פרוטוקול זה יכול לשמש כדי למדוד את מספר האתרים האנטיגניים על קולטן הסלולר של עניין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מייצרת תוצאות חזקות, אפילו עבור קולטנים לידי ביטוי בצפיפות נמוכה. שיטה זו מאפשרת הערכה של הפחתת ביטוי אריתרוסיטים CR1 וזה כגון אלצהיימר, זאבת אדרתמטוסוס מערכתית, איידס ומלריה.
פרוטוקול זה שימושי עבור כל ניתוח של צפיפות קולטן התא והוא יכול להיות מיושם גם על המחקר של ביטוי קולטן התא על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אנו ממליצים על ריווח הצינורות במהלך התפלגות התאים והנוגדנים, ולהוות על ידי מומחה ציטומטרי במהלך הניתוח הראשון במידת האפשר. הדגמה חזותית של כשל חיסוני וכימות צפיפות על ידי ציטומטריית זרימה היא קריטית להבנת האופן שבו ניתן להגדיר כראוי את פרמטרי הניתוח.
לפני תחילת הניתוח, להוסיף 250 microliters של נתרן EDTA נוגד קרישה דם שלם מצינורות אחסון דם לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר של ארבע מעלות צלזיוס PBS-BSA. מערבבים את תכולת הצינור על ידי היפוך עדין ומסובבים את התאים על ידי צנטריפוגה. השתמש פיפטה 10 מיליליטר כדי להשליך את supernatant בזהירות resuspend את גלולה בנפח שיורית של פתרון.
הוסף 20 מיליליטר של PBS-BSA קר צנטריפוגה התאים שוב. בסוף הצנטריפוגה, מניחים את הצינור במתלה, מניחים על קרח ומעבירים שמונה מיקרוליטרים של אריתרוקיטים שטופים לצינור 50 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של PBS-BSA. ואז לערבב את אריתרוציטים בעדינות על ידי ספינינג כדי לקבל השעיית תא הומוגני.
עבור immunostaining אריתרוקיטים, בזהירות להעביר 100 microliters של אריתרוציטים מדולל לתוך צינורות בודדים 1.5 מיליליטר ולאסוף את תאי הדם האדומים על ידי צנטריפוגה. לאחר השלכת supernatants, בזהירות להוסיף 20 microliters של 0.5 מיקרוגרם לכל ריכוז microliter של נוגדן biotinylated נגד CR1 J3D3 ב PBS-BSA, ישירות לכל גלולה. הוסיפו 20 מיקרוליטרים של מאגר PBS-BSA לבד לתאי הבקרה השליליים עם ערבוב עדין והדגירה של הדגימות במשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות פעמיים עם 750 microliters של PBS-BSA טרי לצינור, לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, מוסיפים 20 מיקרוליטרים של דילול של פיקוארין סטרפטבידין ב- PBS-BSA לכל צינור עם ערבוב עדין, ומדגרים את הדגימות במשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות פעמיים, כפי שהודגם.
לאחר הכביסה השנייה, לתקן כל גלולה מדגם התא עם 450 microliters של חיץ קיבוע במהלך מערבולת, לפני העברת כל מדגם לתוך צינורות תחתונים עגולים בודדים חמישה מיליליטר עד 48 שעות של אחסון בארבע מעלות צלזיוס. כדי לנתח את אריתרוציטים מוכתמים לכשלים בזרימה, לחץ על לחצן הניסוי החדש בציטומטר הזרימה ושנה את שם הניסוי החדש. בחר פיזור קדימה, פיזור צדדי ו- PE בחלון הגדרות הציטומטר.
בניסוי הפתוח, בחר הגדרות יישום של הגדרות ציטומטר וצור גליון עבודה גלובלי, תוך שימוש בתיבות האפורות ובצלבים כדי להנחות את המיטוב. כאשר כל הפרמטרים נקבעו, לטעון את צינור הבקרה לא מוכתם על הציטרומטר ולהפעיל את הרכישה, אופטימיזציה של מתחי פיזור קדימה וצד כדי לחסל פסולת כדי להבטיח כי האוכלוסייה של עניין הוא בקנה מידה. לאחר מכן, צייר שער סביב תאי הדם האדומים בחלקת הפיזור קדימה לעומת הצד והצג את אוכלוסיית תאי הדם האדומים בחלקת הנקודה של פלואורסצנטיות PE.
אם האוכלוסיות החיוביות נמצאות בקנה מידה גדול, טען את צינור הבקרה המוכתם על הציטרומטר והפעל את הרכישה. כדי להקליט ולנתח דגימות, בטל את טעינת הדגימה המוכתמת וצור חלקת פיזור קדימה לעומת צד והיסטוגרמה פלואורסצנטית PE בגליון עבודה גלובלי חדש. לטעון את הדגימה הראשונה על הציטרומטר, להפעיל את הרכישה ולצייר שער תא דם אדום סביב אריתרוציטים בחלקת פיזור קדימה לעומת הצד.
הצג את אוכלוסיית תאי הדם האדומים בהיסטוגרמה פלואורסצנטיות PE ותחת לשונית הסטטיסטיקה, בחר את הממוצע עבור הפרמטרים פלואורסצנטיות PE על אוכלוסיות תאי דם אדומים. בלוח המחוונים של הרכישה, בחר את כל האירועים בשער העצירה ו- 10,000 אירועים לתיעוד ולחץ על נתוני רשומה. לאחר שהקלטת האירוע הושלמה, הסר את הצינור מהציטרומטר.
ההתוויות הכלליות של גליון העבודה צריכות להיראות כמודגמות. ניתוח ציטומטרי זרימה של אריתרוציטים מוכתמים בכשלושה נושאים של צפיפות CR1 ידועה מאפשר מדידה של עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של התיוג עבור כל נושא. התוויית עקומה באמצעות ערכי הנושא עם הצפיפות הידועה של אריתרוקיטים CR1 מאפשרת דיווח על נתונים אלה כפונקציה של עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת.
השוואה בין קו הרגרסיה הנובע מעקומה זו לערכים של עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של הנבדקים האחרים מאפשרת קביעת צפיפות אריתרוקיטים CR1 שלהם. יש לדאוג כי אריתרוציטים ונוגדנים מופצים כראוי, כך עקומות הכיול של דגימות ניסויים על הבקרה השלילית נמצאים בטווח של הגדרות הציטרומטר. ניתן להתאים הליך זה למדידת קולטנים תאיים אחרים בצפיפות, פשוט על ידי שינוי הנוגדן העיקרי ו/או התאמת שכבות ההגברה.
בכל פעם שאתה מטפל בדם, קיים סיכון לזיהום פתוגן. לכן, הקפד להשתמש בשיטות מעבדה טובות וללבוש את ציוד המגן האישי המתאים.
