פרוטוקול זה הציג שיטה מוגדרת ללא תאי הזנה להפנמת תאי גזע אפיתל לימביים בקרנית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. תאי גזע אפיתל לימבי אחראים לחידוש אפיתל הקרנית בעין בריאה. נזק לתאים אלה מוביל למצב המכונה מחסור בתאי גזע גפיים, ולאובדן בהירות הקרנית.
שיטות תרבות התא המוצגות כאן מאפשרות ייצור יעיל של תאי גזע אפיתל גפיאליים לטיפולים עתידיים בהחלפת תאי הקרנית. כדי להתחיל, מעבר ולשמור על תרבות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים חופשיים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. הקפד להשתמש רק בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באיכות גבוהה כחומר התחלתי להתבוללות.
כאשר מוכן לגרום היווצרות הגוף העוברי, לחמם את כל החומרים הדרושים reagents לטמפרטורת החדר ברדס זרימה למינארית. נתק את תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים החופשיים להשעיה על ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של EDTA טריפסין ללא קסנו לכל באר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO2.
לאחר שלוש דקות, להסיר את התאים מהאינקובטור ולבדוק את מורפולוגיה התא כדי לקבוע את השלב האופטימלי להסרת טריפסין. בזהירות לבחון את התאים כדי לקבוע את הזמן האופטימלי כדי להסיר את EDTA tryspin חינם קסנו, כאשר התאים מעוגלים, אבל לא התנתקו לחלוטין. בזמן האופטימלי, להסיר את EDTA טריפסין חינם קסנו מהתאים.
הוסף מעכב טריפסין מוגדר בעדינות פיפטה כדי לנתק את התאים. לאסוף את ההשעיה תא יחיד בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. צנטריפוגה ב-300 גרם לחמש דקות.
לאחר מכן, להסיר את supernatant, ולתלות מחדש את התאים במיליליטר אחד של מדיום תרבות. לאחר ספירת התאים, להפיץ שניים עד שלושה מיליון תאים בשלושה מיליליטר של מדיום אינדוקציה בזלית בתוספת חמישה blebbistatin micromolar לכל באר של מצורף נמוך שש צלחת גם. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
למחרת, לבדוק את האיכות של הגופים העובריים תחת מיקרוסקופ. הסר את המדיום, ולהחליף אותו עם שלושה מיליליטר של מדיום אינדוקציה בסיסית בתוספת 10 micromolar SB-505124 ו 50 ננוגרם למיליליטר של גורם גדילה פיברגלס בסיסי אנושי. המשך הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2.
ביומיים הבאים, להסיר את המדיום, ולהחליף אותו עם שלושה מיליליטר של מדיום אינדוקציה בסיסית, בתוספת 25 ננוגרם למיליליטר של חלבון מורפגנטי עצם ארבע. לאחר מכן, להמשיך דגירה באמצעות התנאים הקודמים. ביום הרביעי, להכין תערובת של 0.5 מיקרוגרם לסנטימטר מרובע של Laminin-521, וחמישה מיקרוגרם לסנטימטר מרובע של קולגן שליה אנושי מסוג ארבע, מדולל DPBS המכיל סידן 2 ומגנזיום שני יונים.
באמצעות תערובת זו, מצפים את 100 מילימטר רקמת תרבות מנות עבור התברואה חסיד בנפח ציפוי הכולל של חמישה מיליליטר למנה. לאטום את הצלחות, ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס לילה. ביום החמישי, לחמם את כל החומרים הדרושים ואת reagents לטמפרטורת החדר במכסה המנוע לזרימה למינארית.
לאחר מכן, להסיר את פתרון הציפוי ולהוסיף 10 מיליליטר של מדיום התברמות מחומם מראש לכל מנה. באמצעות פיפטה, להעביר את הגופים העובריים מצלחת אחת גם על פני שתיים עד שלוש מנות תרבות רקמות. לאחר מכן, לנער בעדינות כל צלחת תרבות כדי להפיץ באופן שווה את הגופים העובריים.
לשמור על התאים בתרבות חסידית ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 במשך השבועיים וחצי הבאים עד שלושה שבועות, הקפד להחליף את המדיום עם 10 מיליליטר של בידול טרי בינוני שלוש פעמים בשבוע. השתמש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי לבדוק באופן קבוע את התאים להופעת מורפולוגיה אפיתל נכונה. ראשית, מחממים מראש את כל החומרים הדרושים ואת הריגנטים לטמפרטורת החדר במכסה המנוע של זרימה למינארית, למעט מדיום ההקפאה, שאמור להיות מקורר מראש.
לאחר מכן, לנתק את תא גזע פלוריפוטנטי אנושי נגזר תאי גזע אפיתל גפיים להשעיית תא יחיד על ידי הוספת EDTA טריפסין חינם קסנו ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2. לאחר חמש דקות, להסיר את התאים מהאינקובטור ולבדוק את מורפולוגיה התא כדי לקבוע את השלב האופטימלי להסרת טריפסין. בזהירות לבחון את התאים כדי לקבוע את הזמן האופטימלי כדי להסיר את EDTA טריפסין חינם קסנו, כאשר התאים מעוגלים, אבל לא התנתקו לחלוטין.
בזמן האופטימלי, להסיר את EDTA טריפסין חינם קסנו מהתאים, ולנתק את התאים כמתואר קודם לכן. לאחר ספירת התאים, צנטריפוגה אותם ב 300g במשך חמש דקות. שאפו את המדיום, והשקיעו מחדש את התאים במדיום קריו-שימור נטול קסנו מקורר מראש.
באמצעות פיפטה, להעביר את ההשעיה תא יחיד לתוך cryo-צינורות כך שכל קריו צינור מכיל בין 500, 000 למיליון תאים במיליליטר אחד של מדיום cryopreservation. מניחים את הצינורות במיכל הקפאה. תוך חמש דקות, מעבירים אותם למקפיא ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לילה.
למחרת, להעביר את הצינורות לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. לפני הפשרת התאים, מעיל כל הכלים הדרושים בארות צלחת עם תערובת של חמישה מיקרוגרם לכל סנטימטר מרובע קולגן שליה אנושי סוג ארבע, ו 0.5 מיקרוגרם לסנטימטר מרובע של LM-521, ו מראש לחמם את כל החומרים הדרושים reagents לטמפרטורת החדר במכסה המנוע לזרימת למינאר. לאחר מכן, להסיר את פתרון הציפוי מן הכלים ואת בארות צלחת ולהוסיף את הנפח המתאים של מדיום התברואה מראש מחומם.
מוסיפים מדיום הבחנה מחומם מראש לצינור חרוט 15 מיליליטר. להפשיר את התאים במהירות לטמפרטורת החדר. לאחר הפשרה, מיד להעביר את ההשעיה התא לצינור צנטריפוגה חרוט.
צנטריפוגה ב-300 גרם לחמש דקות. שאפו את המדיום, והשקיעו מחדש את גלולת התא במדיום ההידול כדי להסיר כל מדיום קריו-שימור. צלחת התאים על מנות precoated בינוני ההידול בצפיפות של 40, 000 כדי 50, 000 תאים לסנטימטר מרובע.
לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5%CO2, החלפת מדיום בידול שלוש פעמים בשבוע. ב-Laminin-521, תאי הגזע הפלוריפוטנטיים נטולי המאכילים באיכות גבוהה ללא מאכילים אנושיים יוצרים תחילה מושבות נפרדות עם קצוות חדים, המתמזגים למונוליירים הומוגניים בעת המפגש. פולחן במדיום אינדוקציה בזלית, בתוספת חמישה blebbistatin micromolar במשך 24 שעות בדרך כלל מייצרת השעיה של גופים עובריים הדוקים, רגילים בגדלים שונים, בעוד מורפולוגיה הגוף העוברי לא צריך להשתנות באופן דרמטי במהלך אינדוקציה אקטודרמלית פני השטח בהשעיה, יציבה קולוניאלית נראה להופיע זמן קצר לאחר הגופים העובריים מצופים על סוג קולגן ארבע ומטריצה שילוב Laminin-521 בינוני בידול.
בתוך 21 עד 25 ימים של התברואה, התאים יוצרים שכבות הומוגניות קונפלנטיות, עם מורפולוגיה מצולע, האופייני לתאי אפיתל. התאים עשויים להיות מאוחסנים אז קריו לשימוש מאוחר יותר, כמו הכדאיות ומורפולוגיה נשמרים היטב לאחר הפשרה. ביום 24 של בידול, הרוב המכריע של התאים הביעו חלבון תיבת מזווג, PAX6, הרגולטור העיקרי של התפתחות העין, כמו גם p63 אלפא, סמן LESC מוכר נרחב.
דלתא Np63 הוא דו-דחוס ברוב התאים החיוביים אלפא p63, המאשר את הדלתא הספציפית ביותר קרנית Np63 אלפא חיובי תא פנוטיפ. סמנים אחרים באים לידי ביטוי בחלקו, בעוד שאחרים אינם ניתנים לגילוי בשלב זה, מה שמצביע על בידול התקדם לכיוון האתיטורים האפיתל הלימביים הבלתי צפויים, אך ההידול המסוף לתאי אפיתל בקרנית בוגרת עדיין לא התרחש. בממוצע, כל תא גזע פלוריפוטנטי אנושי ללא מאכיל מויש מייצר 0.7 תאים ביום 25.
לפחות 65%דלתא Np63 אלפא אוכלוסיית תאים חיוביים צפויה עד היום 24. ההקפאה מטהרת עוד יותר את אוכלוסיית התאים. בסך הכל, השיטות המוצגות כאן הן פשוטות יחסית, אבל יש כמה נקודות קריטיות להצלחה.
איכות גבוהה של החומר ההתחלתי היא חיונית, כמו גם עדין, טכניקות תרבות תאים שוטפת בכלל. פרוטוקול זה מספק אמצעים חזקים לייצור תאי גזע אפיתל גפיאלי עבור יישומים קליניים, כמו גם למטרות מחקר שונות. יתר על כן, השיטה ניתן לשנות בקלות עבור ההידור של תאי אפיתל פיגמנט רשתית.
