עבודה זו נתמכה על ידי הנשרים פרס החדשנות (הוראת אחוות הנשרים) ועל ידי קרן מאיו.

** וידאו פרוטוקול זה מבוסס על פרסום משויך 1: רגישות גבוהה לזיהוי ניתוח כמותי של חלבונים אינטראקציות יליד מתחמי multiprotein ידי cytometry הזרימה. אדם ג&#39;Schrum, דיאנה גיל, איליין פ Dopfer, דוד ל &#39;Wiest, לורנס א Turka, וולפגנג WA Schamel, אד פאלמר. STKE המדע של 2007 (389): pl2, 5 ביוני 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]. <a href="http://stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/2007/389/pl2">אנא לחץ כאן כדי לראות פרסום זה</a> . טרם החל, הכן את הפתרונות הבאים במלאי מימיות: <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> MES הצפת צימוד: </td><td> חנות של 25 ° C </td></tr><tr><td> MES, pH 6.0 </td><td> 50 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> מרווה / חסימה / Storage (QBS) חוצץ: </td><td> חנות ב -4 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1% </td></tr><tr><td> נתרן אזיד </td><td> 0.02% </td></tr><tr><td> PBS, pH 7.4 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> FCM חוצץ: </td><td> חנות ב -4 ° C </td></tr><tr><td> טריס, pH 7.4 </td><td> 50 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 100 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> נתרן אזיד </td><td> 0.02% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 5% </td></tr><tr><td> PBS, pH 7.4 </td><td> 1x </td></tr></tbody></table> הכן מיד לפני השימוש: <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> EDAC-MES: </td><td> להמיס 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​אבקה EDAC הצפת זיווגים MES </td></tr><tr><td> Digitonin פתרון (2% w / v): </td><td> ממיסים אבקת digitonin ב DH 2 O על ידי חימום ל 95 מעלות אז הקירור 5min על הקרח </td></tr><tr><td> תמוגה חוצץ: </td><td></td></tr><tr><td> טריס, pH 7.4 </td><td> 50 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Digitonin פתרון </td><td> 1% </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז </td><td> 1x </td></tr><tr><td> שמור על הקרח </td><td></td></tr></tbody></table> 1. צימוד של MAB כדי חרוזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז של חרוזים מן המניות שנרכשו על ידי דילול ב PBS ועוד היד נטויה עם hemacytometer. התחל עם דילול 1:10000 של חרוזים עבור סופרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 18 x 10 6 חרוזים לתוך צינור 1.5-מ&quot;ל microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים 2 עד 3 פעמים ב הצפת 0.5-1.0 זיווגים MES מ&quot;ל, centrifuging ב g 20,000 במשך 3 דקות במהירות של 25 ° C אחרי כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים הצפת 50 MES μL זיווגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת קבוצות carboxyl על החרוזים על ידי הוספת 20 μL של המוכן טרי EDAC-MES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות במשך 15 דקות במהירות של 25 ° C באופן ידני על ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים מופעל 2 עד 3 פעמים ב 0.5-1.0 מ&quot;ל PBS, centrifuging ב g 20,000 במשך 3 דקות במהירות של 25 ° C אחרי כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend החרוזים מופעל 50 PBS μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של MAB IP (בריכוז מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​0.2-1.0 המלאי) לפתרון חרוז הופעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים במשך 3 עד 4 שעות ב 25 ° C על ידי הנחת הצינור על שייקר רוטט. Shake מספיק כדי למנוע התיישבות של החרוזים על החלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף MAB מצמידים חרוזים 2 עד 3 פעמים ב 0.5-1.0 מ&quot;ל PBS, centrifuging ב g 20,000 במשך 3 דקות במהירות של 25 ° C אחרי כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים הצפת 100 QBS μL. אלה יכולים להיות מאוחסנים 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיית חרוזים היטב, לדלל 1:200-1:10,000 ב PBS ולספור עם hemacytometer. הריכוז חייב להיות נמדד עבור כל אצווה preparative, כך מספר חרוזים השתמשו בניסוי ה-IP או כל הנפתח ניתן לשלוט באופן מדויק. </li></ol> 2. פוסט גרעיני lysate הכנה Ip השיטה תמוגה ותנאי תמוגה האופטימלי יהיה תלוי בסוג התא חלבונים אינטראקציות נבדקות. מספר פרוטוקולים קיימים יכול להיות שונה עבור היישום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse 20 x 10 6 &quot;קטן&quot; תאים, כגון לימפוציטים, או 5 x 10 6 &quot;גדול&quot; תאים, כגון מקרופאגים או תאים סרטניים, במאגר תמוגה μL 100 טרי צינור 1.5-מ&quot;ל microcentrifuge עבור 20min על הקרח. סולם נפח תמוגה כנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר גרעינים ופסולת הסלולר מסיסים, בצנטריפוגה lysate ב g 20,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C. שמור את supernatant וזורקים את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 x 10 x 5-2.5 10 5 מב-בשילוב חרוזים lysate הבהיר, pipetting בעדינות לתערובת. היקף מינימלי אנו משתמשים כדילבצע IP אחת היא 5 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים על אנכי מסתובב 4 שעות גלגל לילה בחדר קר. הגדר מהירות מספיק כדי למנוע את החרוזים מן ההתיישבות. זה מקובל נוזלי של בנפח נמוך כתובות IP להישאר בתחתית הצינור במהלך סיבוב. </li></ol> 3. גשוש של חלבון ביד שנתפסו עם Fluorochrome-מצומדות נוגדנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים IP פעמיים ב mL 0.2-1.0 קר כקרח הצפת FCM, centrifuging ב g 20,000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות לאחר כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים 100 μL μL הצפת ו aliquot 20 FCM לתוך כל חמש או יותר 1.5 מ&quot;ל צינורות microcentrifuge או בארות צלחת ארובה התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף fluorochrome-מצומדות מבז על דגימות. בצע FCM את הכתם על פי ההוראות של היצרן או על פי ריכוזי נקבעים אמפירית. כנקודת מוצא, להוסיף 0.2-1 μL של פתרון נוגדן המניות (ב 0.2-1.0 מ&quot;ג / מ&quot;ל) לכל צינורית או היטב, דגירה 40 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף נחקר חרוזים ב 1.5-מ&quot;ל צינורות פעמיים בתוך מאגר 1.0 קר כקרח FCM מ&quot;ל, centrifuging ב g 20,000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות לאחר כל שטיפה. בעדינות להסיר את supernatant אחרי כל שטיפה, נזהרת שלא להפריע את החרוזים. עבור צלחת ארובה התחתונה, לשטוף פעמיים עם 0.2 מ&quot;ל קר כקרח הצפת FCM, centrifuging ב 1000g במשך 5 דקות ב 4 ° C אחרי כל שטיפה. Pipettor רב שימושית בשלב זה. כדי להסיר supernatant מן החרוזים בצלחת ארובה התחתונה, &quot;קפיצי&quot; הצלחת פעם אחת, ואז, בעודו הפוך, כתם כל נוטף מקצות את הבארות. נפח שיורית היטב כל, המכיל את החרוזים, יהיה כ - 20 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים הצפת 200 FCM μL לדגימה. העברה צינורות FACS שכותרתו. דוגמאות מוכנים כעת עבור FCM. </li></ol> 4. FCM רכישה חרוזים CML המתואר בפרוטוקול זה 3-5 מיקרומטר קוטר, כמחצית קוטר של לימפוציטים עכבר שקט. לפיכך, ייתכן שיהיה צורך להגדיל את פיזור ידני קדימה (FSC) לזכות המגבר ואת פיזור לוואי (SSC) מתח כדי האוכלוסייה של אירועים חרוז לרשום על סולם. חרוזים IP הפרט צריך להקים האוכלוסייה באשכולות הדוקה אחת. הגדרות והשער צריך להיות כוללים כפילויות חרוז ופסולת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני חרוזים ריצה או סטנדרטים חרוז, להסיר את הבלימה אגל שרוול העוטף את כניסת מדגם על cytometers כמה. אפשר נוזל נדן לטפטף בין הדגימות, כמו זו תנקה את כניסת ולמנוע חרוזים מלהיות נישא על מדגם אחד למשנהו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש חרוזים ללא תווית, פקד השליליות של הקרינה, וחלקיקים Rainbow כיול (RCPs), שליטה חיובית של הקרינה, כדי להתאים את ההגדרות כך ששני הקצוות הקרינה שלילי וחיובי להופיע בו זמנית על ציר ה-x יומן בקנה מידה. הדבר מבטיח כי הקרינה מן דגימות הניסוי יהיה גם על הסולם. שים לב RCPs הם קטנים יותר מאשר את החרוזים CML, כך FSC ופרמטרים SSC, כמו גם עמדת השער, ייתכן שיהיה צורך לשנות באופן זמני עבור מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור ללא תווית, חרוז הגדרות כיול פעם עם RCPs תושלם. אם רק אחד פלורסנט בדיקה לדגימה משמש, שום פיצוי הקרינה הוא הכרחי. באופן כללי, אנו בדיקה מתחמי multiprotein עם אחד fluorochrome-מצומדות MAB לדגימה FCM, ואנחנו בוחנים שותפים אינטראקציה מרובים מכתים דגימות חרוז במקביל מבז ספציפית עבור יחידות משנה שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת ולשמור הקרינה קבצי הנתונים. ניתוח יכול להתבצע באמצעות זרימת cytometry תוכנה כגון CellQuest, FlowJo, או CFlow. </li></ol> 5. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2066/2066fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. IP-FCM מורכבים TCR/CD3 multiprotein. בתאי T מהלחץ עכבר BALB / c היו lysed digitonin ב 1%, ואת lysate היה נתון IP-FCM באמצעות אנטי CD3ε חרוזים. מתחמי שנתפסו הכילו כמויות משמעותיות של TCR-β (אזור סגול) ושיתוף הקשורים CD3-ε (ירוק), אך קרוב לרמות הרקע (שהוגדר על ידי החללית אימונוגלובולינים רלוונטי, ורוד זכר) של חלבונים אחרים כגון Thy1.2, CD45, או H-2K (ד) (חום, כתום, כחול עקבות, בהתאמה). ראה תוצאות דומות שפורסמו בעבר 1-6.

<ol>
	<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).</li><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).</li><li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+division+and+death+are+segregated+by+mutation+of+TCRbeta+chain+constant+domains.">T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains.</a> Immunity. 21, 515-526 (2004).</li><li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+T+Cell+receptor+signals+determine+CD8++memory+versus+effector+development.">Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development.</a> Science. 323, 502-505 (2009).</li><li>Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctate+is+a+key+element+in+calcium+entry+induced+by+activation+of+InsP3+receptors+and/or+calcium+store+depletion.">Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion.</a> J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).</li><li>Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+engagement+by+peptide-MHC+ligands+induces+a+conformational+change+in+the+CD3+complex+of+thymocytes.">T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes.</a> J Exp Med. 201, 517-522 (2005).</li></ol>

מידע על חלבונים אינטראקציות רלוונטי במיוחד בניתוח של תהליכים תאיים רבים כגון התמרה האות, התבגרות השושלת, תא מחזור התקדמות, ומפלים אפופטוזיס. IP-FCM מספק דרך מהירה, כמותית, ורגיש כדי לבחון את האינטראקציה של חלבונים להגדיר חברי מתחמי multiprotein ב קונפורמציה האם שלהם. יכול להיות בשילוב חרוזים ו מודגרות עם lysates תא יום אחד יכול להיות נחקר ונותחו למחרת. תבנית 96, גם צלחת מאפשר מספר גדול של דגימות כדי להיות מנותח בו זמנית כדי לספק יעילות איסוף נתונים למטרות סטטיסטיות או ההקרנה. שימוש בסטנדרטים חרוז ניאון, מספר חלבונים שנתפסו על ידי כל חרוז ניתן להעריך. מקור החומר מעט מאוד צורך ללכוד זיהוי, כך דגימות מוגבל analytes נדיר עדיין יכול להיות מנותח עבור אינטראקציות מרובות. למרות IP-FCM אינו מחייב הנדסה גנטית, epitope תיוג, denaturation, או חוץ גופית ערבוב של חלבונים בסביבה לא פיזיולוגיים, זה יכול להיות יחד עם אלה וטכניקות אחרות, מה שהופך אותו כלי רב ערך ונגיש עם תחולה ל מערכות ביולוגיות רבות. פתרון בעיות: רבים IP-FCM ניסויים ליצור אינטראקציה מועילה נתונים חלבון הפעם הראשונה שהם ניסו. עם זאת, אופטימיזציה של FCM-IP יכולה לשפר נטיה נוגדנים חרוזים, ללכוד חלבון מורכב, מחייב בדיקה ניאון. היעילות של נטיה נוגדן ה-IP ניתן לקבוע על ידי חיטוט בשילוב חרוזים ישירות עם נוגדנים נגד אימונוגלובולינים. אם יעילות זו היא נמוכה, להגדיל את הריכוז של נוגדנים במהלך התגובה צימוד יכולים להרשות נוגדנים IP יותר לצרף כל חרוז. זה יכול להגדיל את קיבולת המחייב של אצווה חרוז IP, וכתוצאה מכך ללכוד זיהוי משופרת של analytes. אחרים ראשוני אמין מולקולות המכילות (למשל טריס, שור אלבומין) לא צריך להיות נוכח במהלך התגובה צימוד, כמו אלה יכולים להתחרות עבור MAB מצורף חרוז לגרום צימוד נמוך מב. אם נטיה של MAB כדי חרוזים מוכיח בעייתית מסיבות אחרות, חרוזים יכול להיות במקום מצמידים את avidin / streptavidin, ונוגדנים biotinylated יכול להיות לאחר מכן לא קוולנטית כבול המשמש immunprecipitation. למרות נטיה נוגדן טוב, זיהוי ראשוני של הקרינה חרוז הקשורים עלולה להיות נמוכה. לכידת ראשית, מורכב כשלעצמו עשוי להיות נמוך. מכיוון IP-FCM תלויה בריכוז של analytes, להגדיל את מספר התאים lysed לכל יחידת נפח תמוגה יכולים להגדיל ללכוד זיהוי אנליטי ו. בנוסף, ללכוד יכול להיות משופרת על ידי הפחתת מספר חרוזים IP מודגרות עם lysate, אשר מפיצה את מתחמי שנתפסו ברחבי חרוזים פחות, וכתוצאה מכך הקרינה הממוצעת עלתה ל חרוז כאשר נחקר. שנית, יתכן כי גישה של הנוגדן בדיקה של מתחמי שנתפסו מתעכבת sterically על ידי הנוגדן immunoprecipitating. במקרה זה, הבעיה ניתן לטפל באמצעות נוגדנים שונים כדי ללכוד ו / או בדיקה.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Interfacial Dynamics Corporation/Molecular Probes</td>
<td>2-5000</td>
<td>Store at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Rainbow Calibration Particles</td>
<td>Reagent</td>
<td>Spherotech, Inc.</td>
<td>RCP-30-5A</td>
<td>Store at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M-5287</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Pierce Sigma</td>
<td>22980 E-6383</td>
<td>Store at -20&deg;C under desiccating conditions.</td>
</tr>
<tr>
<td>Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-2714</td>
<td> Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20&deg;C. Handle with gloves.</td>
</tr>
<tr>
<td>PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-408-230</td>
<td>For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

ip-fcm:  immunoprecipitation detected by flow cytometry

Immunoprecipitation זוהה על ידי cytometry זרימה (IP-FCM) הוא שיטה יעילה לגילוי וכימות חלבונים אינטראקציות. העיקרון הבסיסי משתרע של כריך ELISA, שבה אנליטי העיקרי בשבי ניתן לאתר יחד עם מולקולות אחרות הקשורות פיזית בתוך מתחמי multiprotein. ההליך כרוך צימוד קוולנטי של microbeads לטקס קלקר עם immunoprecipitating נוגדנים חד שבטיים (מב) ספציפיים לחלבון של עניין, דוגרים אלה חרוזים עם lysates תא, חיטוט קומפלקסים חלבונים שנתפסו עם fluorochrome-מצומדות בדיקות, וניתוח חרוז הקשורים הקרינה על ידי cytometry הזרימה. IP-FCM הוא רגיש ביותר, מאפשר ניתוח של חלבונים במצב הטבעי שלהם (לא מפוגל), וכן ניתנת לניתוח או חצי כמותי או כמותי. כפי יתרונות נוספים, IP-FCM לא דורש הנדסה גנטית או ציוד מיוחד, מלבד cytometer זרימה, וזה ניתן להתאים בקלות עבור תפוקה גבוהה יישומים.

Watch this Scientific Journal Video about IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry at JoVE.com

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

שיטת ה-IP FCM מוצג, המאפשר רגיש, הערכה החזקה, ביוכימיות של חלבונים אינטראקציות הילידים, ללא צורך בהנדסה גנטית או גודל מדגם גדול.

IP-FCM: immunoprecipitation זוהה על ידי זרימת cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

ip-fcm-immunoprecipitation-detected-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Biology

17.3K Views.  Mayo Clinic. שיטת ה-IP FCM מוצג, המאפשר רגיש, הערכה החזקה, ביוכימיות של חלבונים אינטראקציות הילידים, ללא צורך בהנדסה גנטית או גודל מדגם גדול.

Video: IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease mechanisms and may elucidate new markers to substratify disease with different clinical features and better understand pathogenesis. We have developed a highly quantitative method called Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS) for profiling patient sera antibody responses to autoantigens and pathogen antigens associated with infection. Unlike ELISAs, the highly sensitive LIPS is easily implemented to survey humoral serological response profiles to different antigens in a universal format and produces dynamic antibody titer ranges up to 6 log10 for some antigens. In these studies, quantitative profiling by LIPS of patient humoral responses against panels of antigens or even the entire proteome of some pathogens (i.e. HIV), is typically more informative than testing a single antigen by ELISA. In addition, LIPS also eliminates time and effort needed to produce highly purified antigens as well as the labor-intensive assay optimization steps needed for standard ELISAs. Here we provide a detailed protocol describing the technical aspects of performing LIPS assays for readily profiling antibody responses to single or multiple antigens.

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

The technical aspects of performing LIPS (Luciferase Immunoprecipitation Systems) are described. The overall approach involves expressing chimeric genes encoding antigens fused to Renilla luciferase (Ruc) in mammalian cells. Crude Ruc-antigen extracts are then prepared and, without purification, employed in immunoprecipitation assays to quantify antibodies.

נוגדן פרופיל על ידי מערכות immunoprecipitation בלוציפראז (שפתיים)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

מדידה כמותית של טרנסלוקציה GLUT4 על קרום התא על ידי זרימת cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

מדידות סידן cytosolic בתאי האפיתל כליות על ידי cytometry הזרימה

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Immunodetection של החלבונים בממברנה חיצוניים על ידי cytometry הזרימה של מיטוכונדריה מבודדת

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

LED Thermo Flow &amp;#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LED Thermo Flow - שילוב Optogenetics עם cytometry זרימה

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

מדידת Endoreduplication על ידי Cytometry זרימה של פקעת מבודד Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion and the spread of neurodegenerative diseases. The commonly used laboratory strains of the amoeba Dictyostelium discoideum have extremely high fluid uptake rates when grown in nutrient medium, over 90% of which is due to macropinocytosis. In addition, many of the known core components of mammalian macropinocytosis are also present, making it an excellent model system for studying macropinocytosis. Here, the standard technique to measure internalized fluid using fluorescent dextran as a label is adapted to a 96-well plate format, with the samples analyzed by flow cytometry using a high-throughput sampling (HTS) attachment.
Cells are fed non-quenchable fluorescent dextran for a pre-determined length of time, washed by immersion in ice-cold buffer and detached using 5 mM sodium azide, which also stops exocytosis. Cells in each well are then analyzed by flow cytometry. The method can also be adapted to measure membrane uptake and phagocytosis of fluorescent beads or bacteria.
This method was designed to allow measurement of fluid uptake by Dictyostelium in a high-throughput, labor and resource efficient manner. It allows simultaneous comparison of multiple strains (e.g. knockout mutants of a gene) and conditions (e.g. cells in different media or treated with different concentrations of inhibitor) in parallel and simplifies time-courses.

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis, large-scale non-specific fluid uptake, is important in many areas of clinical biology including immunology, infection, cancer, and neurodegenerative diseases. Here, existing techniques have been adapted to allow high-throughput, single-cell resolution measurement of macropinocytosis in the macropinocytosis model organism Dictyostelium discoideum using flow cytometry.

מדידת תפוקה גבוהה Dictyostelium discoideum Macropinocytosis על ידי Cytometry זרימה

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...