המחברים רוצים להכיר ד&quot;ר פיליפ שוורץ ח של המשאבים הלאומיים האדם עצבית לתאי גזע בבית החולים לילדים, אורנג&#39; קאונטי מכון המחקר למתן תרבויות hNSPC ד&quot;ר גארי Bassell באוניברסיטת אמורי להוראה הראשונית בטכניקת צביעה parafilm.

יום 1: הכנת תאים Coverslips זכוכית הגרמנית מתזמן הערה: coverslips זכוכית הגרמני לעיתים קרובות עדיף העיקרי culturing בתאי גזע עצביים ועל נוירונים. אנו משתמשים בפרוטוקול ניקוי הבאות כדי לשפר את הידבקות התא מתפשטת. מיקום coverslips במעמד קטן שיאפשר גישה נוזל על שני הצדדים של coverslip. ראשית, coverslips דגירה Liquinox ב 1% למשך 10 דקות, ואחריו 3 שוטף עם מים deionized. ודא כי אין בועות סבון להישאר. בשלב הבא, תלושי דגירה ב 1M HCl למשך 30 דקות, ואחריו 3 שוטף עם מים deionized. Coverslips יבש ב 65 ° C במשך הלילה. העברת coverslips על צלחת זכוכית החיטוי לעקר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף בתרבית רקמה, מקום סטרילי coverslips בצלחת גם בגודל הולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל עם coverslips laminin עבור הידבקות התא. דגירה coverslips ב 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​פולי D-ליזין (PDL) במים סטריליים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר coverslips PDL ו דגירה של 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​laminin EMEM במשך 4 שעות או לילה, בתוך 37 ° C רקמות התרבות בחממה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: עיין Passaging האדם מאמר בתאי גזע עצביים ( <a href="/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> ) ואת ספירת אדם בתאי גזע עצביים מאמר ( <a href="/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com / ראשי / Details.stp? ID = 262</a> ) כדי ללמוד כיצד resuspend ולספור hNSPCs. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף laminin מצופה coverslips עם PBS ותאי הזרע לתוך coverslip המכילים כל טוב בצפיפות מסוים (לעתים קרובות אנו משתמשים צפיפות ציפוי ראשוני של 100,000-300,000 תאים / מ&quot;ל ​​עבור תאים שאנחנו ציפוי עבור immunostaining). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת מקום 37 ° C רקמה תרבות החממה ולאפשר לתאים לדבוק coverslips (בדרך כלל מינימום של 4 שעות נדרש). </li></ol> יום 2: תיקון, Permeabilizing, חסימה, ואת הוספת נוגדן ראשוני לתאי הערה: אנו משתמשים מקבע הבאים paraformaldehyde 4% כדי לשמור על מורפולוגיה התא. המתכון כולל המעבר pH לאפשר paraformaldehyde להיכנס פתרון. אנחנו מעדיפים את השיטה ולא את השימוש של חום לפזר paraformaldehyde בגלל טמפרטורות גבוהות יותר יכול להוביל לדור של חומצה פורמית, אשר יכול להגביר מכתים הרקע בעת שימוש פלואורסצנטי. רכיבים מסוימים של מקבע לעזור לשמר את מבנה cytoskeletal (MgCl 2 ו EGTA), בעוד אחרים לעזור לשמור על המורפולוגיה הכללית (סוכרוז). Paraformaldehyde מקבע 4% עבור תאים <table style="border-collapse: collapse; border: medium none;text-align:right;direction:rtl" border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> ריאגנטים את הפעולות הבאות: </td><td> עבור סכום של 100 מ&quot;ל מקבע: </td></tr><tr><td> MilliQ מים </td><td> 75 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde (שוקל לצאת למכסה המנוע קטר) </td><td> 4 גרם </td></tr><tr><td> 10N NaOH, מערבבים ומוסיפים dropwise עד פתרון מנקה </td><td> לפי הצורך </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 0.5 מ EGTA </td><td> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 4 גרם </td></tr><tr><td> HCl 6N, לכיל ל-pH 7.4 </td><td> לפי הצורך </td></tr><tr><td> MilliQ מים </td><td> מביאים 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td colspan="2"> חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד שבוע 1. חם על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש </td></tr></tbody></table><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על הספסל, הסר את המדיה להוסיף מקבע prewarmed. דגירה של 5-15 דקות (תלוי אנטיגן כדי להיות מזוהים, אנחנו בדרך כלל משתמשים 10 דקות). בצע זאת בשלבים הבאים בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל מקבע לתוך מיכל מתאים, כמו מוסדות רבים להתמודד paraformaldehyde כמו פסולת מסוכנת. שטפו תאים 3 פעמים עם PBS, 5 דקות בכל פעם. בעת הסרת פתרונות מן התאים, להיזהר כי היניקה לא לייבש את התאים. כמו כן, תמיד יש את הפתרון הבא מצד להוסיף תאים לפני הסרת פתרון מעילים אותם כל כך התאים לא נותר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אנטיגן של הריבית בתוך התא, קרום התא חייב להיעשות חדיר כדי לאפשר כניסה של הנוגדן. כדי permeabilize תאים, השתמש טריים 0.3% Triton X-100 פתרון PBS. פיפטה לאט כי טריטון הוא צמיג, ולוודא דטרגנט הוא נמס לגמרי לפני שמוסיפים לתאים PBS. Permeabilize תאים במשך 5 דקות, ואחריו כביסה התאים 3 פעמים עם PBS, 5 דקות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים חייבים להיות מטופלים עם סוכן חסימה כדי למנוע אי - ספציפי המחייב של הנוגדן. אנו משתמשים אלבומין בסרום שור (BSA) כסוכן חסימה. הפתרון חוסם מיוצר על ידי המסת BSA 5% לתוך PBS (על כסא נדנדה או הכתף כי זה לוקח זמן לפרק) ואז סינון סולution עם מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר. בלוק תאים פתרון BSA / PBS 5% למשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li></ol> לדלל את הנוגדן הראשוני (בתקווה שהוא ספציפי לחלבון ריבית) לריכוז שנקבע מראש 1% BSA / PBS (שהוכן על ידי דילול מ -5% BSA / PBS). המקום בדילול נוגדן ראשוני (30 μl לכל coverslip 25 מ&quot;מ, 20 μl לכל coverslip 18 מ&quot;מ, 15 μl לכל coverslip 12 מ&quot;מ) על צלחת זכוכית מכוסה parafilm. תרימי את coverslip עם תאים קבוע, להפוך כך התאים עם הפנים כלפי מטה, ולהניח אותה על הפתרון נוגדן כך התאים באים במגע עם הנוגדן. מניחים רצועה parafilm השני מעל לבנות את כולו. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. יום 3: כביסה, דגירה נוגדן משנית, כתמים גרעיני הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את רצועת parafilm העליון להרים את coverslip, להפוך אותו, לשים אותו בחזרה לתוך הצלחת עם PBS היטב כל אחד שוטף כך התאים כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים 3 פעמים עם PBS, 5 דקות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר נוגדנים משני יאתר את הנוגדן הראשוני, למשל, אם את הנוגדן הראשוני נעשה ארנב, את הנוגדן משני להכיר ארנב IgG. תשמרי על עצמך גם להתאים את אלוטיפ נוגדנים (IgG, IgM, וכו &#39;). אם באמצעות נוגדנים העיקרי מרובים, לוודא שהם ממינים או isotypes שונים, תוכנית לזהות עם סמנים שונים המחוברים נוגדנים משני. לדוגמה, תוכל להשתמש בשילוב נגד ארנב משנית fluorophore אדום בשילוב עם העכבר אנטי משנית fluorophore ירוק. דגירה תאים הפתרון נוגדנים משני מדולל לריכוז המתאים BSA 1% למשך 2 שעות בחושך בטמפרטורת החדר, תוך שימוש בטכניקה זהה הראשי (לא צעדים המוצג בסרטון). נפח נוגדנים משני הדרושים הדגירה עלול להיות מעט גדול יותר מזה של הנוגדן הראשוני אם המשני מאוחסן כפתרון גליצרול (40 μl לכל coverslip 25 מ&quot;מ, 30 μl לכל coverslip 18 מ&quot;מ, 25 μl לכל coverslip 12 מ&quot;מ) . <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: אם אתה משתמש מולקולות ניאון כדי להמחיש את הנוגדן משנית, המדגם צריך להיות מוגן מפני אור פעם את הנוגדן משני שנוסף לו. דגירה בחושך, או צלחת מכוסה בנייר כסף. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את coverslips מ parafilm כמתואר עבור נוגדן הראשוני. שטפו תאים 2 פעמים עם PBS, 5 דקות בכל פעם, ואחריו הדגירה 1 דקה 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​Hoechst גרעיני כתם מדולל PBS (אם counterstain גרעינית היא המועדפת). אם הכתם הוא Hoechst ישנים האות חלש מדי, אתה יכול להגדיל את זמן הדגירה ו / או ריכוז. לאחר הדגרה עם Hoechst, לשטוף פעם 1 עם PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips צריך להיות מותקן על שקופית עם התקשורת הרכבה להדמיה על מיקרוסקופ. במקרים בהם מולקולה ניאון משמש להדמיה של נוגדן המשני, התקשורת הרכבה צריכה להכיל סוכני למזער photobleaching. אנו משתמשים Vectashield כאמצעי תקשורת הרכבה פלואורסצנטי. הצב ירידה בגודל המתאים של Vectashield בשקופית מיקרוסקופ (12 μl לכל coverslip 25 מ&quot;מ, 6 μl לכל coverslip 18 מ&quot;מ, 3 μl לכל coverslip 12 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להרים את coverslip ולשטוף האחורי עם מים deionized להסיר מלחים (מן PBS). טובלים את המים העודפים על kimwipe או מגבת נייר, ומניחים על ירידה של Vectashield עם תאים כלפי מטה. מניחים את coverslip על בזווית ולאפשר לרדת לאט, כדי למנוע בועות אוויר השמנה. לייבל את השקופית עם התאריך וכל מידע המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שקופיות עם coverslips להתייבש (בחושך) יניקה אז את Vectashield עודף מסביב לקצה coverslip. הקצוות coverslip כעת ניתן חתום עם לק, אם תרצה בכך (שימושי במיוחד אם coverslips יראו על מיקרוסקופ הפוך). אנחנו בדרך כלל לאחסן שקופיות שלנו למקפיא -20 מעלות צלזיוס. </li></ol>

<ol>
	<li>Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamin+A,+the+Arp2/3+complex,+and+the+morphology+and+function+of+cortical+actin+filaments+in+human+melanoma+cells.">Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells.</a> J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).</li><li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins.">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).</li><li>Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+analysis+of+stem+cells.">Immunocytochemical analysis of stem cells.</a> In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passaging+Human+Neural+Stem+Cells.">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+Human+Neural+Stem+Cells.">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר את הליך immunostaining עבור hNSPCs זה ממזער את עוצמת הקול של נוגדן הכרחי ונותנת מכתים תא אמין. ההליך המתואר הוא הטוב ביותר עבור אנטיגנים תאיים, אך ניתן לשנות כתם פני התא מולקולות או כדי לשפר כתמים של cytoskeleton.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips</td>
<td>Tool</td>
<td>Carolina Biological Supply Company</td>
<td>WW-63-3029</td>
<td>12,15,18, 22, 25 mm coverslips available</td>
</tr>
<tr>
<td>Liquinox phosphate-free detergent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>Z273279</td>
<td>very viscous</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin, natural mouse</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EMEM (1X)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mediatech</td>
<td>MT-10-010-CV</td>
<td>Distributed by Fisher under the indicated catalog #</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well plate</td>
<td>Tool</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-772-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP151-500</td>
<td>very viscous</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin, IgG-free</td>
<td>Reagent</td>
<td>Jackson Immunoresearch</td>
<td>001-000-161</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hoechst 33342</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>H-1399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>Reagent</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>viscous</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
					</div>

immunocytochemistry: human neural stem cells

Immunocytochemistry היא שיטה חזקה מאוד פשוטה למדי לקביעת נוכחות, לוקליזציה subcellular, והשפע היחסי של אנטיגן של עניין, בדרך כלל חלבון, בתאים בתרבית. פרוטוקול זה מציג קל לעקוב אחר שורה של צעדים שיאפשרו לחוקרים כדי לחסוך נוגדנים ראשוניים ומשניים תוך קבלת איכות גבוהה, איכותי לשחזור נתונים כמותיים מתוך מכתים שלהם. ישנם שני היבטים של פרוטוקול זה מסייע לשמר את עוצמת הקול של נוגדן הכרחי מכתים. ראשית, התאים גדלים על, coverslips קטן עגול ממוקמים בארות צלחת בתרבית רקמה. לאחר קיבוע, התאים על coverslips ניתן להסיר את הבארות של הצלחת. עבור מכתים נוגדן, coverslip עם תאים הוא הפוך על ירידה קטנה של פתרון נוגדן על parafilm והוא מכוסה בחתיכת השני של parafilm כדי למנוע התייבשות. באמצעות שיטה זו, רק ~ 25 μl של פתרון נוגדן דרוש coverslip כל (או מדגם) להיות מוכתם. פרוטוקול זה מתאר immunostaining של האדם גזע / מבשר תאים עצביים (hNSPCs), אך יכול לשמש הרבה סוגי תאים אחרים.

Watch this Scientific Journal Video about Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells at JoVE.com

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemistry היא שיטה חזקה כדי לקבוע את הנוכחות, לוקליזציה subcellular, והשפע היחסי של אנטיגן עניין תאים בתרבית. פרוטוקול זה מציג קל לעקוב אחר שורה של צעדים שיאפשרו אחד לשמר נוגדנים להפיק את המרב של מכתים אחד.

Immunocytochemistry: אדם בתאי גזע עצביים

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

immunocytochemistry-human-neural-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

27.3K Views.  University of California, Irvine (UCI). Immunocytochemistry היא שיטה חזקה כדי לקבוע את הנוכחות, לוקליזציה subcellular, והשפע היחסי של אנטיגן עניין תאים בתרבית. פרוטוקול זה מציג קל לעקוב אחר שורה של צעדים שיאפשרו אחד לשמר נוגדנים להפיק את המרב של מכתים אחד.

Video: Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

רביה של האדם גזע עובריים (ES) תאים

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection reagents has often resulted in poor cell viability and low transfection efficiency.  Other mechanical methods of introducing a gene of interest, such as a &#8220;gene gun&#8221; or microinjection, are also limited by poor cell viability and low numbers of transfected cells.  The strategy of using viral constructs to introduce an exogenous gene into primary cells has been constrained by both the amount of time and labor required to create viral vectors and potential safety concerns.  We describe here a step-by-step protocol for transfecting hNSPCs using Amaxa's Nucleofector device and technology with electrical current parameters and buffer solutions specifically optimized for transfecting neural stem cells.  Using this protocol, we have achieved initial transfection efficiencies of ~35% and ~70% after stable transfection.  The protocol entails combining a high number of hNSPCs with the DNA to be transfected in the appropriate buffer followed by electroporation with the Nucleofector device.

Introducing a gene of interest into a cell is a powerful method for elucidating its function in vivo. This protocol describes an efficient method of transfecting a culture of human neural stem/precursor cells (hNSPCs) using the Nucleofector electroporation apparatus made by Amaxa.

Transfecting אדם בתאי גזע עצביים עם Nucleofector Amaxa

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection ...

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

ספירת אדם בתאי גזע עצביים

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Passaging Human Neural Stem Cells

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes as well as to explore many fundamental processes of human neural development and pathology.  This protocol presents a simple method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of standardizing this technique and increasing reproducibility of human stem cell research.  The hNSPCs we use were isolated from cadaveric postnatal brain cortices by the National Human Neural Stem Cell Resource and grown as adherent cultures on flasks coated with fibronectin (Palmer et al., 2001; Schwartz et al., 2003).  We culture our hNSPCs in a DMEM:F12 serum-free media supplemented with EGF, FGF, and PDGF and passage them 1:2 approximately every seven days.  Using these conditions, the majority of the cells in the culture maintain a bipolar morphology and express markers of undifferentiated neural stem cells (such as nestin and sox2).

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro allows to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes and to explore human neural development. This protocol presents a method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of increasing reproducibility of human stem cell research.

Passaging אדם בתאי גזע עצביים

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

עכבר עוריות עצבית קרסט לתאי גזע (EPI-NCSC) תרבויות

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

מקפיא הפשרה בתאי גזע עובריים אנושיים

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.