המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר Rizaldy סקוט בהר סיני החולים בטורונטו, אונטריו עבור מתנתו של הראשוני Rac1 flox / flox fibroblasts העכבר עובריים. עבודה זו נתמכה על ידי הפעלה מענקים NJ מן המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR, MOP 2009-93526) ואת מדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC, RG 327372-06). SH ו MW נתמכים על ידי CGSMA ו cgs-M פרסים CIHR ו NSERC, בהתאמה. סטיב צוואות האולי ומלאני תרמו באופן שווה על הנייר הזה.

הפשרת התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג fibroblasts עכבר קפוא עובריים (MEFs) (שנוצר בעבר מתרבויות העובר הפרט העיקרי) של חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הפשירי ידי טבילה בקבוקון מים ב 37 ° C עד מתערבל עם תוכן הם מופשר לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9mL של DMEM כי כבר השלימו עם סרום 10% שור עוברית 1% פניצילין, סטרפטומיצין על צלחת תא 10 ס&quot;מ תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ההשעיה תא מופשר ירידה מבחינת הצלחת, סלע את הצלחת בעדינות לפיזור תאים צלחת מקום 37 ° C CO, 5% 2 החממה לילה. שים לב שאם תאים רגישים DMSO (מתהליך קריותרפיה), אמצעי התקשורת הראשוני יכול להיות מוחלף עם התקשורת לאחר טרי התאים דבק הצלחת (כארבע שעות ציפוי לתגובה). כמו כן שים לב כי מפגש של התאים לאחר ההפשרה תלויה במספר תאים קפואים, קצב התאוששות של תאים לאחר הקפאה, ושיעור הצמיחה של התאים. </li></ol> Passaging תאים <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים גדלו למעשה 100% confluency (כלומר: למחרת), לשאוב את התקשורת לשטוף תאים עם 5 מ&quot;ל של PBS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהוסיף 1mL של טריפסין המכיל 10mm EDTA צלחת מקום בחממה במשך כ 5 דקות, כדי לאפשר לתאים לנתק מהצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים יש מנותקת, להוסיף 9mL התקשורת לתאי trypsinized, פיפטה 2-3 פעמים כדי לפזר גושים, מוסיפים 1mL של השעיה זו ירידה מבחינת לצלחת חדש המכיל 9mL של התקשורת, במקום הזה לתוך 37 ° C חממה לילה . הנוכחות של FBS בתקשורת יהיה להשבית טריפסין לחילופין, תאים ניתן לכבס הראשון לדלל את טריפסין. </li></ol> ספירת תאים ו ציפוי על גבי תלושי לכסות <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים חממה, לרחוץ trypsinize כמו קודם, אלא שהפעם להוסיף 5-6mL התקשורת חזרה את התאים trypsinized במקום 9mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים פיפטה ביסודיות כדי להבטיח ניתוק מוחלט לתוך ההשעיה תא בודד, ולהסיר 15μL לשלב עם 15μL של trypan כחול בצינור microfuge נפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את ההשעיה תא / trypan כחול על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים, כדי להוסיף 15μL hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למיקרוסקופ, תאים מתים יופיעו בצבע כחול. ספירת התאים ברור / צבע (חי) באחד רשתות 4X4 על hemocytometer. חזור על פעולה זו מספר על שלוש רשתות אחרות 4X4 (מצוין, B, C ו-D) ולהשתמש המשוואה הבאה כדי לחשב את מספר התאים לכל μL של השעיה: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq0.jpg" alt="משוואה 1" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אופטימיזציה של פרוטוקול, יש לנו קבעו כי ציפוי 30,000 תוצאות תאים צפיפות התאים המתאימים להדמיה בסיומו של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את נפח תא ההשעיה הדרושים 30,000 תאים, השתמש המשוואה הבאה: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq1.jpg" alt="משוואה 2" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו במקום זכוכית סטרילית לכסות להחליק לתוך היטב כל מנה שישה היטב ולהוסיף 2ml של התקשורת זה היטב, ולאחר מכן להוסיף טיפה חכם מן ההשעיה הסלולרי שלך נפח הנדרש 30,000 תאים לתוך כל טוב. שים לב לכסות תלושי כוס משמשים בניסוי זה כפי שאנו יהיה לדמיין את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשלב מאוחר יותר, לא כל היישומים דורשים בהכרח מיקרוסקופ, ובכך מכסה מחליק לא ייתכן שתידרש. </li></ol> וירוס התמרה <ol start="15" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כמה שעות (או זמן מספיק על מנת להבטיח כי התאים לדבוק תלושי כיסוי) למשך הלילה, להסיר ולשטוף התקשורת תאים עם 1mL של סרום ללא DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1mL של סרום ללא מדיה גם עבור כל תוספת של הנגיף. לצורך ניסוי זה, adeno-Cre וירוס הושג מסחרית מן Biolabs וקטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופטימיזציה של פרוטוקול קודם הראה כי ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 500 מספק התמרה גן היעילה ביותר תוך MEFs ראשוני עם מעט או ללא השפעה על כדאיות התא. משרד הפנים יכול להיות מחושב באופן הבא: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq2.jpg" alt="משוואה 3" /> <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq3.jpg" alt="משוואה 4" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את נפח מחושב של הנגיף ישירות היטב כל זה להיות נגוע, רוק בעדינות את הצלחת לפזר את התאים וירוס מקום לתוך 37 ° C חממה לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, להסיר את הווירוס המכילים מדיה מן התאים ולשטוף תאים 1mL סטרילי PBS ולאחר מכן להוסיף 2ml התקשורת קבוע היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של Rac1 תאים שהודגם בניסוי הזה, התרחשו שינויים מורפולוגיים בתאים על כ 72 שעות שלאחר התמרה. </li></ol> נציג תוצאות תאים היו לדמייןד על ידי צביעה עם צבע אקטין phalloidin (למטרות הדמיה בלבד) צילמו באמצעות TCS-Leica SP5 multiphoton מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר במרכז ניתוח מתקדם באוניברסיטת Guelph. איור 1 מציג את המורפולוגיה התכווצה מוארכת של Rac1 flox / flox תאים שנחשפו לנגיף adeno-Cre לעומת התאים אותו לא נחשף לנגיף. <img src="/files/ftp_upload/2160/2160fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. השוואה בין תאים Rac1 flox / flox נגוע adeno-Cre וירוס (משמאל) לעומת תאים נגוע מאותו מקור (מימין).

<ol>
	<li>Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Deletion+of+Rac1+GTPase+Reveals+Its+Critical+Role+in+Actin+Stress+Fiber+Formation+and+Focal+Adhesion+Complex+Assembly.">Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly.</a> J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).</li><li>Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. o. w. n. e. y., Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+deletion+in+mouse+neutrophils+has+selective+effects+on+neutrophil+functions.">Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions.</a> J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).</li><li>Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+Cre+deletion+of+floxed+sequences+in+primary+mouse+cells+is+an+efficient+alternative+for+studies+of+gene+deletion.">Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion.</a> Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).</li><li>Rijnkels, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Cre-mediated+recombination+in+mammary+epithelial+early+progenitor+cells.">Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).</li><li>Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1-null+mouse+embryonic+fibroblasts+are+motile+and+respond+to+platelet-derived+growth+factor.">Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).</li><li>Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+gene+recombination+by+adenovirus-driven+Cre+in+the+mouse+uterus.">Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus.</a> Genesis. 44, 51-56 (2006).</li></ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי המועצה הקנדית על בריאות בעלי חיים.

הסרטון מלווה מדגים כיצד וירוס רקומביננטי יכול לשמש גן הבלו ספציפי במבחנה באמצעות Cre recombinase. הפיתוח של פרוטוקול זה אך לא לחשוף כמה נקודות מסוים ראוי להתייחסות. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נהלי בטיחות פרופר תמיד צריך להיות מועסק בעבודה עם adenoviruses. חלוק מעבדה וכפפות יש ללבוש כל הזמן תוך כדי עבודה עם הנגיף. מדיה כלי פלסטיק צריכים להיות מטופלים עם אקונומיקה 10% לפחות במשך 30 דקות, כלי פלסטיק צריכים להיות autoclaved לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע חזר להקפיא הפשרת המניה וירוס כמו זה יכול להשפיע על titer וירוס ובכך להפחית את היעילות התמרה. כמויות קטנות של המניה אמור בתחילה להיות וירוס aliquoted לתוך צינורות נפרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MOIs החל 5-50 נבדקו במהלך התפתחות שיטת ושיעורי התמרה יעיל נצפו ברוב המקרים, ללא השפעות שליליות על כדאיות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Adeno-GFP נעשה שימוש גם במהלך פיתוח שיטה מהירה מסך יעילות התמרה. שליטה זו (או וקטור ריק) צריכה להתנהל במהלך הניסוי על מנת להבטיח כי זיהום ויראלי לבד אינו תוצאה של השינויים התאיים. באופן דומה, אם מוציא את הגן floxed עניין בתאים שלך אינו תוצאה של שינויים הסלולר (כלומר שינויים במורפולוגיה או הכדאיות), ואז מדביק את סוג התא אותו עם adeno-GFP הוא פקד חשוב להשתמש על מנת להוכיח כי התמרה וירוס התרחשות. </li></ul> מעבר לבחינת איתות מפלי בתרבות, הגישה adeno-Cre גם הועסק in vivo כדי להסיר תנאי גנים מחיות הניסוי 3,4, ו לתייג אוכלוסיות ספציפיות של תאים בתוך האורגניזם 6. המערכת adenovirus יכול גם להיות מותאם להציג גנים אחרים מאשר Cre recombinase לתאי המארח. שני היתרונות העיקריים של שימוש זה וקטור משלוח הם התמרה גבוהה ואספקה ​​יעילות גן, וחוסר אינטגרציה עם ה-DNA המארח. אולם, את הדור של adenoviruses רקומביננטי רומן יכול להיות עבודה אינטנסיבית. הפרוטוקול המתואר כאן ולכן רותמת את העוצמה של המערכת adenoviral ידי ניצול שפותחו בעבר adeno-Cre וירוסים, צימוד זה עם אלל floxed שלנו של עניין, Rac1. דרך לדפוק את הניסוי הזה מותנה, יש לנו אישר כי התמרה באמצעות וירוס adeno-Cre של MEFs נושאת אלל Rac1 floxed אכן לגרום כריתה של Rac1 המוביל את השינויים האופייניים מורפולוגיה תאית של תאים Rac1 מחסר 2,5.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ad-CMV-Cre virus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Biolabs</td>
<td>1045</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DME High glucose media 500mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SH3002201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS Canadian origin 500mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>CAA15-701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEN-STREP 1X solution 100mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SV30010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Texas Red-X phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T7471</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4549</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts

היכולת גנטית להסיר רכיבים ספציפיים של מפלי איתות שונים בתא כבר כלי אינטגרלי ניתוח אות המודרנית התמרה. שיטה אחת מסוימת כדי להשיג זאת היא באמצעות מחיקה מותנה שימוש במערכת Cre-loxP. שיטה זו כרוכה איגוף את הגן של עניין עם אתרי loxP, שהם רצפי הכרה ספציפית לחלבון recombinase Cre. חשיפה של ה-DNA המכונים (מוקף אתר loxP) floxed זה תוצאות האנזים במקרה Cre בתיווך רקומבינציה באתרי loxP, ואת הבאים כריתה של הגן להתערב 3. קיימים מספר שיטות שונות כדי לנהל Cre recombinase לאתר של עניין. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את השימוש adenovirus המכיל את הגן Cre recombinase להדביק fibroblasts העכבר העיקרי עובריים (MEFs) המתקבלים עוברים המכילים אלל floxed Rac1 1. הרציונל שלנו לבחירת Rac1 MEFs לניסויים שלנו היא כי שינויים מורפולוגיים ברור ניתן לראות על מחיקה של Rac1, עקב שינויים cytoskeleton אקטין 2,5. 72 שעות לאחר התמרה ויראלי ביטוי Cre, התאים היו מוכתמים באמצעות צבע אקטין phalloidin הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. היה נראה כי MEFs שנחשפו לנגיף adeno-Cre הופיע התכווץ ומוארך במורפולוגיה לעומת תאים נגוע, עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים 2,5. השיטה adenovirus המסירה recombinase Cre יתרון כמו וירוס adeno-Cre זמין בקלות, באמצעות מחיקת הגן Cre של כמעט 100% של התאים ניתן להשיג עם זיהום adenoviral אופטימיזציה.

Watch this Scientific Journal Video about Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts at JoVE.com

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

בסרטון זה אנו משתמשים adenovirus נושאת את הגן Cre recombinase להדביק fibroblasts העכבר העיקרי העוברית נושאת אלל floxed Rac1.

Adenovirus בתיווך הסרת גנטית של מולקולות איתות ב Cultured Fibroblasts עכבר ראשיים עובריים

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

adenovirus-mediated-genetic-removal-signaling-molecules-cultured

Research

JoVE Journal

Biology

24.8K Views.  University of Guelph. בסרטון זה אנו משתמשים adenovirus נושאת את הגן Cre recombinase להדביק fibroblasts העכבר העיקרי העוברית נושאת אלל floxed Rac1.

Video: Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  Vital fluorescent probes, particularly green fluorescent protein (GFP) have revolutionized cell biology stemming from the ability to label specific intracellular compartments and cellular structures. For example, the live imaging of GFP (and its spectral variants) chimeras have allowed for a dynamic 
analysis of the cytoskeleton, organelle transport, and membrane dynamics in a multitude of organisms and cell types [1-3].  Although live imaging has become prevalent, this approach still poses many technical challenges, particularly in primary cultured neurons.  One challenge is the expression of GFP-tagged proteins in post-mitotic neurons; the other is the ability to capture fluorescent images while minimizing phototoxicity, photobleaching, 
and maintaining general cell health.  Here we provide a protocol that describes a lipid-based transfection method that yields a relatively low transfection rate (~0.5%), however is ideal for the imaging of fully polarized neurons.  A low transfection rate is essential so that single axons and dendrites can be characterized as to their orientation to the cell body to confirm directionality of transport, i.e., anterograde v. retrograde.  Our approach to imaging 
GFP expressing neurons relies on a standard wide-field fluorescent microscope outfitted with a CCD camera, image capture software, and a heated imaging chamber. We have imaged a wide variety of organelles or structures, for example, dense-core vesicles, mitochondria, growth cones, and actin without any special optics or excitation requirements other than a fluorescent light source. Additionally, spectrally-distinct, fluorescently 
labeled proteins, e.g., GFP and dsRed-tagged proteins, can be visualized near simultaneously to characterize co-transport or other coordinated cellular events.  The imaging approach described here is flexible for a variety of imaging applications and can be adopted by a laboratory for relatively little cost provided a microscope is available.

Live cell imaging is of particular utility when studying the dynamics of organelle trafficking. Here we describe a protocol for live imaging of dense-core vesicles in cultured neurons using wide-field fluorescence microscopy. This protocol is flexible and can be adapted to image other organelles such as mitochondria, endosomes, and peroxisomes.

הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc, and Klf4 is capable of inducing pluripotency in mouse fibroblasts.1 Subsequent reports have demonstrated the utility of the doxycycline (DOX) inducible lentiviral delivery system for the generation of both primary and secondary iPS cells from a variety of other adult mouse somatic cell types.2,3
Induced pluripotent stem (iPS) cells are similar to embryonic stem (ES) cells in morphology, proliferation and ability to induce teratoma formation. Both types of cell can be used as the pluripotent starting material for the generation of differentiated cells or tissues in regenerative medicine.4-6 iPS cells also have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming mouse embryonic fibroblast (MEF) cells with the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set. We also demonstrate that the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set is capable of expressing each of the four transcription factors upon transduction into MEFs thereby inducing a pluripotent stem cell state that displays the pluripotency markers characteristic of ES cells.

The Stemgent Dox Inducible Mouse TF Lentivirus Set can reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEFs) to induced pluripotent stem (iPS) cells. Here we demonstrate the protocol for DOX-inducible expression of mouse reprogramming transcription factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc to generate iPS colonies that express common mES pluripotency markers.

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts עכבר עובריים עם פקטור ארבעה תמלול, דוקסיציקלין ועין מתנהלת מערכת התמרה lentiviral

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals. Here, we describe an in vitro assay, "the reorientation assay", that has been used extensively to study the effect of extrinsic and intrinsic signals on the orientation of commissural axons2. This assay was developed by numerous people in the laboratories of Jane Dodd, Thomas Jessell and Andrew Lumsden (see acknowledgements for more details) and versions of this assay were used to demonstrate the reorientation activities of key axon guidance molecules, including the BMP chemorepellent in the roof plate3,4 and the chemoattractive activities of Netrin15 and Sonic Hedgehog (Shh)6 in the floor plate in the spinal cord.
Explants comprising 2-3 segments of the dorsal two-thirds of spinal cord are dissected from embryonic day (E) 11 rats and cultured in three dimensional collagen gels7. E11 dorsal spinal explants contain newly born commissural neurons, which can be identified by their axonal expression of the glycoprotein, Tag18. Over the course of 30-40 hours in culture, the commissural axon trajectory is recapitulated in these dorsal explants with a time course similar to that seen in vivo. This axonal trajectory can be challenged by placing either test tissues or a COS cell aggregate expressing a candidate signaling molecule in contact with one of the lateral edges of the dorsal explant. Commissural axons extending in the vicinity of the appended tissue will grow under the influence of both the endogenous roof plate and signals from the ectopic lateral tissue. The degree to which commissural axons are reoriented under these circumstances can be quantified. Using this assay, it is possible both to examine the sufficiency of a particular signal to reorient commissural axons3,4 as well the necessity for this signal to direct the commissural trajectory9.

This assay assesses the ability of a signaling molecule, here Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP7), to reorient commissural axons. An explant of embryonic dorsal spinal cord is cultured adjacent to an aggregate of COS cells secreting the candidate growth factors. Reoriented commissural axons growing within the explant are visualized by immunohistochemistry.

Assaying את היכולת של מולקולות איתות Diffusible כדי כיוון מחדש עובריים האקסונים Commissural השדרה

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system maintains hESCs from undergoing spontaneous differentiation during cell expansion. However, this co-culture method is labor intensive, requires highly trained personnel, and yields low hESC purity4. Many laboratories have attempted to minimize the number of feeder cells in hESC cultures (i.e. incorporating matrix-coated dishes or other feeder cell types5-8). These modified culture systems have shown some promise, but have not supplanted the standard method for culturing hESCs with mitomycin C-treated mouse embyronic fibroblasts in order to retard unwanted spontaneous differentiation of the hESC cultures. Therefore, the feeder cells used in hESC expansion should be removed during differentiation experiments. Although several techniques are available for purifying the hESC colonies (FACS, MACS, or use of drug resistant vectors) from feeders, these techniques are labor intensive, costly and/or destructive to the hESC. The aim of this project was to invent a method of purification that enables the harvesting of a purer population of hESCs. We have observed that in a confluent hESC culture, the MEF population can be removed using a simple and rapid aspiration of the MEF sheet. This removal is dependent on several factors, including lateral cell-to-cell binding of MEFs that have a lower binding affinity to the styrene culture dish, and the ability of the stem cell colonies to push the fibroblasts outward during the generation of their own "niche". The hESC were then examined for SSEA-4, Oct3/4 and Tra 1-81 expression up to 10 days after MEF removal to ensure maintenance of pluripotency. Moreover, hESC colonies were able to continue growing from into larger formations after MEF removal, providing an additional level of hESC expansion.

Despite ongoing efforts to transition cultures to feeder-free conditions, the derivation and culture of human embryonic stem cells (hESC) remain largely dependent on co-cultures with mouse embryonic feeders (MEFs). Here, we show a novel methodology for rapidly removing feeders from hESC cultures prior to experimentation.

הסרת פיברובלסטים מהירה מתרבויות צפיפות גבוהות אדם תאי גזע עובריות

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

אברון תחבורה בתרבית<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאים: תא קו S2 ויסודי נוירונים.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle cells is of major relevance for all studies dedicated to exploring muscle glucose metabolism and characterizing metabolic alterations. In muscle cells, glucose transporter type 4 (GLUT4) proteins translocate to the plasma membrane in response to insulin, thus allowing massive entry of glucose into the cell. The ability of muscle cells to respond to insulin by increasing the rate of glucose uptake is one of the standard readouts to quantify muscle cell sensitivity to insulin. Human primary myotubes are a suitable in vitro model, as the cells maintain many features of the donor phenotype, including insulin sensitivity. This in vitro model is also suitable for the test of any compounds that could impact insulin responsiveness. Measurements of the glucose uptake rate in differentiated myotubes reflect insulin sensitivity.
In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes, and glucose uptake rates with and without insulin stimulation are measured. We provide a detailed protocol to quantify passive and active glucose transport rates using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose ([3H]2dG). Calculation methods are provided to quantify active basal and insulin-stimulated rates, as well as stimulation fold.

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes and glucose uptake rates are measured. We provide a detailed protocol to quantify rates in basal and insulin-stimulated states using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose.

גלוקוז ספיגה מדידה ותגובה גירוי אינסולין ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מיוטובים ראשוניים אדם מתורבת

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...