Die Autoren bedanken sich bei Dr. Rizaldy Scott am Mount Sinai Hospital in Toronto, Ontario danken für das Geschenk des primären Rac1 flox / flox embryonalen Maus-Fibroblasten. Diese Arbeit wurde durch Betriebskostenzuschüsse an NJ von der Canadian Institutes of Health Research (CIHR, MOP 2009-93526) und dem Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC, RG 327372-06) unterstützt. SH und MW werden von CGSMA und CGS-M Auszeichnungen von CIHR und NSERC bzw. unterstützt. Steve Hawley und Melanie Wills trugen gleichermaßen zu dieser Veröffentlichung.

Auftauen von Zellen <ol><li> Erhalten eingefroren embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) (zuvor aus einzelnen Embryos primären Kulturen generiert) von flüssigem Stickstoff. </li><li> Thaw Zellen durch Eintauchen Fläschchen in 37 ° C Wasser mit wirbelnden, bis Inhalt vollständig aufgetaut. </li><li> Add 9 mL DMEM mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin zu einer 10cm Zellkulturplatte ergänzt wurde. </li><li> Fügen Sie die aufgetaute Zellsuspension tropfenweise auf die Platte, Rock die Platte vorsichtig, um Zellen und Platzteller in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator über Nacht zu zerstreuen. Beachten Sie, dass, wenn die Zellen empfindlich auf DMSO (aus dem Einfrieren Prozess) sind erste Medien mit frischen Medien ersetzt werden kann, nachdem die Zellen an der Platte (ca. 4 Stunden post plating) haften geblieben sind. Beachten Sie auch, dass Zusammenfluss der Zellen nach dem Auftauen ist abhängig von der Anzahl der Zellen eingefroren, die Erholung der Zellen nach dem Einfrieren und die Wachstumsrate der Zellen. </li></ol> Passagierung Zellen <ol start="5"><li> Wenn die Zellen zu praktisch 100% Konfluenz (dh: am nächsten Tag) gewachsen, absaugen den Medien und waschen Sie die Zellen mit 5 ml sterilem PBS. </li><li> Entfernen PBS und 1ml von Trypsin mit 10 mM EDTA und Platzteller in Inkubator für ungefähr 5 Minuten, damit sich Zellen von der Platte zu lösen. </li><li> Wenn die Zellen abgelöst haben, fügen 9 mL der Medien auf die Trypsin-Zellen, Pipette 2-3 mal um Klumpen zu zerstreuen, 1ml dieser Suspension tropfenweise auf eine neue Platte mit 9 mL der Medien, und legen Sie diese in die 37 ° C Inkubator über Nacht . Die Anwesenheit von FBS in den Medien wird das Trypsin alternativ zu inaktivieren, können Zellen zuerst gewaschen werden, um zu verdünnen die Trypsin. </li></ol> Zählen und Beschichtung von Zellen auf Deckgläser <ol start="8"><li> Entfernen Zellen aus Inkubator, waschen und trypsinize wie vorher, nur dieses Mal add 5-6mL Medien zurück zu den trypsiniert Zellen anstelle von 9 mL. </li><li> Pipette Zellen gründlich, um eine vollständige Dissoziation in einer einzigen Zellsuspension zu gewährleisten, und entfernen Sie 15μL mit 15μL von Trypanblau in einem separaten Mikrozentrifugenröhrchen kombinieren. </li><li> Mix dieser Zelle / Trypanblau Suspension durch Auf-und Abpipettieren mehrmals, und fügen Sie 15μL der Zählkammer. </li><li> Unter dem Mikroskop wird abgestorbenen Zellen erscheinen blau. Zählt die Anzahl der klar / farblos (Wohn-) Zellen in einer der 4X4 Gitter auf der Zählkammer. Wiederholen Sie diesen zählen die drei anderen 4X4 Grids (bezeichnet A, B, C und D) und verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Anzahl der Zellen pro Mikroliter Suspension zu berechnen: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq0.jpg" alt="Gleichung 1" /></li><li> Durch Protokoll-Optimierung, haben wir festgestellt, dass plating 30.000 Zellen Ergebnisse in geeigneter Zelldichte für die Visualisierung am Ende des Experiments. </li><li> Zur Berechnung des Volumens der Zellsuspension für 30.000 Zellen benötigt, verwenden Sie die folgende Gleichung: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq1.jpg" alt="Gleichung 2" /></li><li> Legen Sie nun ein steriles Deckglas in jedes Well einer sechs gut Schüssel und fügen 2 ml Medium in jede Vertiefung, und dann tropfenweise aus Ihrer Zellsuspension das Volumen für 30.000 Zellen benötigt in jedes Well. Beachten Sie, dass Glasdeckgläschen für dieses Experiment verwendet werden, wie wir die Visualisierung werden die Zellen mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie zu einem späteren Zeitpunkt, da nicht alle Anwendungen werden notwendigerweise Mikroskopie und decken somit rutscht nicht erforderlich sein. </li></ol> Virus Transduction <ol start="15"><li> Nach mehreren Stunden oder über Nacht (genügend Zeit, um sicherzustellen, dass die Zellen auf die Deckgläschen haften), zu entfernen Medien und waschen Sie die Zellen mit 1 ml serumfreiem DMEM. </li><li> 1ml von serum-freien Medien in jede Vertiefung für die Zugabe des Virus. Für dieses Experiment wurde Adeno-Cre-Virus kommerziell von Vector Biolabs erhalten. </li><li> Vorherige Protokoll-Optimierung hat gezeigt, dass eine Vielzahl der Infektion (MOI) von 500 hocheffiziente Gen-Transduktion bietet in primäre MEFs mit wenig oder keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen. MOI kann wie folgt berechnet werden: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq2.jpg" alt="Gleichung 3" /> <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq3.jpg" alt="Gleichung 4" /></li><li> Fügen Sie das berechnete Volumen der Virus direkt in jede Vertiefung, die infiziert ist, schaukeln die Platte, um das Virus und Ort Zellen in die 37 ° C Inkubator über Nacht zu zerstreuen. </li><li> Am nächsten Morgen, entfernen Sie den Virus-haltigen Medien aus den Zellen und waschen Sie die Zellen in 1ml steriles PBS und fügen Sie dann 2 ml regulären Medien in jede Vertiefung. </li><li> Im Falle der Rac1-Zellen in diesem Experiment veranschaulicht, trat morphologischen Veränderungen in den Zellen bei etwa 72 Stunden nach der Transduktion. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Die Zellen wurden visualisierend durch Färbung mit dem Aktin-Farbstoff Phalloidin (für die Bildgebung dient nur) und abgebildet mit dem Leica TCS SP5-Multiphotonen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop an der Advanced Analysis Centre an der University of Guelph. Abbildung 1 zeigt die kontrahierte und längliche Morphologie der Rac1 flox / flox Zellen, Adeno-Cre-Virus im Vergleich zu den gleichen Zellen nicht zu Virus ausgesetzt wurden ausgesetzt. <img src="/files/ftp_upload/2160/2160fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Vergleich zwischen Rac1 flox / flox Zellen mit Adeno-Cre-Virus (links) im Vergleich zu nicht infizierten Zellen aus der gleichen Quelle (rechts) infiziert.

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	<li>Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Deletion+of+Rac1+GTPase+Reveals+Its+Critical+Role+in+Actin+Stress+Fiber+Formation+and+Focal+Adhesion+Complex+Assembly.">Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly.</a> J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).</li><li>Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. o. w. n. e. y., Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+deletion+in+mouse+neutrophils+has+selective+effects+on+neutrophil+functions.">Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions.</a> J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).</li><li>Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+Cre+deletion+of+floxed+sequences+in+primary+mouse+cells+is+an+efficient+alternative+for+studies+of+gene+deletion.">Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion.</a> Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).</li><li>Rijnkels, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Cre-mediated+recombination+in+mammary+epithelial+early+progenitor+cells.">Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).</li><li>Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1-null+mouse+embryonic+fibroblasts+are+motile+and+respond+to+platelet-derived+growth+factor.">Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).</li><li>Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+gene+recombination+by+adenovirus-driven+Cre+in+the+mouse+uterus.">Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus.</a> Genesis. 44, 51-56 (2006).</li></ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die Canadian Council on Animal Care Set durchgeführt.

Das dazugehörige Video zeigt, wie ein rekombinantes Virus verbrauchsteuerpflichtige ein bestimmtes Gen in vitro mit Cre-Rekombinase verwendet werden kann. Die Entwicklung dieses Protokoll jedoch hat offenbaren einige spezielle Punkte wert Adressierung. <ul><li> Proper Sicherheitsvorkehrungen sollten immer dann eingesetzt, wenn mit Adenoviren werden. Ein Laborkittel und Handschuhe sollten immer getragen werden, während der Arbeit mit dem Virus. Medien und Plastmetall sollte mit 10% Bleichmittel für mindestens 30 Minuten behandelt werden, und Plastmetall sollte danach autoklaviert werden. </li><li> Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen des Virus Lager, da dies Virustiter beeinflussen und reduzieren somit Transduktionseffizienz. Kleine Mengen des Virus Lager sollten zunächst in separaten Röhren aliquotiert werden. </li><li> MOIs reichen von 5 bis 50 wurden während der Methodenentwicklung getestet und effiziente Transduktion Raten wurden in den meisten Fällen beobachtet, ohne negative Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen. </li><li> Adeno-GFP wurde auch während der Methodenentwicklung zur schnellen Bildschirm Transduktion Effizienz. Diese Steuerung (oder einen leeren Vektor) sollte während des Experiments, dass virale Infektion allein sicher durchgeführt werden nicht in zellulären Veränderungen führen. Auch wenn Auslösen der floxed Gen von Interesse in Ihren Zellen in keiner zellulären Veränderungen (dh Veränderungen in Morphologie oder Lebensfähigkeit) Ergebnis, dann infizieren den gleichen Zelltyp mit Adeno-GFP ist ein wichtiges Steuerelement zu verwenden, um nachzuweisen, dass Viren Transduktion ist auftreten. </li></ul> Über die Untersuchung von Signalkaskaden in Kultur, hat das Adeno-Cre-Ansatz auch in vivo eingesetzt worden, um unter bestimmten Bedingungen zu entfernen Gene von Versuchstieren 3,4 und auf bestimmte Populationen von Zellen innerhalb eines Organismus 6 Beschriften. Das Adenovirus-System kann auch angepasst an anderer Gene als Cre-Rekombinase in Wirtszellen einzuführen. Zwei wesentliche Vorteile bei der Verwendung dieser Lieferung Vektors sind seine hohe Transduktion und Gentransfer Effizienz und mangelnde Integration mit Wirts-DNA. Allerdings kann die Generierung von neuen rekombinanten Adenoviren werden arbeitsintensiv. Die hier beschriebene Protokoll daher nutzt die Kraft des adenoviralen Systems durch die Nutzung der bisher entwickelten Adeno-Cre-Virus und Kupplung, die mit unseren floxed Allel von Interesse, Rac1. Durch diese bedingte knock out Experiment haben wir bestätigt, dass Transduktion mit dem Adeno-Cre Virus MEFs Tragen einer floxed Rac1-Allels in der Tat dazu führen Exzision Rac1 führt zu Veränderungen in der Zellmorphologie charakteristisch für Rac1-defizienten Zellen 2,5.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ad-CMV-Cre virus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Biolabs</td>
<td>1045</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DME High glucose media 500mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SH3002201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS Canadian origin 500mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>CAA15-701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEN-STREP 1X solution 100mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SV30010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Texas Red-X phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T7471</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4549</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts

Die Fähigkeit, genetisch bestimmte Komponenten entfernen von verschiedenen Zell-Signalkaskaden verfügt über ein integriertes Werkzeug in modernen Signaltransduktion Analyse. Eine besondere Methode, um diese bedingte Löschung zu erreichen, ist über die Verwendung des Cre-loxP-System. Dieses Verfahren beinhaltet flankierende das Gen von Interesse mit loxP-Stellen, die spezifischen Erkennungssequenzen für die Cre-Rekombinase-Protein. Die Exposition der sogenannten floxed (flankiert von loxP site) DNA, dieses Enzym zu einer Cre-vermittelte Rekombination Veranstaltung in der loxP-Stellen und die anschließende Entfernung der dazwischenliegenden Gen 3. Mehrere verschiedene Methoden existieren, um die Rekombinase Cre auf der Website von Interesse zu verwalten. In diesem Video zeigen wir die Verwendung eines Adenovirus mit der Cre-Rekombinase-Gen zur primären embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) von Embryonen mit einem floxed Rac1 Allel 1 erhalten zu infizieren. Unsere Gründe für die Auswahl Rac1 MEFs für unsere Experimente, dass eine klare morphologische Veränderungen können auf Streichung von Rac1, aufgrund von Änderungen in der Aktin-Zytoskelett 2,5 gesehen werden. 72 Stunden nach der viralen Transduktion und Cre Expression wurden die Zellen gefärbt mit dem Aktin-Farbstoff Phalloidin und abgebildet mit Hilfe der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie. Es wurde beobachtet, dass MEFs, die dem Adeno-Cre-Virus ausgesetzt waren erschienen unter Vertrag und verlängerte in der Morphologie im Vergleich zu nicht infizierten Zellen, im Einklang mit früheren Berichten 2,5. Das Adenovirus Methode der Rekombinase Cre Lieferung ist vorteilhaft, da die Adeno-Cre-Virus ist leicht zugänglich und Gendeletion via Cre in nahezu 100% der Zellen kann mit optimierter adenoviralen Infektion erzielt werden.

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Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

In diesem Video verwenden wir ein Adenovirus Durchführung der Cre-Rekombinase-Gen zur primären embryonalen Maus-Fibroblasten Tragen einer floxed Rac1 Allel zu infizieren.

Adenovirus-vermittelte genetische Entfernung von Signalmolekülen in kultivierten primären embryonalen Maus-Fibroblasten

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

adenovirus-mediated-genetic-removal-signaling-molecules-cultured

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