Les auteurs tiennent à remercier le Dr Scott Rizaldy au Mount Sinai Hospital à Toronto, en Ontario, pour son don de la première Rac1 flox / flox fibroblastes embryonnaires de souris. Ce travail a été soutenu par des subventions de fonctionnement à NJ par les Instituts canadiens de recherche en santé du Canada (IRSC, MOP 2009 à 93526) et les sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG, RG 327372-06). SH et MW sont pris en charge par CGSMA et CGS-M prix des IRSC et du CRSNG, respectivement. Steve Wills Hawley et Mélanie ont contribué également à ce document.

La décongélation des cellules <ol><li> Obtenir des fibroblastes de souris embryonnaires congelés (FAE) (généré précédemment à partir de cultures d&#39;embryons individuels primaire) de l&#39;azote liquide. </li><li> Décongelez les cellules en plongeant le flacon dans l&#39;eau 37 ° C en remuant jusqu&#39;à ce contenu est complètement dégelée. </li><li> Ajouter 9 ml de DMEM qui a été complété avec 10% de sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine à une plaque de culture cellulaire de 10cm. </li><li> Ajouter la suspension cellulaire décongelée goutte à goutte à la plaque, le rock doucement la plaque pour disperser les cellules et les placer dans une plaque de 37 ° C CO, 5% 2 incubateur de la nuit. Notez que si les cellules sont sensibles à DMSO (à partir du processus de congélation), les médias initiale peut être remplacé par du milieu frais après que les cellules ont adhéré à la plaque (environ quatre heures après plaquage). Notez également que la confluence des cellules après décongélation dépend du nombre de cellules congelées, le taux de récupération des cellules après congélation, et le taux de croissance des cellules. </li></ol> Le repiquage des cellules <ol start="5"><li> Lorsque les cellules se sont développées essentiellement à 100% de confluence (ie: le lendemain), aspirer hors des médias et laver les cellules avec 5 ml de PBS stérile. </li><li> Retirer du PBS et ajouter 1 ml de trypsine EDTA 10mM contenant et laisser reposer la plaque dans l&#39;incubateur pendant environ 5 minutes pour permettre aux cellules de se détacher de la plaque. </li><li> Lorsque les cellules se sont détachées, ajouter 9 ml de médias pour les cellules traitées à la trypsine, une pipette 2-3 fois pour disperser des bouquets, ajouter 1 ml de cette suspension goutte à goutte sur une nouvelle plaque contenant 9 ml de médias, et la place dans le présent 37 ° C durant la nuit incubateur . La présence de SVF dans les médias sera inactiver la trypsine variante, les cellules peuvent être d&#39;abord lavé à diluer la trypsine. </li></ol> Comptage et le placage des cellules sur des lamelles <ol start="8"><li> Retirer les cellules de l&#39;incubateur, les laver et trypsiniser comme avant, sauf que cette fois ajouter 5-6ml média retour aux cellules trypsinisées lieu de 9 ml. </li><li> Cellules pipette soigneusement pour assurer la dissociation complète en une suspension cellulaire unique, et retirer 15μL à combiner avec 15μL du bleu trypan dans un tube de micro séparé. </li><li> Mélanger cette suspension cellulaire / bleu trypan par pipetage de haut en bas plusieurs fois, et d&#39;ajouter 15μL à l&#39;hématimètre. </li><li> Sous le microscope, les cellules mortes apparaissent bleues. Comptez le nombre de cellules claires / incolore (vivant) dans l&#39;une des grilles 4X4 sur l&#39;hématimètre. Répéter cette compter sur les trois grilles 4X4 autres (notés A, B, C et D) et utiliser l&#39;équation suivante pour calculer le nombre de cellules par uL de suspension: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq0.jpg" alt="L&#39;équation 1" /></li><li> Grâce à l&#39;optimisation du protocole, nous avons déterminé que le placage 30000 résultats dans les cellules densité cellulaire appropriée pour la visualisation à l&#39;issue de l&#39;expérience. </li><li> Pour calculer le volume de suspension cellulaire nécessaire pour 30 000 cellules, utilisez l&#39;équation suivante: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq1.jpg" alt="Équation 2" /></li><li> Maintenant, placez un bordereau de verre stériles couvrent dans chaque puits d&#39;un plat et ajouter six 2mL des médias dans chaque puits, puis ajouter goutte à goutte à partir de votre suspension cellulaire le volume requis pour 30.000 cellules dans chaque puits. Notez que des lamelles de verre sont utilisés pour cette expérience que nous serons visualisant les cellules en utilisant la microscopie à fluorescence à un stade ultérieur; toutes les applications ne seront nécessairement microscopie, et donc de couvrir glisse peut-être pas nécessaire. </li></ol> Transduction Virus <ol start="15"><li> Après plusieurs heures ou toute la nuit (un temps suffisant pour s&#39;assurer que les cellules adhèrent au lamelles), retirez les médias et laver les cellules avec 1 ml de DMEM sans sérum. </li><li> Ajouter 1 ml de milieu sans sérum dans chaque puits pour l&#39;ajout du virus. Pour cette expérience, les virus adéno-Cre virus est obtenue commercialement à partir Biolabs Vector. </li><li> Optimisation des protocoles antérieurs ont montré que la multiplicité d&#39;infection (MOI) de 500 fournit transduction très efficace dans les primaires FAE avec peu ou aucun effet sur la viabilité cellulaire. MOI peut être calculée comme suit: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq2.jpg" alt="Équation 3" /> <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq3.jpg" alt="L&#39;équation 4" /></li><li> Ajouter le volume calculé du virus directement dans chaque puits qui est d&#39;être infectés, secouez légèrement la plaque pour disperser les cellules du virus et le placer dans l&#39;incubateur à 37 ° C pendant la nuit. </li><li> Le lendemain matin, enlever le virus milieux contenant des cellules et laver les cellules dans 1 ml de PBS stérile, puis ajouter 2 mL de médias régulièrement à chaque puits. </li><li> Dans le cas de l&#39;Rac1 cellules illustré dans cette expérience, les changements morphologiques survenus dans les cellules à environ 72 heures après la transduction. </li></ol> Les résultats représentatifs Les cellules ont été de visualiserD par coloration avec la phalloïdine actine colorant (à des fins d&#39;imagerie uniquement) et imagée en utilisant le Leica TCS-SP5 microscope confocal à balayage laser multiphotonique au Centre d&#39;analyse avancée à l&#39;Université de Guelph. La figure 1 montre la morphologie contracté et allongée de la Rac1 flox / flox cellules qui ont été exposés à l&#39;adénovirus Cre virus comparé aux mêmes cellules non exposées au virus. <img src="/files/ftp_upload/2160/2160fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Comparaison entre Rac1 flox / flox cellules infectées par le virus adéno-Cre (à gauche) par rapport aux cellules non infectées de la même source (à droite).

<ol>
	<li>Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Deletion+of+Rac1+GTPase+Reveals+Its+Critical+Role+in+Actin+Stress+Fiber+Formation+and+Focal+Adhesion+Complex+Assembly.">Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly.</a> J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).</li><li>Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. o. w. n. e. y., Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+deletion+in+mouse+neutrophils+has+selective+effects+on+neutrophil+functions.">Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions.</a> J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).</li><li>Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+Cre+deletion+of+floxed+sequences+in+primary+mouse+cells+is+an+efficient+alternative+for+studies+of+gene+deletion.">Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion.</a> Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).</li><li>Rijnkels, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Cre-mediated+recombination+in+mammary+epithelial+early+progenitor+cells.">Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).</li><li>Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1-null+mouse+embryonic+fibroblasts+are+motile+and+respond+to+platelet-derived+growth+factor.">Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).</li><li>Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+gene+recombination+by+adenovirus-driven+Cre+in+the+mouse+uterus.">Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus.</a> Genesis. 44, 51-56 (2006).</li></ol>

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le Conseil canadien de protection des animaux.

La vidéo d&#39;accompagnement illustre bien comment un virus recombinant peut être utilisé pour exciser un gène spécifique in vitro en utilisant la recombinase Cre. L&#39;élaboration de ce protocole n&#39;a toutefois révéler certains points particuliers vaut adressage. <ul><li> Procédures de sécurité adéquates doivent toujours être employée lorsque l&#39;on travaille avec des adénovirus. Une blouse et les gants doivent être portés en tout temps tout en travaillant avec le virus. Médias et articles en plastique doivent être traitées avec l&#39;eau de Javel à 10% pendant au moins 30 minutes, et les articles en plastique doivent être autoclavés après. </li><li> Évitez répétés de gel-dégel du stock de virus car cela peut affecter titre du virus et réduire ainsi l&#39;efficacité de transduction. De petites quantités de stock de virus doivent d&#39;abord être répartie dans des tubes séparés. </li><li> MOI allant de 50 à 500 ont été testés pendant le développement de méthodes et les taux de transduction efficaces ont été observées dans la plupart des cas, sans effets négatifs sur la viabilité cellulaire. </li><li> Adéno-GFP a également été utilisé pendant le développement de méthodes pour déceler rapidement les efficacités de transduction. Ce contrôle (ou un vecteur vide) devrait être effectuée durant l&#39;expérience pour assurer que l&#39;infection virale ne suffit pas à entraîner des changements cellulaires. De même, si l&#39;excision du gène d&#39;intérêt floxés dans vos cellules ne résulte pas en des modifications cellulaires (changements de morphologie ou de la viabilité), puis infecter le même type de cellule avec des adéno-GFP est un contrôle important de l&#39;utiliser pour démontrer que la transduction du virus est produisent. </li></ul> Au-delà de l&#39;examen des cascades de signalisation dans la culture, l&#39;approche adéno-CRE a également été employée in vivo pour éliminer les gènes conditionnellement à partir d&#39;animaux expérimentaux 3,4, et d&#39;étiqueter des populations spécifiques de cellules dans un organisme 6. Le système de l&#39;adénovirus peut également être adapté pour introduire des gènes autres que la recombinase Cre dans les cellules hôtes. Deux principaux avantages de l&#39;utilisation de ce vecteur de livraison sont de sa transduction et une efficacité élevées livraison de gènes, et le manque d&#39;intégration avec les ADN de l&#39;hôte. Cependant, la génération de nouveaux adénovirus recombinants peut être beaucoup de travail. Le protocole décrit ici harnais donc la puissance du système en exploitant les adénoviraux précédemment développé adéno-Cre virus, et le couplage que grâce à notre allèle floxés d&#39;intérêt, Rac1. Grâce à ce coup conditionnelle à expérimenter, nous avons confirmé que la transduction utilisant le virus adéno-Cre du MEF portant un allèle Rac1 floxés en effet provoquer l&#39;excision de Rac1 menant à des changements dans la morphologie caractéristique cellulaire de cellules déficientes Rac1 2,5.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ad-CMV-Cre virus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Biolabs</td>
<td>1045</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DME High glucose media 500mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SH3002201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS Canadian origin 500mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>CAA15-701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEN-STREP 1X solution 100mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SV30010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Texas Red-X phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T7471</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4549</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts

La capacité de supprimer des composants génétiquement spécifiques de diverses cascades de signalisation cellulaire a été un outil essentiel dans l&#39;analyse du signal de transduction moderne. Une méthode particulière pour réaliser cette suppression conditionnelle est via l&#39;utilisation du système Cre-loxP. Cette méthode consiste à flanquant le gène d&#39;intérêt avec des sites loxP, qui sont des séquences de reconnaissance spécifiques de la protéine recombinase Cre. L&#39;exposition de la soi-disant floxés (flanqué de sites loxP) l&#39;ADN de cette enzyme dans les résultats un événement de recombinaison Cre-médiation sur les sites loxP, et l&#39;excision subséquente du gène intervenant 3. Plusieurs méthodes différentes existent pour administrer la recombinase Cre sur le site d&#39;intérêt. Dans cette vidéo, nous démontrons l&#39;utilisation d&#39;un adénovirus contenant le gène de la recombinase Cre pour infecter les fibroblastes primaires de souris embryonnaires (MEF) obtenu à partir d&#39;embryons contenant un floxés Rac1 allèle 1. Notre raison d&#39;être de la sélection Rac1 FAE pour nos expériences est-ce clair des changements morphologiques peuvent être vus sur la suppression de Rac1, due à des altérations du cytosquelette d&#39;actine 2,5. 72 heures après la transduction virale et l&#39;expression de Cre, les cellules ont été colorées en utilisant l&#39;actine colorant phalloïdine et imagées par microscopie confocale à balayage laser. On a observé que FAE qui avaient été exposés au virus adéno-Cre apparu sous contrat et en morphologie allongée par rapport aux cellules non infectées, compatible avec les précédents rapports 2,5. La méthode de la recombinase Cre adénovirus de livraison est avantageux que le virus adéno-Cre est facilement disponible, et une délétion du gène via Cre dans près de 100% des cellules peut être réalisé avec une infection adénovirale optimisé.

Watch this Scientific Journal Video about Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts at JoVE.com

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Dans cette vidéo, nous utilisons un adénovirus porteur du gène de la recombinase Cre pour infecter les fibroblastes de souris embryonnaires primaires portant un allèle floxés Rac1.

Adénovirus suppression génétique des molécules de signalisation dans les cultures de fibroblastes de souris embryonnaires primaires

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

adenovirus-mediated-genetic-removal-signaling-molecules-cultured

Research

JoVE Journal

Biology

24.7K vues.  University of Guelph. Dans cette vidéo, nous utilisons un adénovirus porteur du gène de la recombinase Cre pour infecter les fibroblastes de souris embryonnaires primaires portant un allèle floxés Rac1.