Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Scott Rizaldy no Hospital Monte Sinai em Toronto, Ontário, pelo seu dom da principal Rac1 flox / flox fibroblastos embrionárias de camundongos. Este trabalho foi financiado por subvenções de funcionamento a NJ do Canadian Institutes of Health Research (CIHR, MOP 2009-93526) e de Ciência Natural e Pesquisa de Engenharia Council of Canada (NSERC, RG 327372-06). SH e MW são suportados pelo CGSMA e CGS M-prêmios de CIHR e NSERC, respectivamente. Wills Steve Hawley e Melanie contribuíram igualmente para este papel.

Células descongelamento <ol><li> Obtenção de fibroblastos de rato congelado embrionárias (MEFs) (gerado anteriormente a partir de culturas primárias individuais de embriões) de nitrogênio líquido. </li><li> Células descongelar por imersão frasco em 37 ° C de água com movimentos circulares até conteúdo esteja completamente descongelado. </li><li> Adicionar 9ml de DMEM que foi suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina a uma placa de cultura de células 10 centímetros. </li><li> Adicione a suspensão de células descongeladas gota a gota, à placa, rock a placa suavemente para dispersar as células e colocar a placa em 37 ° CO C, 5% 2 incubadora durante a noite. Note-se que se as células são sensíveis à DMSO (a partir do processo de congelamento), meios de comunicação inicial pode ser substituído com a mídia fresco depois que as células tenham aderido à placa (aproximadamente quatro horas após a plating). Observe também que confluência das células após o descongelamento depende do número de células congeladas, a taxa de recuperação das células após o congelamento, ea taxa de crescimento das células. </li></ol> Células Passaging <ol start="5"><li> Quando as células têm crescido a confluência essencialmente 100% (ou seja: no dia seguinte), aspirar a mídia off e lavar as células com 5mL de PBS estéril. </li><li> Remover PBS e adicionar 1 ml de tripsina contendo 10mM EDTA e colocar a placa na incubadora por aproximadamente 5 minutos para permitir que as células de separar da placa. </li><li> Quando as células têm destacado, adicione 9ml de mídia para as células tripsinizados, pipeta 2-3 vezes para dispersar aglomerações, adicione 1 mL desta suspensão gota a gota, em um prato novo contendo 9ml de mídia, e colocar isso para a 37 ° C durante a noite incubadora . A presença de FBS na mídia vai inativar a tripsina, alternativamente, as células podem ser lavadas primeiro a diluir a tripsina. </li></ol> Contagem e cultivo de células em lamínulas <ol start="8"><li> Remover as células da incubadora, lavar e trypsinize como antes, só que desta vez adicionar 5-6ml de volta para o tripsinizados células em vez de 9ml. </li><li> Células pipeta cuidadosamente para garantir total dissociação em uma suspensão de células individuais, e remover 15μL para combinar com 15μL de azul de tripano em um tubo de microcentrífuga separado. </li><li> Misturar esta suspensão celular / azul de tripano pipetando cima e para baixo várias vezes, e adicionar 15μL para o hemocitômetro. </li><li> Sob o microscópio, as células mortas aparecerá azul. Contar o número de células claras / incolor (vivendo) em uma das grades 4X4 sobre o hemocitômetro. Repita este contar com as três outras grades 4X4 (A denotado, B, C e D) e use a seguinte equação para calcular o número de células por mL de suspensão: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq0.jpg" alt="Equação 1" /></li><li> Através da otimização de protocolo, nós determinamos que chapeamento de 30.000 células resulta na densidade de células adequadas para visualização na conclusão do experimento. </li><li> Para calcular o volume de suspensão de células necessárias para 30.000 células, use a seguinte equação: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq1.jpg" alt="Equação 2" /></li><li> Agora coloque uma lamínula estéril de vidro em cada poço de uma placa de seis bem e adicione 2 ml de mídia para cada poço, e depois adicionar gota a gota, a partir de sua suspensão celular o volume necessário para 30.000 células em cada poço. Note-se que lamínulas de vidro são usados ​​para este experimento, já que estaremos visualizando as células usando microscopia de fluorescência em um ponto mais tarde, nem todos os aplicativos serão necessariamente microscopia, e, assim, cobrir deslizes não podem ser exigidos. </li></ol> Transdução de vírus <ol start="15"><li> Depois de várias horas ou durante a noite (tempo suficiente para assegurar que as células aderem à lamínulas), remova a mídia e lavar as células com 1 ml de soro livre de DMEM. </li><li> Adicione 1 ml de soro livre de media a cada poço para a adição do vírus. Para este experimento, vírus adeno-Cre foi obtido comercialmente a partir de Biolabs Vector. </li><li> Otimização de protocolo anterior mostrou que uma multiplicidade de infecção (MOI) de 500 fornece transdução de genes altamente eficiente em MEFs primária com pouco ou nenhum efeito na viabilidade celular. MOI pode ser calculado como segue: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq2.jpg" alt="Equação 3" /> <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq3.jpg" alt="Equação 4" /></li><li> Adicionar o volume calculado de vírus diretamente a cada poço que está a ser infectado, agite levemente o prato para dispersar as células de vírus e colocar na incubadora a 37 ° C durante a noite. </li><li> Na manhã seguinte, remova o vírus contendo mídia a partir de células e lavar as células em 1mL de PBS estéril e em seguida, adicione 2 mL de meios regulares a cada poço. </li><li> No caso do Rac1 células exemplificado neste experimento, ocorreram alterações morfológicas nas células em aproximadamente 72 horas de transdução de post. </li></ol> Resultados representante Células foram visualized através da coloração com o corante de actina phalloidin (para fins de imagem apenas) e fotografada usando a Leica TCS-SP5 multifotônica microscópio laser confocal no Centro de Análise Avançada da Universidade de Guelph. A Figura 1 mostra a morfologia contratados e alongado do Rac1 flox / flox células que foram expostos ao vírus adeno-Cre em comparação com as mesmas células não expostas ao vírus. <img src="/files/ftp_upload/2160/2160fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Comparação entre Rac1 flox / flox células infectadas com o vírus adeno-Cre (esquerda) em comparação com células não infectadas pela mesma fonte (direita).

<ol>
	<li>Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Deletion+of+Rac1+GTPase+Reveals+Its+Critical+Role+in+Actin+Stress+Fiber+Formation+and+Focal+Adhesion+Complex+Assembly.">Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly.</a> J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).</li><li>Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. o. w. n. e. y., Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+deletion+in+mouse+neutrophils+has+selective+effects+on+neutrophil+functions.">Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions.</a> J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).</li><li>Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+Cre+deletion+of+floxed+sequences+in+primary+mouse+cells+is+an+efficient+alternative+for+studies+of+gene+deletion.">Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion.</a> Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).</li><li>Rijnkels, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Cre-mediated+recombination+in+mammary+epithelial+early+progenitor+cells.">Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).</li><li>Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1-null+mouse+embryonic+fibroblasts+are+motile+and+respond+to+platelet-derived+growth+factor.">Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).</li><li>Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+gene+recombination+by+adenovirus-driven+Cre+in+the+mouse+uterus.">Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus.</a> Genesis. 44, 51-56 (2006).</li></ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Canadian Council on Animal Care.

O vídeo que acompanha exemplifica como um vírus recombinante pode ser usada para um gene especial de consumo específico in vitro utilizando Cre recombinase. O desenvolvimento deste protocolo no entanto revelou alguns pontos em particular no valor de endereçamento. <ul><li> Procedimentos de segurança deve sempre ser empregada quando se trabalha com adenovírus. Um jaleco e luvas devem ser usadas todo tempo enquanto trabalhava com o vírus. Mídia e utensílios de plástico devem ser tratadas com lixívia a 10% por pelo menos 30 minutos, e utensílios de plástico devem ser autoclavados depois. </li><li> Evite repetidos de congelamento e descongelamento do estoque de vírus como este podem afetar a título de vírus e, assim, reduzir a eficiência de transdução. Pequenos volumes de estoque de vírus deve inicialmente ser aliquotado em tubos separados. </li><li> MOIS variando 5-50 foram testados durante o desenvolvimento do método e as taxas de transdução eficiente foram observados na maioria dos casos, sem efeitos negativos sobre a viabilidade celular. </li><li> Adeno-GFP foi usado também durante o desenvolvimento do método para rapidamente a eficiência de transdução de tela. Este controle (ou um vetor vazio) deve ser realizada durante o experimento para assegurar que a infecção viral por si só não resulta em alterações celulares. Da mesma forma, se excisão do gene floxed de interesse em suas células não resultar em qualquer alteração celular (ou seja, alterações na morfologia ou viabilidade), então infectar o mesmo tipo de célula com adeno-GFP é um controle importante usar para demonstrar que a transdução de vírus é ocorrendo. </li></ul> Além do exame da cascata de sinalização na cultura, a abordagem adeno-Cre também tem sido empregada in vivo para condicionalmente remover genes de animais experimentais 3,4, e para rotular populações específicas de células dentro de um organismo 6. O sistema de adenovírus também pode ser adaptado para introduzir genes que não Cre recombinase em células hospedeiras. Duas principais vantagens do uso deste vetor de entrega são os seus transdução e eficiência de entrega de genes, e falta de integração com o DNA do hospedeiro. No entanto, a geração de novos adenovírus recombinante pode ser trabalhoso. O protocolo aqui descrito, portanto, utiliza a força do sistema adenoviral explorando o anteriormente desenvolvido vírus adeno-Cre, e acoplamento que com o nosso floxed alelo de interesse, Rac1. Através deste knock out condicional experimento, temos confirmado que transdução usando o vírus adeno-Cre de MEFs carregando um alelo Rac1 floxed realmente causar excisão de Rac1 levando à mudanças na morfologia celular característica de Rac1 deficiente células 2,5.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ad-CMV-Cre virus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Biolabs</td>
<td>1045</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DME High glucose media 500mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SH3002201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS Canadian origin 500mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>CAA15-701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEN-STREP 1X solution 100mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SV30010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Texas Red-X phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T7471</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4549</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts

A capacidade de remover componentes geneticamente específicos de diversas cascatas de sinalização celular tem sido uma ferramenta essencial na análise moderna de transdução de sinal. Um determinado método para alcançar essa supressão condicional é através da utilização do sistema Cre-loxP. Este método envolve flanqueiam o gene de interesse com sites loxP, que são sequências de reconhecimento específico para a proteína recombinase Cre. Exposição dos chamados floxed DNA (ladeada pelo site loxP) para este enzima resulta em um evento de recombinação Cre-mediada nos locais loxP, e excisão subseqüente do gene intervindo 3. Existem vários métodos diferentes para administrar Cre recombinase ao local de interesse. Neste vídeo, demonstramos a utilização de um adenovírus contendo o gene Cre recombinase para infectar fibroblastos de rato principal embrionárias (MEFs) obtidas de embriões que contém um alelo Rac1 floxed 1. Nossa justificativa para a seleção Rac1 MEFs para nossos experimentos é que claro alterações morfológicas podem ser vistos após a exclusão de Rac1, devido a alterações no citoesqueleto de actina 2,5. 72 horas após a transdução viral e expressão Cre, as células foram coradas com o corante phalloidin actina e fotografada por microscopia confocal de varredura a laser. Observou-se que MEFs que haviam sido expostos ao vírus adeno-Cre apareceu contratada e na morfologia alongada em comparação com células não infectadas, de acordo com relatórios anteriores 2,5. O método de adenovírus Cre entrega recombinase é vantajoso como o vírus adeno-Cre é facilmente disponível, e deleção do gene através de Cre em quase 100% das células pode ser alcançado com a infecção adenoviral otimizado.

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Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Neste vídeo, usamos um adenovírus carregando o gene Cre recombinase para infectar fibroblastos de rato principal embrionárias carregando um alelo Rac1 floxed.

Adenovírus mediada por remoção genética das moléculas de sinalização em fibroblastos de rato cultivadas Primária embrionárias

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

adenovirus-mediated-genetic-removal-signaling-molecules-cultured

Research

JoVE Journal

Biology

24.8K visualizações.  University of Guelph. Neste vídeo, usamos um adenovírus carregando o gene Cre recombinase para infectar fibroblastos de rato principal embrionárias carregando um alelo Rac1 floxed.