג על בסיס השימוש במנגנון cytospin מתוצרת עצמית כדי ליצור monolayer של תאים להסתכלות וכימות.

Video: Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

תרבות דגם חדשני לpluripotent אדם תאי גזע רביה בטין במדיה מזגן שליה

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Developmental Biology

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest, most commonly a protein, in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable researchers to conserve primary and secondary antibodies while getting high quality, reproducible qualitative and quantitative data out of their staining. There are two aspects of this protocol that help to conserve the volume of antibody necessary for staining. For one, the cells are grown on small, circular coverslips that are placed in wells of a tissue culture plate. After fixation, the cells on coverslips can be removed from the wells of the plate. For antibody staining, the coverslip with cells is inverted onto a small drop of antibody solution on parafilm and is covered with a second piece of parafilm to prevent drying. Using this method, only ~25 &mu;l of antibody solution is needed for each coverslip (or sample) to be stained. This protocol describes immunostaining of human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can be used for many other cell types.

Immunocytochemistry is a powerful method to determine the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable one to conserve antibodies and get the most out of one's staining.

Immunocytochemistry: אדם בתאי גזע עצביים

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

Small-scale Propagation of Human iPSCs in Serum-free Conditions for Routine Immunocytochemical Characterization

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient specificity and characteristic stemness. However, the pluripotency of iPSCs, which is essential to their functionality, must be confirmed before these cells can be used in such applications. While a rigorous characterization of iPSCs, through different cellular and functional assays is necessary to establish their pluripotency, routine assessment of pluripotency maintenance can be achieved more simply and effectively through immunocytochemical techniques. Here, we present a systematic protocol for culturing hiPSCs, in a scaled-down manner, to particularly facilitate the verification of their pluripotent state using immunocytochemistry. More specifically, this methodology encompasses an efficient and cost-effective means of growing iPSCs in serum-free conditions and plating them on small chamber slides or glass coverslips ideal for immunocytochemistry.

Regular characterization of induced pluripotent stem cells (iPSCs), to ascertain maintenance of their pluripotent state, is an important step before these cells are used for other applications. Here we describe a method for the small-scale propagation of human iPSCs specifically designed to enable their easy and routine characterization via immunocytochemistry.

רבייה בקנה מידה קטנה של iPSCs האנושי בתנאי סרום ללא לאפיון Immunocytochemical שיגרתי

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis and visual clarity. Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived LESCs provide a promising cell source for corneal cell replacement therapy. Undefined, xenogeneic culture and differentiation conditions cause variation in research results and impede the clinical translation of hPSC-derived therapeutics. This protocol provides a reproducible and efficient method for hPSC-LESC differentiation under xeno- and feeder cell-free conditions. Firstly, monolayer culture of undifferentiated hPSC on recombinant laminin-521 (LN-521) and defined hPSC medium serves as a foundation for robust production of high-quality starting material for differentiations. Secondly, a rapid and simple hPSC-LESC differentiation method yields LESC populations in only 24 days. This method includes a four-day surface ectodermal induction in suspension with small molecules, followed by adherent culture phase on LN-521/collagen IV combination matrix in defined corneal epithelial differentiation medium. Cryostoring and extended differentiation further purifies the cell population and enables banking of the cells in large quantities for cell therapy products. The resulting high-quality hPSC-LESCs provide a potential novel treatment strategy for corneal surface reconstruction to treat limbal stem cell deficiency (LSCD).

This protocol introduces a simple two-step method for differentiating corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells under xeno- and feeder cell-free culture conditions. The cell culture methods presented here enable cost-efficient, large-scale production of clinical quality cells applicable to corneal cell therapy use.

יעיל ומדרגי הבידול בבימויו של קלינית הקרנית Limbal אפיתל תאי גזע מתאימים מתאי גזע Pluripotent אנושי

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older centriole during the G1/G0 phase of the cell cycle, while they disassemble as the cells re-enter the cell cycle at the G2/M phase boundary. They function as signal hubs, by detecting and transducing extracellular signals crucial for many cell processes. Similar to most cell types, all neocortical neural stem and progenitor cells (NSPCs) have been shown harboring a PC allowing them to sense and transduce specific signals required for the normal cerebral cortical development. Here, we provide detailed protocols to generate and characterize two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cell-based models from human induced pluripotent stem cells (hIPSCs) to further dissect the involvement of PC during neocortical development. In particular, we present protocols to study the PC biogenesis and function in 2D neural rosette-derived NSPCs including the transduction of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway. To take advantage of the three-dimensional (3D) organization of cerebral organoids, we describe a simple method for 3D imaging of in toto immunostained cerebral organoids. After optical clearing, rapid acquisition of entire organoids allows detection of both centrosomes and PC on neocortical progenitors and neurons of the whole organoid. Finally, we detail the procedure for immunostaining and clearing of thick free-floating organoid sections preserving a significant degree of 3D spatial information and allowing for the high-resolution acquisition required for the detailed qualitative and quantitative analysis of PC biogenesis and function.

We present detailed protocols for the generation and characterization of 2D and 3D human induced pluripotent stem cell (hIPSC)-based models of neocortical development as well as complementary methodologies enabling qualitative and quantitative analysis of primary cilium (PC) biogenesis and function.

מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים אנושיים לניתוח מעורבות סיליום ראשוני במהלך התפתחות ניאוקורטיקלית

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older ...

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the differentiation of ES cells is the formation of embryoid bodies (EBs) aggregates 2, 3. EB formation is based on spontaneous aggregation when ES cells are cultured in non adherent plates. Three-dimensional EB recapitulates many aspects of early mammalian embryogenesis and differentiate into the three germ layers: ectoderm, mesoderm and endoderm 4.
Immunofluorescence and in situ hybridization are widely used techniques for the detection of target proteins and mRNA present in cells of a tissue section 5, 6, 7. Here we present a simple technique to generate high quality cryosections of embryoid bodies. This approach relies on the spatial orientation of EB embedding in OCT followed by the cryosection technique. The resulting sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to characterize populations of cells containing certain proteins, RNA or DNA. In this sense, the preparation of EB cryosections (10&mu;m) are essential tools for histology staining analysis (e.g. Hematoxilin and Eosin, DAPI), immunofluorescence (e.g. Oct4, nestin) or in situ hybridization. This technique can also help to understand aspects of embryogenesis with regards to the maintenance of the tri-dimensional spherical structure of EBs.

Pluripotent stem cells growing in suspension differentiate into embryoid bodies (EBs). Here we demonstrate how to obtain high quality EB cryosections useful for studying cellular and molecular aspects of embryogenesis, while preserving their organization as aggregates.

ניתוח של בתאי גזע pluripotent באמצעות Cryosections של גופים Embryoid

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the ...

התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטית מושרית באמצעות מערכת תרבית אוטומטית

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, including the elucidation of rare disease pathologies, the development of new medicines, and regenerative medicine aiming to restore damaged organs. Despite this, the social implementation of hiPSCs is still limited. This is partly because of the difficulty of reproducing differentiation in culture, even with advanced knowledge and sophisticated technical skills, due to the high sensitivity of iPSCs to minute environmental changes. The application of an automated culture system can solve this issue. Experiments with high reproducibility independent of a researcher's skill can be expected according to a shared procedure across various institutes. Although several automated culture systems that can maintain iPSC cultures and induce differentiation have been developed previously, these systems are heavy, large, and costly because they make use of humanized, multi-articulated robotic arms. To improve on the above issues, we developed a new system using a simple x-y-z axis slide rail system, allowing it to be more compact, lighter, and cheaper. Furthermore, the user can easily modify parameters in the new system to develop new handling tasks. Once a task is established, all the user needs to do is prepare the iPSC, supply the reagents and consumables needed for the desired task in advance, select the task number, and specify the time. We confirmed that the system could maintain iPSCs in an undifferentiated state through several passages without feeder cells and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, and keratinocytes. The system will enable highly reproducible experiments across institutions without the need for skilled researchers and will facilitate the social implementation of hiPSCs in a wider range of research fields by diminishing the obstacles for new entries.

Author Spotlight: אוטומציה של תרבות iPSC לשיפור יכולת השחזור 

Here, we present a protocol for an automated cell culture system. This automated culture system reduces labor and benefits the users, including researchers unfamiliar with handling induced pluripotent stem (iPS) cells, from the maintenance of iPS cells to differentiation into various types of cells.

מערכת תרבית אוטומטית לשמירה והתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is still time consuming. Comparative studies that use recombinant lines with transgenes integrated into safe harbor loci could benefit from approaches that use site-specific targeted recombinases, like Cre or FLPe, which are more rapid and less prone to off-target effects. Such methods have been described, although they do not significantly outperform gene targeting in most aspects. Using Zinc-finger nucleases, we previously created a master cell line in the AAVS1 locus of hPSCs&#160;that contains a GFP-Hygromycin-tk expressing cassette, flanked by heterotypic FRT sequences. Here, we describe the procedures to perform FLPe recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) using this line. The master cell line is transfected with a RMCE donor vector, which contains a promoterless Puromycin resistance, and with FLPe recombinase. Application of both a positive (Puromycin) and negative (FIAU) selection program leads to the selection of RMCE without random integrations. RMCE generates fully characterized pluripotent polyclonal transgenic lines in 15 d&#160;with 100% efficiency. Despite the recently described limitations of the AAVS1 locus, the ease of the system paves the way for hPSC transgenesis in isogenic settings, is necessary for comparative studies, and enables semi-high-throughput genetic screens for gain/loss of function analysis that would otherwise be highly time consuming.

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Here we report a rapid and efficient gene editing method based on RMCE in the AAVS1 locus of human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) that improves upon previously described systems. Using this technique, isogenic lines can be rapidly and reliably generated for proper comparative studies, facilitating transgenesis-mediated research with hPSCs.

הדור מהיר ויעיל של תאי גזע פלוריפוטנטיים רקומביננטי אנושי ידי recombinase בתיווך המרת קלטת ב<em&gt; AAVS1</em&gt; לוקוס

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

ניתוח Immunocytochemical של בתאי גזע האדם pluripotent באמצעות מנגנון מתוצרת עצמית Cytospin

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

תרבות דגם חדשני לpluripotent אדם תאי גזע רביה בטין במדיה מזגן שליה

Immunocytochemistry: אדם בתאי גזע עצביים

רבייה בקנה מידה קטנה של iPSCs האנושי בתנאי סרום ללא לאפיון Immunocytochemical שיגרתי

יעיל ומדרגי הבידול בבימויו של קלינית הקרנית Limbal אפיתל תאי גזע מתאימים מתאי גזע Pluripotent אנושי

מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים אנושיים לניתוח מעורבות סיליום ראשוני במהלך התפתחות ניאוקורטיקלית

ניתוח של בתאי גזע pluripotent באמצעות Cryosections של גופים Embryoid

מערכת תרבית אוטומטית לשמירה והתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

מערכת תרבית אוטומטית לשמירה והתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

מערכת תרבית אוטומטית לשמירה והתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

הדור מהיר ויעיל של תאי גזע פלוריפוטנטיים רקומביננטי אנושי ידי recombinase בתיווך המרת קלטת ב